Summary
在这里，我们提供了对晚期胚胎 果蝇 雄性性腺进行现场成像所需的解剖方案。该协议将允许在正常条件下或在转基因或药理学操作之后观察动态细胞过程。
Abstract
黑腹果蝇雄性胚胎性腺是研究发育生物学各个方面的有利模型，包括但不限于生殖细胞发育，piRNA生物学和生态位形成。在这里，我们提出了一种解剖技术，用于在体内实时成像非常无效的时期对性腺进行活体成像。该协议概述了如何将胚胎转移到成像皿中，选择适当分期的雄性胚胎，并在保持其结构完整性的同时从其周围组织中解剖性腺。解剖后，可以使用共聚焦显微镜对性腺进行成像，以可视化动态细胞过程。解剖过程需要精确的时间和灵活性，但我们提供了有关如何防止常见错误以及如何克服这些挑战的见解。据我们所知，这是果蝇胚胎性腺的第一个解剖方案，并且将允许在其他无法进入的时间窗口进行现场成像。该技术可以与药理学或细胞类型的特异性转基因操作相结合，以研究在其自然性腺环境中细胞内或细胞之间发生的任何动态过程。
Introduction
黑腹果蝇睾丸已成为我们理解许多动态细胞过程的范式。该模型的研究揭示了干细胞分裂调控1，2，3，生殖细胞发育4，5，piRNA生物学6，7，8和利基干细胞信号传导事件9，10，11，12，13。该模型是有利的，因为它在遗传上是可处理的14，15并且是少数我们可以在其自然环境中实时成像干细胞3，16，17，18的模型之一。然而，该模型的活体成像仅限于成体组织和早期胚胎阶段，在我们对晚期胚胎性腺动力学的知识中留下了空白，这是生态位首次形成并开始发挥作用的精确阶段。
晚期胚胎性腺是一个球体，由前部的体细胞位细胞组成，生殖细胞由体细胞在更后部区域19中形成。该器官可以在体内实时成像，直到早期胚胎阶段1717，20，21。由于开始大规模肌肉收缩，可避免进一步影像学检查。这些收缩非常严重，以至于它们将性腺推出成像框架，并且这种运动无法用成像软件进行校正。我们的实验室有兴趣揭示生态位形成的机制，这发生在这个难以捉摸的实时成像时期。因此，我们生成了一种 离体 方法，从胚胎阶段16开始对性腺进行实时成像，从而促进了在这个关键时期的性腺发育期间细胞动力学的研究。我们实验室先前的工作表明，这种 离体 成像忠实地概括了 体内 性腺发育17。 这种技术是果 蝇 胚胎性腺的第一种，也是唯一一种。
在这里，我们介绍了在胚胎晚期期对性腺进行 体外 活体成像所需的解剖方案。该方案可以与药物治疗相结合，或对性腺内特定细胞系进行转基因操作。使用这种技术，我们已经成功地成像了干细胞生态位形成的步骤17。因此，这种成像方法对于干细胞生物学领域是有帮助的，因为它将能够在其自然环境中实时可视化生态位形成的初始阶段15，17。虽然这种方法有利于干细胞生物学领域，但它也适用于可视化在该发育时间点期间性腺中发生的任何动态过程，包括细胞重排22，细胞粘附2，12，23和细胞迁移23。因此，这种解剖方案将增强我们对许多基本细胞生物学过程的理解。
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Protocol
1. 解剖前一天的准备
- 电解磨钨针24 ，使得到的直径约为0.03毫米。将供电电压调节至约14 V，并使用3.3 M NaOH。锐化时间不应超过 1 或 2 分钟。
注意：NaOH具有高度腐蚀性，与皮肤接触会导致灼伤。处理时戴上手套和护目镜，并在通风橱内工作。
注意：使用后，将NaOH储存在聚丙烯猎鹰管中。 - 制作准备好的成像介质。在15 mL锥形管中，将4.25 mL施耐德培养基与750μL胎牛血清（FBS，15%终浓度）和27.5μL青霉素-链霉素（0.05 U / μL青霉素，0.05μg/ μL终浓度）混合。将制备的成像培养基储存在4°C。
- 制作庚烷胶溶液。将约 0.5 mL 庚烷加入装有约 20 cm 双面胶带的 20 mL 可密封小瓶中。在螺母上摇晃约一小时，或用移液器吸头搅拌，直到达到水和甘油之间的稠度。这种溶解胶水的溶液将持续数天，然后庚烷蒸发。为了清新溶液，再加入0.5mL庚烷和岩石。
注意：可以使用各种比例的庚烷与胶带以及不同的摇摆/搅拌持续时间来制备有效的庚烷胶溶液。上述规格只是准备或清新一种此类适当溶液的建议。
