Isolamento di fluidi prossimali per studiare il microambiente tumorale dell'adenocarcinoma pancreatico
Summary
Il succo pancreatico è una preziosa fonte di biomarcatori per il cancro del pancreas umano. Descriviamo qui un metodo per la procedura di raccolta intraoperatoria. Per superare la sfida di adottare questa procedura in modelli murini, suggeriamo un campione alternativo, il liquido interstiziale tumorale, e descriviamo qui due protocolli per il suo isolamento.
Abstract
L’adenocarcinoma pancreatico (PDAC) è la quarta causa di morte correlata al cancro e presto diventerà la seconda. Vi è un urgente bisogno di variabili associate a specifiche patologie pancreatiche per aiutare la diagnosi differenziale preoperatoria e la profilazione del paziente. Il succo pancreatico è un fluido corporeo relativamente inesplorato che, a causa della sua vicinanza al sito tumorale, riflette i cambiamenti nel tessuto circostante. Qui descriviamo in dettaglio la procedura di raccolta intraoperatoria. Sfortunatamente, tradurre la raccolta di succo pancreatico in modelli murini di PDAC, per eseguire studi meccanicistici, è tecnicamente molto impegnativo. Il liquido interstiziale tumorale (TIF) è il fluido extracellulare, al di fuori del sangue e del plasma, che bagna le cellule tumorali e stromali. Analogamente al succo pancreatico, per la sua proprietà di raccogliere e concentrare le molecole che si trovano diluite nel plasma, la TIF può essere sfruttata come indicatore di alterazioni microambientali e come preziosa fonte di biomarcatori associati alla malattia. Poiché la TIF non è facilmente accessibile, sono state proposte varie tecniche per il suo isolamento. Descriviamo qui due metodi semplici e tecnicamente poco impegnativi per il suo isolamento: la centrifugazione tissutale e l’eluizione tissutale.
Introduction
L’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è uno dei tumori più aggressivi e presto diventerà la seconda causa di morte 1,2,3. È noto per il suo microambiente immunosoppressivo e per la sua scarsa risposta ai protocolli di immunoterapia4. Attualmente, la resezione chirurgica è ancora l’unica opzione curativa per il PDAC, ma c’è un’alta frequenza di recidive precoci e complicanze postchirurgiche. La mancanza di sintomi specifici fino a uno stadio avanzato non consente una diagnosi precoce, contribuendo alla scadenza della malattia. Inoltre, la sovrapposizione dei sintomi tra PDAC e altre patologie pancreatiche benigne può ostacolare il raggiungimento di una diagnosi tempestiva e affidabile con le attuali strategie diagnostiche. L’identificazione di variabili associate a specifiche patologie pancreatiche potrebbe facilitare il processo decisionale chirurgico e migliorare la profilazione del paziente.
Risultati promettenti nella scoperta di biomarcatori sono stati raggiunti utilizzando fluidi corporei facilmente accessibili, come sangue 5,6,7, urina8, saliva 9 e succo pancreatico10,11,12. Molti studi hanno sfruttato approcci “omici” completi, come tecniche genomiche, proteomiche e metabolomiche, per identificare molecole candidate o firme che potrebbero discriminare tra PDAC e altre afflizioni pancreatiche benigne. Abbiamo recentemente dimostrato che il succo pancreatico, un fluido corporeo relativamente inesplorato, può essere utilizzato per identificare le firme metaboliche di pazienti con profili clinici distinti12. Il succo pancreatico è un fluido ricco di proteine, che accumula il secretoma delle cellule duttali pancreatiche e scorre verso il dotto pancreatico principale e quindi verso il principale dotto biliare comune. A causa della sua vicinanza al pancreas, potrebbe essere fortemente influenzato dalle perturbazioni microambientali indotte dalla massa tumorale (Figura 1), e quindi più informativo del sangue o delle urine o della profilazione basata sui tessuti. Diversi studi hanno esplorato il potenziale del succo pancreatico per identificare nuovi biomarcatori di malattia utilizzando vari approcci, tra cui l’analisi citologica 13, l’analisi proteomica eseguita mediante spettrometria di massa 14,15, la valutazione di marcatori genetici ed epigenetici come K-ras e mutazioni p53 16,17, alterazioni nella metilazione del DNA 18 e miRNA 19 . Tecnicamente, il succo pancreatico può essere raccolto intraoperatoriamente o con procedure minimamente invasive, come l’ecografia endoscopica, la colangio-pancreatografia retrograda o mediante raccolta endoscopica della secrezione di succo duodenale20. Non è ancora chiaro in che misura la composizione del succo pancreatico sia influenzata dalla tecnica di raccolta utilizzata. Descriviamo qui la procedura di raccolta intraoperatoria e mostriamo che il succo pancreatico può rappresentare una fonte preziosa per i biomarcatori PDAC.
