Выделение проксимальных жидкостей для исследования микроокружения опухоли аденокарциномы поджелудочной железы

Summary

Панкреатический сок является ценным источником биомаркеров рака поджелудочной железы человека. Здесь описан метод интраоперационной процедуры сбора. Чтобы преодолеть проблему принятия этой процедуры в мышиных моделях, мы предлагаем альтернативный образец, опухолевую интерстициальную жидкость, и описываем здесь два протокола для ее выделения.

Abstract

Аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) является четвертой по значимости причиной смерти, связанной с раком, и вскоре станет второй. Существует острая потребность в переменных, связанных со специфическими патологиями поджелудочной железы, чтобы помочь предоперационной дифференциальной диагностике и профилированию пациентов. Панкреатический сок представляет собой относительно неисследованную жидкость организма, которая благодаря своей непосредственной близости к месту опухоли отражает изменения в окружающих тканях. Здесь мы подробно опишем процедуру интраоперационного сбора. К сожалению, перевод сбора панкреатического сока на мышиные модели PDAC для выполнения механистических исследований технически очень сложен. Опухолевая интерстициальная жидкость (TIF) представляет собой внеклеточную жидкость, находящуюся вне крови и плазмы, которая омывает опухолевые и стромальные клетки. Подобно соку поджелудочной железы, из-за его свойства собирать и концентрировать молекулы, которые находятся разбавленными в плазме, TIF может использоваться в качестве индикатора микроокружающих изменений и в качестве ценного источника биомаркеров, связанных с заболеванием. Поскольку TIF не является легкодоступным, были предложены различные методы его изоляции. Здесь мы опишем два простых и технически нетребовательных метода его выделения: тканевое центрифугирование и тканевое элюирование.

Introduction

Аденокарцинома протоков поджелудочной железы (PDAC) является одной из самых агрессивных опухолей, и вскоре станет второй по значимости причиной смерти ^1,2,3. Он хорошо известен своей иммуносупрессивной микросредой и своей неспособностью реагировать на протоколы иммунотерапии⁴. В настоящее время хирургическая резекция по-прежнему является единственным лечебным вариантом для PDAC, но существует высокая частота ранних рецидивов и послеоперационных осложнений. Отсутствие специфических симптомов до запущенной стадии не позволяет провести раннюю диагностику, способствуя срокам заболевания. Кроме того, перекрытие симптомов между PDAC и другими доброкачественными патологиями поджелудочной железы может препятствовать достижению быстрой и надежной диагностики с текущими диагностическими стратегиями. Идентификация переменных, связанных с конкретными патологиями поджелудочной железы, может облегчить процесс принятия хирургических решений и улучшить профилирование пациентов.

Многообещающие результаты в открытии биомаркеров были достигнуты с использованием легкодоступных жидкостей организма, таких как кровь ^5,6,7, моча⁸, слюна⁹ и панкреатический сок 10,11,12. Во многих исследованиях использовались комплексные «омические» подходы, такие как геномные, протеомные и метаболомные методы, для идентификации молекул-кандидатов или сигнатур, которые могут различать PDAC и другие доброкачественные заболевания поджелудочной железы. Недавно мы продемонстрировали, что панкреатический сок, относительно неисследованная жидкость организма, может быть использован для идентификации метаболических сигнатур пациентов с различными клиническими профилями¹². Панкреатический сок представляет собой богатую белком жидкость, которая накапливает секретом клеток протоков поджелудочной железы и поступает в главный проток поджелудочной железы, а затем в основной общий желчный проток. Из-за своей близости к поджелудочной железе на него могут сильно влиять микроокружательные возмущения, индуцированные опухолевой массой (рисунок 1), и, следовательно, более информативные, чем кровь или моча, или профилирование на основе тканей. В нескольких исследованиях изучался потенциал панкреатического сока для выявления новых биомаркеров заболевания с использованием различных подходов, включая цитологический анализ¹³, протеомный анализ, выполненный масс-спектрометрией ^14,15, оценку генетических и эпигенетических маркеров, таких как мутации K-ras и p53 ^16,17, изменения в метилировании ДНК¹⁸ и миРНК ¹⁹ . Технически панкреатический сок может быть собран интраоперационно или с помощью минимально инвазивных процедур, таких как эндоскопическое ультразвуковое исследование, ретроградная холангио-панкреатография или эндоскопический сбор секреции дуоденального сока²⁰. Пока не ясно, в какой степени на состав панкреатического сока влияет используемая методика сбора. Мы описываем здесь процедуру интраоперационного сбора и показываем, что панкреатический сок может представлять собой ценный источник биомаркеров PDAC.

