מדידת זרימת הדם בפרוזדורים בשבלול עכברים תוך שימוש בחלון כלי פתוח ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-חיונית
Summary
גישה של חלון כלי דם פתוח באמצעות עוקבים פלואורסצנטיים מספקת רזולוציה מספקת למדידת זרימת דם שבלולית (CoBF). השיטה מאפשרת לחקור שינויים מבניים ותפקודיים ב- CoBF בעכבר בתנאים נורמליים ופתולוגיים.
Abstract
התמרת קול היא תובענית מבחינה מטבולית, והתפקוד התקין של המיקרו-ווסקולטורה בדופן הצידית הוא קריטי לשמירה על הפוטנציאל האנדו-שבלולי, הובלת יונים ומאזן נוזלים. דווח כי צורות שונות של הפרעות שמיעה מערבות מיקרו-סירקולציה לא תקינה בשבלול. חקירת האופן שבו פתולוגיה של זרימת הדם השבלולית (CoBF) משפיעה על תפקוד השמיעה היא מאתגרת בשל היעדר שיטות חקירה אפשריות והקושי בגישה לאוזן הפנימית. חלון כלי פתוח בדופן השבלול הצדדית, בשילוב עם מיקרוסקופיה תוך-חיונית פלואורסצנטית, שימש לחקר שינויי CoBF in vivo, אך בעיקר בחזירי ים ורק לאחרונה בעכבר. מאמר זה והסרטון הנלווה אליו מתארים את שיטת חלון כלי הדם הפתוח להמחשת זרימת הדם בשבלול העכבר. הפרטים כוללים 1) הכנת תרחיף תאי הדם המסומנים בפלואורסצנט מעכברים; 2) בניית חלון כלי פתוח למיקרוסקופיה תוך-חיונית בעכבר מורדם, ו-3) מדידת מהירות זרימת הדם ונפחו באמצעות הקלטה לא מקוונת של ההדמיה. השיטה מוצגת בפורמט וידאו כדי להראות כיצד להשתמש בגישת החלון הפתוח בעכבר כדי לחקור שינויים מבניים ותפקודיים במיקרו-סירקולציה של השבלול בתנאים רגילים ופתולוגיים.
Introduction
תפקוד תקין של המיקרו-סירקולציה בדופן השבלול הלטרלי (המהווה את רוב הנימים ברצועה הספירלית ובסטריה וסקולריס) חשוב ביותר לשמירה על תפקוד השמיעה1. CoBF לא תקין מעורב בפתופיזיולוגיה של הפרעות רבות באוזן הפנימית, כולל אובדן שמיעה הנגרם על ידי רעש, הידרופס באוזן ופרסביקוזיס 2,3,4,5,6,7,8,9. הדמיה של CoBF תוך-חיוני תאפשר הבנה טובה יותר של הקשרים בין תפקוד השמיעה לפתולוגיה של כלי הדם בשבלול.
למרות שהמורכבות והמיקום של השבלול בתוך העצם הטמפורלית מונעים הדמיה ומדידה ישירה של CoBF, פותחו שיטות שונות להערכת CoBF, כולל זרימת לייזר-דופלר (LDF)10,11,12, הדמיית תהודה מגנטית (MRI)13, מיקרוסקופיה תוך-חיונית פלואורסצנטית (FIVM)14, מיקרואנדוסקופיה פלואורסצנטית (FME)15, הדמיית ניגודיות של כתמי לייזר אנדוסקופיים (LSCI)16 וגישות המבוססות על הזרקת סמנים מסומנים ומיקרוספרות מתויגות רדיואקטיבית לזרם הדם (מיקרואנגיוגרפיה אופטית, OMAG)17,18,19,20., עם זאת, אף אחת משיטות אלה לא אפשרה מעקב מוחלט בזמן אמת אחר שינויים ב- CoBF in vivo, למעט FIVM. FIVM, בשילוב עם חלון כלי בדופן השבלול הצדדית, היא גישה שנעשה בה שימוש ואומתה בחזירי ים בתנאי ניסוי שונים על ידי מעבדות שונות 14,21,22.