2. 胚胎采集—解剖前15-17小时
- 将新鲜酵母糊加入苹果汁琼脂盘25中。通过将成年苍蝇（小于10天大）添加到空食物瓶中来设置胚胎收集笼，并穿孔26个小孔。使用酵母琼脂板盖住收集笼，贴在瓶子上，并将带有板面朝下的笼子放在25°C黑暗培养箱中1小时。
注意：苍蝇必须表达一种转基因，该转基因将荧光标记性腺，例如 ，six4-eGFP：：Moesin20，因为胚胎的解剖将在立体荧光显微镜下进行。参见 材料表 ，了解用于标记性腺的基因型列表。 - 从培养箱中取出笼子，丢弃第一个集合。用新鲜酵母的琼脂平板代替它，并将笼子放回培养箱中2小时。
注意：第一次胚胎收集用于清除受精，发育中的胚胎的女性，以实现严格时间的第二次胚胎收集。 - 从笼子中取出琼脂板，并将其（酵母侧朝上）放在可密封塑料容器内的湿纸巾上。将此潮湿的室置于25°C培养箱中，使胚胎老化14.5小时（最终年龄，产卵后14.5-16.5小时）。
注意：在开始步骤 2.4 之前，请立即完成步骤 3.1 和 3.2。 - 从培养箱中取出琼脂板，使用喷瓶，向琼脂板中加入足够的水，用油漆刷轻轻刷洗溶解酵母糊。将胚胎和溶解的酵母冲洗到位于称重船内的小网状筛篮中。用水喷瓶冲洗篮子，直到大多数酵母糊通过网状物过滤。
- 从称重船上取出水，然后将篮子放回内部。通过使用喷射瓶将胚胎浸入50%漂白剂溶液中来去皮化胚胎。漂白剂溶液的深度应为3-5毫米。将胚胎浸没在漂白剂中约2分钟，偶尔旋转。
注意：漂白剂具有腐蚀性，会刺激或损害眼睛和呼吸道。处理漂白剂时戴上手套和护目镜。
注意：在此期间，请尽可能完成步骤 3.3。通过将篮子放在体视显微镜下并检查背侧附件的缺失，可以检查脱皮进度。如有必要，将胚胎浸入漂白剂溶液中额外一段时间。 - 丢弃漂白剂，并用喷瓶中的水彻底冲洗篮子内的胚胎（约3秒，用纸巾吸网篮;重复2-3次）。
3. 解剖日准备
- 在1.5mL Eppendorf管（0.2mg / mL终浓度）中加入30μL胰岛素（10mg / mL）到1，500μL制备的成像培养基（参见步骤1.2）中。充分混合并将管子放在台面上以平衡到室温。
- 准备涂有胶水的盖玻片条。
- 使用金刚石刀将22 mm x 22 mm盖玻片切割成四个大小相等的条带（图1A）。
- 使用镊子拾取一条条，并将总共约30μL庚烷胶溶液涂布到条带的两侧（图1B）。为了获得均匀的胶水残留层，在庚烷蒸发的同时，以各种角度倾斜带材。
- 将胶水覆盖的条存放在盖玻片盒的空插槽中;为了保持其粘性，请将条带放置在倾斜但直立的位置，靠在盒子的边缘，以尽量减少与盒子表面的接触（图1C）。关闭盒子，使空气中的颗粒不会涂覆胶水并减轻其粘性。
- 将以下物品放在台面上：6英寸玻璃巴斯德移液器，显微镜载玻片，P200和P1000移液器，具有适当的移液器吸头，Ringer溶液27 （用NaOH调节pH值至7.3）和未覆盖的聚-D-赖氨酸涂层35毫米成像皿。
- 将胚胎从网筛篮转移到装有500-750μL庚烷的小手表玻璃杯中。
- 用纸巾擦干篮子的侧面和底部。润湿庚烷中的画笔，将画笔触摸到胚胎（疏水性卵黄素膜应粘附在刷毛上），然后将画笔浸回手表玻璃中的庚烷中（胚胎应沉入底部）。
注意：必须尽快执行后续步骤，以防止胚胎变干。胚胎不应暴露在空气中超过20秒。
- 用纸巾擦干篮子的侧面和底部。润湿庚烷中的画笔，将画笔触摸到胚胎（疏水性卵黄素膜应粘附在刷毛上），然后将画笔浸回手表玻璃中的庚烷中（胚胎应沉入底部）。
- 使用巴斯德移液器将胚胎转移到显微镜载玻片上（图1D）。将胚胎缓慢地拉入移液器中，并将其限制在移液器的狭窄部分。将胚胎缓慢移液到载玻片上，使得它们在流到载玻片上之前聚集在移液器的尖端内。将纸巾的角拧成细小的尖端，并吸走载玻片上胚胎上的庚烷。它们将聚集并覆盖较小的区域，从而在下一步中更容易将它们捕获在胶水覆盖的条带上。
- 用镊子拿起胶水覆盖的条，轻轻地将其触摸到胚胎（图1E）。将条带放在成像皿中，胚胎侧向放置，并在聚-D-赖氨酸包被的中心外侧。使用镊子将试纸条压在培养皿上，以确保其固定到位。立即用2-3.5 mL林格氏溶液淹没培养皿;首先将胚胎浸入水中以防止它们变干（图1F）。