Рисунок 1: Схематическое изображение сбора сока поджелудочной железы. (А) Схематическое изображение, изображающее секрецию панкреатического сока в проток поджелудочной железы и его сбор во время операции. Вставка показывает крупный план микроокружения опухоли: панкреатический сок собирает молекулы, высвобождаемые опухолевыми и стромальными клетками в протоках поджелудочной железы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Коллекция панкреатического сока в генетических и ортотопических мышиных моделях PDAC была бы оценена в перспективе использования этой биожидкости в доклинических механистических исследованиях; однако эта процедура может быть технически очень сложной и неосуществимой для более простых моделей, таких как подкожные опухоли. По этой причине мы идентифицировали опухолевую интерстициальную жидкость (TIF) в качестве альтернативного источника панкреатического сока, поскольку она сходная характеристика действует как индикатор окружающих возмущений. Интерстициальная жидкость (ИФ) представляет собой внеклеточную жидкость, обнаруженную вне кровеносных и лимфатических сосудов, которая омывает клетки^{ткани 21}. На состав ПЧ влияет как кровообращение в органе, так и местная секреция; фактически, окружающие клетки активно продуцируют и секретируют белки в IF²¹. Интерстиций отражает микроокружательные изменения окружающих тканей и, следовательно, может представлять собой ценный источник для обнаружения биомаркеров в нескольких патологических контекстах, таких как опухоли. Высокая концентрация локально секретируемых белков в TIF может быть использована для идентификации молекул-кандидатов для тестирования в качестве прогностических или диагностических биомаркеров в ^плазме 22,23,24. Несколько исследований доказали, что TIF является подходящим образцом для высокопроизводительных протеомных подходов, таких как методы масс-спектрометрии^23,24,25, а также мультиплексные подходы ИФА²⁶ и профилирование микроРНК²⁷.

Было предложено несколько подходов к выделению МФ в опухолях, которые можно в широком смысле классифицировать как in vivo (капиллярная ультрафильтрация 28,29,30,31 и микродиализ 32,33,34,35) и методы ex vivo (тканевая центрифугирование 22,36,37,38 и тканевое элюирование 39,40,41,42). Эти методы были подробно рассмотрены^43,44. При выборе соответствующего метода следует учитывать такие вопросы, как последующий анализ и применение, а также восстановленный объем. Недавно мы использовали этот подход в качестве доказательства принципа для демонстрации различной метаболической активности опухолей из двух клеточных линий аденокарциномы мышей поджелудочной железы¹². Основываясь на литературе^24,38, мы решили использовать метод центрифугирования с низкой скоростью, чтобы избежать разрушения и разбавления клеток от внутриклеточного содержимого. Как количество глюкозы, так и лактата в TIF отражало различные гликолитические характеристики двух разных клеточных линий. Здесь мы подробно опишем протокол для двух наиболее часто используемых методов выделения TIF: тканевого центрифугирования и тканевого элюирования (рисунок 2).

Рисунок 2: Схематическое изображение методов выделения опухолевой интерстициальной жидкости. Схематическая иллюстрация методов, подробно описанных в протоколе, а именно центрифугирования тканей (А) и тканевого элюирования (В). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Protocol

У всех зарегистрированных пациентов периферическая кровь и панкреатический сок были собраны во время операции в соответствии с протоколами, утвержденными Этическим комитетом Учреждения. Все пациенты были включены в исследование после подписания информированного согласия, включая с…

Representative Results

Мы следовали описанной выше процедуре для получения панкреатического сока от пациентов с PDAC (n = 31) и другими доброкачественными заболеваниями поджелудочной железы (non-PDAC, n = 9), включая панкреатит (n = 2), папиллярно-ампульные опухоли (n = 4), нейроэндокринные опухоли (n = 2), внутрипродукционную …

Discussion

В этом исследовании мы описали технику интраоперационного сбора сока поджелудочной железы, в значительной степени неисследованную жидкую биопсию. Недавно мы показали, что панкреатический сок может быть использован в качестве источника метаболических маркеров заболевания^12…

Materials

1 mL syringe	BD Biosciences	309659
1.5 mL Eppendorf tube	Greiner BioOne	GR616201
20 µm nylon cell strainer	pluriSelect	43-50020-03
25G needle	BD Biosciences	305122
3 mL K2EDTA vacutainer	BD Biosciences	366473
3 mL syringe	BD Biosciences	309656
50 mL Falcon tube	Corning	352098
Clamps	Medicon	06.20.12
Disposable scalpel	Medicom	9000-10
Fetal bovine serum	Microtech	MG10432
Flat-tipped forceps	Medicon	06.00.10
Penicillin-Streptomycin	Lonza	ECB3001D
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Protease inhibitor cocktail	Roche	34044100
RPMI medium	Euroclone	ECB9006L
Scissors	Medicon	02.04.09
Trypsin/EDTA 1x	Lonza	BE17-161F
Ultraglutamine 100x	Lonza	BE17-605E/U1