שיטת FIVM הוקמה בהצלחה לחקר השינויים המבניים והתפקודיים במיקרו-סירקולציה של שבלול בעכבר באמצעות פלואורסצין איזותיוציאנט (FITC)-דקסטרן כאמצעי ניגוד וצבע פלואורסצנטי – או DiO (3, 3′-דיוקטדצילוקסאקרבוציאנין פרכלורט, ירוק) או דיל (1,1-דיוקטדציל-3,3,3,3,3-טטרה-מתילינדוקרבוציאנין פרכלורט, אדום) – לתיוג מוקדם של תאי דם, הדמיה של כלי דם ומעקב אחר מהירות זרימת הדם. במחקר הנוכחי תואר הפרוטוקול של שיטה זו להדמיה וכימות של שינויים ב-CoBF בעכבר בתנאים רגילים ופתולוגיים (כגון לאחר חשיפה לרעש). טכניקה זו מעניקה לחוקר את הכלים הדרושים כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים של CoBF הקשורים לתפקוד לקוי של השמיעה ולפתולוגיה בסטריה וסקולריס, במיוחד כאשר היא מיושמת בשילוב עם מודלים זמינים של עכברים מהונדסים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מדגים כיצד ניתן לדמיין נימים בדופן הצידית של השבלול (ובסטריה וסקולריס) של מודל עכבר באמצעות תיוג פלואורופור בהכנה של חלון כלי פתוח תחת מערכת FIVM. מודל העכבר נמצא בשימוש נרחב ומועדף כמודל יונקים לחקר בריאות האדם ומחלותיו. הפרוטוקול המתואר כאן הוא גישה אפשרית להדמיה וחקירה של CoBF בדופ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי NIH/NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH/NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH/NIDCD R01-DC010844 (X.Shi), וקרן המחקר הרפואי מאוניברסיטת אורגון לבריאות ומדע (OHSU) (X.Shi).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL (for 1 mL) |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
| 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
| CODA Monitor system | Kent scientific | CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-542A | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fiji/ImageJ | NIH | Measurement of vessel diameter | |
| FITC-dextran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
| Heparin Sodium Injection, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP units/mL |
| Katathesia (100 mg/mL) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Microscope Objective | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
| ORCA-ER Camera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
| PBS | Gibco | 2085387 | |
| Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Zoom Stereo Microscope | Olympus | Model: SZ61, fluorescent microscope |
Riferimenti
- Shi, X. Physiopathology of the cochlear microcirculation. Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).
- Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice. Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).
- Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research. Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).
- Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention. Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).
- Miller, J., Ren, T. -. Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. Hydrops-induced changes in cochlear blood flow. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).
- Miller, J. M., Ren, T. -. Y., Nuttall, A. L. Studies of inner ear blood flow in animals and human beings. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).
- Nakashima, T., et al. Disorders of cochlear blood flow. Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).
- Nuttall, A. L. Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss. Noise and Health. 2 (5), 17 (1999).
- Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. Vascular pathophysiology in hearing disorders. Seminars in Hearing. , 242-250 (2012).
- Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).
- Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF). Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).
- Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow. Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).
- Le Floc’h, J., et al. Markers of cochlear inflammation using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).
- Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy. Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).
- Monfared, A., et al. In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy. Otology & Neurotology. 27 (2), 144 (2006).
- Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system. PLoS One. 13 (2), 0191978 (2018).
- Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. The microsphere method for studies of inner ear blood flow. ORL. 50 (6), 355-362 (1988).
- Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).
- Subhash, H. M., et al. Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).
- Reif, R., et al. Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system. PLoS One. 7 (12), 52041 (2012).
- Nuttall, A. L. Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea. Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).
- Nuttall, A. L. Cochlear blood flow: measurement techniques. American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).
- Hanna, G., et al. Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).
- Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. Purification of platelets from mouse blood. Journal of Visualized Experiments. (147), e59803 (2019).
- Shi, X., et al. Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow. Hearing Research. 313, 38-46 (2014).
- Lorenz, J. N. A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).
- Dai, M., Shi, X. Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow. PloS One. 6 (6), 20652 (2011).
- Shi, X. Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor. American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).
- Hou, Z., et al. Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).
- Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry. American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).