Figura 1: Rappresentazione schematica della raccolta del succo pancreatico. (A) Rappresentazione schematica raffigurante la secrezione di succo pancreatico nel dotto pancreatico e la sua raccolta durante l’intervento chirurgico. L’inserto mostra un primo piano del microambiente tumorale: il succo pancreatico raccoglie le molecole rilasciate dalle cellule tumorali e stromali nei dotti pancreatici. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
La raccolta di succo pancreatico in modelli murini genetici e ortotopici di PDAC sarebbe apprezzata nella prospettiva di sfruttare questo biofluido in studi meccanicistici preclinici; Tuttavia, questa procedura può essere tecnicamente molto impegnativa e non è fattibile per modelli più semplici come i tumori sottocutanei. Per questo motivo, abbiamo identificato il liquido interstiziale tumorale (TIF) come fonte alternativa al succo pancreatico, per la sua caratteristica simile di agire come indicatore delle perturbazioni circostanti. Il liquido interstiziale (IF) è il liquido extracellulare, che si trova al di fuori del sangue e dei vasi linfatici, che bagna le cellule dei tessuti21. La composizione di IF è influenzata sia dalla circolazione sanguigna all’organo che dalla secrezione locale; infatti, le cellule circostanti producono e secernono attivamente proteine nell’IF21. L’interstizio riflette i cambiamenti microambientali dei tessuti circostanti e potrebbe quindi rappresentare una preziosa fonte per la scoperta di biomarcatori in diversi contesti patologici, come i tumori. L’alta concentrazione di proteine localmente secrete in TIF può essere utilizzata per identificare molecole candidate da testare come biomarcatori prognostici o diagnostici nel plasma22,23,24. Diversi studi hanno dimostrato che TIF è un campione adatto per approcci proteomici ad alto rendimento, come le tecniche di spettrometria di massa 23,24,25, così come gli approcci ELISA multiplex 26 e il profilo dei microRNA 27.
Sono stati proposti diversi approcci per l’isolamento dell’IF nei tumori, che possono essere ampiamente classificati come metodi in vivo (ultrafiltrazione capillare 28,29,30,31 e microdialisi 32,33,34,35) ed ex vivo (centrifugazione tissutale 22,36,37,38 e eluizione tissutale 39,40,41,42). Queste tecniche sono state esaminate in dettaglio 43,44. La scelta del metodo appropriato dovrebbe tenere conto di aspetti quali le analisi e le applicazioni a valle e il volume recuperato. Recentemente abbiamo usato questo approccio come prova di principio per dimostrare la diversa attività metabolica dei tumori da due linee cellulari di adenocarcinoma pancreatico murino12. Sulla base della letteratura24,38, abbiamo scelto di utilizzare il metodo di centrifugazione a bassa velocità per evitare la rottura e la diluizione delle cellule dal contenuto intracellulare. Sia la quantità di glucosio che di lattato in TIF riflettevano le diverse caratteristiche glicolitiche delle due diverse linee cellulari. Qui descriviamo in dettaglio il protocollo per i due metodi più comunemente usati per l’isolamento della TIF: centrifugazione tissutale ed eluizione tissutale (Figura 2).
Figura 2: Rappresentazione schematica dei metodi di isolamento del liquido interstiziale tumorale. Illustrazione schematica delle tecniche descritte in dettaglio nel protocollo, vale a dire centrifugazione tissutale (A) ed eluizione tissutale (B). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio abbiamo descritto la tecnica per raccogliere intraoperatoriamente il succo pancreatico, una biopsia fluida in gran parte inesplorata. Abbiamo recentemente dimostrato che il succo pancreatico può essere sfruttato come fonte di marcatori metabolici della malattia12. L’analisi metabolomica su altre biopsie liquide, come sangue 5,6,7, urina8 e saliva9,<sup class="xref…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Si ringrazia Roberta Migliore per l’assistenza tecnica. La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dall’Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) nell’ambito del progetto IG2016-ID.18443 – P.I. Marchesi Federica. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Greiner BioOne | GR616201 | |
| 20 µm nylon cell strainer | pluriSelect | 43-50020-03 | |
| 25G needle | BD Biosciences | 305122 | |
| 3 mL K2EDTA vacutainer | BD Biosciences | 366473 | |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | 309656 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Clamps | Medicon | 06.20.12 | |
| Disposable scalpel | Medicom | 9000-10 | |
| Fetal bovine serum | Microtech | MG10432 | |
| Flat-tipped forceps | Medicon | 06.00.10 | |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | ECB3001D | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 34044100 | |
| RPMI medium | Euroclone | ECB9006L | |
| Scissors | Medicon | 02.04.09 | |
| Trypsin/EDTA 1x | Lonza | BE17-161F | |
| Ultraglutamine 100x | Lonza | BE17-605E/U1 |
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