Medição do fluxo sanguíneo strial em Cochlea de rato utilizando uma janela de vaso aberto e microscopia de fluorescência intravital

Summary

Uma abordagem aberta da janela do vaso usando rastreadores fluorescentes fornece resolução suficiente para a medição do fluxo sanguíneo coclear (CoBF). O método facilita o estudo de mudanças estruturais e funcionais no CoBF no camundongo em condições normais e patológicas.

Abstract

A transdução do som é metabolicamente exigente, e a função normal da microvasculatura na parede lateral é fundamental para manter o potencial endococlear, o transporte de íons e o equilíbrio de fluidos. Diferentes formas de distúrbios auditivos envolvem microcirculação anormal na cóclea. A investigação de como a patologia do fluxo sanguíneo coclear (CoBF) afeta a função auditiva é desafiadora devido à falta de métodos de interrogatório viáveis e à dificuldade de acesso ao ouvido interno. Uma janela de vaso aberto na parede coclear lateral, combinada com microscopia intravital de fluorescência, tem sido usada para estudar mudanças de CoBF in vivo, mas principalmente em cobaia e apenas recentemente no mouse. Este papel e o vídeo associado descrevem o método aberto da janela do vaso para visualizar o fluxo sanguíneo na cóclea do rato. Os detalhes incluem 1) preparação da suspensão de células sanguíneas rotuladas por fluorescentes em camundongos; 2) construção de uma janela de vaso aberta para microscopia intravital em um rato anestesiado, e 3) medição da velocidade e volume do fluxo sanguíneo usando uma gravação offline da imagem. O método é apresentado em formato de vídeo para mostrar como usar a abordagem da janela aberta no mouse para investigar alterações estruturais e funcionais na microcirculação coclear em condições normais e patológicas.

Introduction

A função normal da microcirculação na parede coclear lateral (compreendendo a maioria dos capilares no ligamento espiral e estria vascularis) é criticamente importante para a manutenção da função auditiva¹. CoBF anormal está implicado na fisiopatologia de muitos distúrbios do ouvido interno, incluindo perda auditiva induzida por ruído, hidrops de ouvido e presbycusis 2,3,4,5,6,7,8,9. A visualização do CoBF intravital permitirá uma melhor compreensão dos vínculos entre a função auditiva e a patologia vascular coclear.

Embora a complexidade e a localização da cóclea dentro do osso temporal impeça a visualização direta e a medição do CoBF, vários métodos foram desenvolvidos para a avaliação da CoBF, incluindo a estirmetria de fluxo de doppler a laser (LDF)^10,11,12, ressonância magnética (RM)¹³, microscopia intravital fluorescência (FIVM)¹⁴, microendoscopia de fluorescência (FME)¹⁵, endoscópica de análise de contraste de ondas laser (LSCI)¹⁶ , e abordagens baseadas na injeção de marcadores rotulados e microesferas marcadas radioativamente na corrente sanguínea (microangiografia óptica, OMAG)17,18,19,20. No entanto, nenhum desses métodos permitiu o acompanhamento absoluto em tempo real das alterações no CoBF in vivo, com exceção da FIVM. FIVM, em combinação com uma janela de vaso na parede coclear lateral, é uma abordagem que tem sido usada e validada em cobaia em diferentes condições experimentais por vários laboratórios 14,21,22.

Um método FIVM foi estabelecido com sucesso para estudar as alterações estruturais e funcionais na microcirculação coclear no camundongo usando isothiocnato fluoresceína (FITC)-dextran como meio de contraste e um corante de fluorescência – ou DiO (3, 3′-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato, verde) ou Dil (1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-3-tetramethylindocarbocyanine perclorato, vermelho)-para pré-rotular glóbulos, visualizar vasos e rastrear a velocidade do fluxo sanguíneo. No presente estudo, o protocolo deste método foi descrito para imagens e alterações quantificantes no CoBF no camundongo em condições normais e patológicas (como após exposição ao ruído). Esta técnica dá ao pesquisador as ferramentas necessárias para investigar os mecanismos subjacentes do CoBF relacionados à disfunção auditiva e patologia na estria vascularis, especialmente quando aplicada em conjunto com modelos de camundongos transgênicos prontamente disponíveis.

Protocol

NOTA: Esta é uma cirurgia de não sobrevivência. Todos os procedimentos envolvendo o uso de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Oregon Health & Science University (número de aprovação da IACUC: TR01_IP00000968). 1. Preparação das células sanguíneas rotuladas por fluorescentes Anestesiar os camundongos doadores (camundongos C57BL/6J machos com idade ~6 semanas) com uma injeção intraperitoneal (i.p.) de solução ane…

Representative Results

Após a exposição cirúrgica dos capilares cocleares na parede lateral (Figura 1), a observação microscópica de fluorescência intravital de alta resolução das células sanguíneas rotuladas por Dil em vasos rotulados pelo FITC-dextran era viável através de uma janela de vaso aberto. Figura 2A é uma imagem representativa tirada sob FIVM que mostra os capilares da parede lateral do ápice coclear do mouse. A lumina deste…

Discussion

Este artigo demonstra como os capilares na parede lateral coclear (e na estria vascularis) de um modelo de mouse podem ser visualizados com rotulagem fluorófora em uma preparação aberta de janela de vaso sob um sistema FIVM. O modelo de camundongos é amplamente utilizado e preferido como um modelo mamífero para investigar a saúde e a doença humana. O protocolo descrito aqui é uma abordagem viável para a imagem e investigação de CoBF na parede lateral do rato (particularmente na estria vascularis) usando uma ja…

Materials

0.9% Sodium Chloride	Hospira	NDC 0409-1966-02	0.6 mL (for 1 mL)
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	468495	20 µM
3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	D4292	20 µM
CODA Monitor system	Kent scientific		CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat
Coverslip	Fisher Scientific	12-542A
DC Temperature Controller	FHC	40-90-8D
Fiji/ImageJ	NIH		Measurement of vessel diameter
FITC-dextran (2000 kDa)	Sigma Aldrich	FD2000s	40 mg/mL
Heparin Sodium Injection, USP MDV	Mylan	NDC 67457-374-12	5000 USP units/mL
Katathesia (100 mg/mL)	Henry Schein	NDC 11695-0702-1	0.2 mL (for 1 mL)
Microscope Objective	Mitutoyo	378-823-5	Model: M Plan Apo NIR 10x
ORCA-ER Camera	Hamamatsu		Model: C4742-80-12AG
PBS	Gibco	2085387
Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use )	Lloyd	LPFL04821	0.2 mL (for 1 mL)
Zoom Stereo Microscope	Olympus		Model: SZ61, fluorescent microscope