Измерение стойлового кровотока у улитки мыши с использованием открытого сосудистого окна и прижизненной флуоресцентной микроскопии

Summary

Подход с открытым окном сосудов с использованием флуоресцентных индикаторов обеспечивает достаточное разрешение для измерения кохлеарного кровотока (CoBF). Метод облегчает изучение структурно-функциональных изменений CoBF у мышей при нормальных и патологических состояниях.

Abstract

Трансдукция звука метаболически требовательна, и нормальная функция микроциркуляторного русла в боковой стенке имеет решающее значение для поддержания эндокохлеарного потенциала, транспорта ионов и баланса жидкости. Сообщается, что различные формы нарушений слуха связаны с аномальной микроциркуляцией в улитке. Исследование того, как патология кохлеарного кровотока (CoBF) влияет на функцию слуха, является сложной задачей из-за отсутствия осуществимых методов опроса и трудностей с доступом к внутреннему уху. Открытое сосудистое окно в боковой кохлеарной стенке в сочетании с флуоресцентной прижизненной микроскопией использовалось для изучения изменений CoBF in vivo, но в основном у морских свинок и только недавно у мыши. В этой статье и связанном с ней видео описывается метод визуализации кровотока в улитке мыши. Детали включают 1) приготовление флуоресцентно меченой суспензии клеток крови от мышей; 2) строительство открытого сосуда-окна для прижизненной микроскопии у анестезируемой мыши и 3) измерение скорости и объема кровотока с помощью автономной записи изображения. Метод представлен в видеоформате, чтобы показать, как использовать подход с открытым окном у мышей для исследования структурных и функциональных изменений в кохлеарной микроциркуляции в нормальных и патологических условиях.

Introduction

Нормальная функция микроциркуляции в боковой кохлеарной стенке (включающей большинство капилляров в спиральной связке и stria vascularis) критически важна для поддержания слуховой функции¹. Аномальный CoBF участвует в патофизиологии многих заболеваний внутреннего уха, включая потерю слуха, вызванную шумом, ушную водянку и пресбикусис ^{2,3,4,5,6,7,8,9}. Визуализация прижизненного CoBF позволит лучше понять связи между функцией слуха и кохлеарной сосудистой патологией.

Хотя сложность и расположение улитки в височной кости исключает прямую визуализацию и измерение CoBF, для оценки CoBF были разработаны различные методы, включая лазерно-допплеровскую флоуметрию (LDF)^10,11,12, магнитно-резонансную томографию (МРТ)¹³, флуоресцентную прижизненную микроскопию (FIVM)¹⁴, флуоресцентную микроэндоскопию (FME)¹⁵, эндоскопическую лазерную спекл-контрастную визуализацию (LSCI)¹⁶ , и подходы, основанные на введении меченых маркеров и радиоактивно меченых микросфер в кровоток (оптическая микроангиография, OMAG)17,18,19,20. Однако ни один из этих методов не позволяет в режиме реального времени отслеживать изменения в CoBF in vivo, за исключением FIVM. FIVM, в сочетании с сосудом-окном в боковой кохлеарной стенке, является подходом, который был использован и проверен на морской свинке в различных экспериментальных условиях различными лабораториями 14,21,22.

Был успешно разработан метод FIVM для изучения структурно-функциональных изменений кохлеарной микроциркуляции у мышей с использованием флуоресцеина изотиоцианата (FITC)-декстрана в качестве контрастного вещества и флуоресцентного красителя – либо DiO (3, 3′-диоктацилоксакарбоцианин перхлорат, зеленый) или Dil (1,1-диоктадецил-3,3,3,3-тетраметилиндокарбоциан перхлорат, красный) – для предварительной маркировки клеток крови, визуализации сосудов и отслеживания скорости кровотока. В настоящем исследовании протокол этого метода был описан для визуализации и количественной оценки изменений CoBF у мышей при нормальных и патологических состояниях (например, после воздействия шума). Этот метод дает исследователю инструменты, необходимые для изучения основных механизмов CoBF, связанных с дисфункцией слуха и патологией в стриях васкулярных мышц, особенно при применении в сочетании с легкодоступными трансгенными моделями мышей.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Это операция, не связанная с выживанием. Все процедуры, связанные с использованием животных, были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Орегонском университете здравоохранения и науки (номер одобрения IACUC: TR01_IP00000968)….

Representative Results

После хирургического воздействия кохлеарных капилляров в боковой стенке (рисунок 1) прижизненное флуоресцентное микроскопическое наблюдение за dil-мечеными клетками крови в меченых FITC-декстраном сосудах было возможно через открытое сосудистое окно. <s…

Discussion

В данной работе показано, как капилляры в кохлеарной боковой стенке (и в stria vascularis) мышиной модели могут быть визуализированы с помощью флуорофорной маркировки в препарате с открытым сосудом-окном в системе FIVM. Мышиная модель широко используется и предпочтительна в качестве модели млек…

Materials

0.9% Sodium Chloride	Hospira	NDC 0409-1966-02	0.6 mL (for 1 mL)
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	468495	20 µM
3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	D4292	20 µM
CODA Monitor system	Kent scientific		CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat
Coverslip	Fisher Scientific	12-542A
DC Temperature Controller	FHC	40-90-8D
Fiji/ImageJ	NIH		Measurement of vessel diameter
FITC-dextran (2000 kDa)	Sigma Aldrich	FD2000s	40 mg/mL
Heparin Sodium Injection, USP MDV	Mylan	NDC 67457-374-12	5000 USP units/mL
Katathesia (100 mg/mL)	Henry Schein	NDC 11695-0702-1	0.2 mL (for 1 mL)
Microscope Objective	Mitutoyo	378-823-5	Model: M Plan Apo NIR 10x
ORCA-ER Camera	Hamamatsu		Model: C4742-80-12AG
PBS	Gibco	2085387
Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use )	Lloyd	LPFL04821	0.2 mL (for 1 mL)
Zoom Stereo Microscope	Olympus		Model: SZ61, fluorescent microscope