4. 解剖
注意：这些步骤必须在立体荧光显微镜下进行。
- 去除10-15个胚胎的活化。
注意：对于初学者，这可能从两个胚胎到专家的十五个胚胎不等。- 根据肠道形态选择16期胚胎（图2）。在这个阶段，胚胎有三个肠道收缩，产生四个堆叠的肠道片段（图2B，B'）。要开始脱膜化，用钨针刺穿所选胚胎的一端，最好是前部。胚胎可能会从其卵黄素膜中弹出，但如果不是，请将膜从胚胎中剥离出来。
注意：太年轻而无法解剖的胚胎具有非区域化的肠道（图2C）。解剖17期胚胎是可能的，但比解剖16期胚胎更具挑战性，因为角质层在这个阶段开始发育。早期17期胚胎呈现四个相对彼此转移的肠道片段（图2D，D'）。 - 将针头钩穿远离性腺的区域的胚胎。将钩住的胚胎转移到培养皿的聚赖氨酸包被区域（从这里开始简称为“盖玻片”），并将其拖到底部直到粘附。重复这些步骤，并沿着聚赖氨酸包被的盖玻片的顶部排列一排脱纤化胚胎（图3A），在下面留出足够的空间用于进一步解剖。
注意：性腺表现为细胞的小球形聚集体，应发出明亮的荧光，具体取决于使用的特定标记物和转基因拷贝数。在这个阶段，性腺位于A5节的横向位置，距离前部约70%-80%的胚胎长度。在整个解剖方案中，组织可能会粘在针头上。要清除针头上的碎屑，请将其抬高到Ringer溶液的表面上方。去玻璃化可以不整洁，只要性腺本身受到尽可能少的干扰。
- 根据肠道形态选择16期胚胎（图2）。在这个阶段，胚胎有三个肠道收缩，产生四个堆叠的肠道片段（图2B，B'）。要开始脱膜化，用钨针刺穿所选胚胎的一端，最好是前部。胚胎可能会从其卵黄素膜中弹出，但如果不是，请将膜从胚胎中剥离出来。
- 将性腺从胚胎中取出并放到培养皿上（图3C，D）。
- 首先，将胚胎暴露其内部（图3C）。从胚胎的中心切开胚胎，将针向后移动，在性腺之间。梳理一些内部组织，因为这会比外部角质层更好地粘附在盘子上。组织的粘性将使下一步的操作能够揭示性腺并使其粘附在盖玻片上。
注意：如果纸巾没有粘在培养皿上，请尝试将其哄到涂层盖玻片的未受污染区域;盖玻片的外部区域会特别粘。如步骤4.1.2所述，只要性腺毫发无损，解剖操作是否导致胚胎胴体受损并不重要。 - 用针头切开性腺，直到一块组织（包括性腺）与剩余的胴体分离。用针头将该组织拉到涂有盖纸的新鲜区域，并将其哄到底部，直到它粘附在培养皿上。
注意：对于性腺本身直接附着在盖玻片上而不是通过上覆组织间接附着的情况，将实现最佳成像。因此，当组织被引导离开胴体时，尝试让性腺首先接触覆盖物，而不是外来组织。 - 通过用针轻轻地将粘附组织从性腺上拖走，从性腺中取出尽可能多的周围组织（图3D）。避免直接触摸性腺，否则会损坏性腺（图4E）。为确保性腺充分粘附在培养皿上，请围绕性腺以轻柔的圆周运动移动针头 - 如果它移动，将针头触摸剩余的粘附组织，并将性腺引导至粘性覆盖物的新鲜区域。重复此过程，直到没有可检测到的性腺运动。
- 返回胚胎胴体并解剖出第二个性腺。在尽可能多的胚胎上重复此过程，但不要超过25分钟。组织活力将在超过约40-45分钟后在Ringer溶液中受损。
- 首先，将胚胎暴露其内部（图3C）。从胚胎的中心切开胚胎，将针向后移动，在性腺之间。梳理一些内部组织，因为这会比外部角质层更好地粘附在盘子上。组织的粘性将使下一步的操作能够揭示性腺并使其粘附在盖玻片上。
- 解剖完成后，使用不可磨灭的标记在成像盘的外缘添加套准标记，以记录解剖过程中的方向。
- 从盘子中取出涂有胶水的条。
- 轻轻地将一对镊子的底部插脚插入条带下方，扣住并缓慢向上倾斜，以将其从培养皿中释放出来，并尽可能少地晃动Ringer溶液，以尽量减少对粘附性腺的干扰。
注意：条带应倾斜远离解剖的性腺。
- 轻轻地将一对镊子的底部插脚插入条带下方，扣住并缓慢向上倾斜，以将其从培养皿中释放出来，并尽可能少地晃动Ringer溶液，以尽量减少对粘附性腺的干扰。
- 轻轻地将培养皿带到成像显微镜上，以避免铃声溶液晃动。
5. 成像
- 将成像皿放在载物台支架中，使用套准标记将培养皿放置在解剖过程中的近似方向。使用明场显微镜和低功率（~10倍）物镜，识别并聚焦粘附在盖玻片上的任何组织。切换目镜设置以显示荧光，并使用双目目镜系统地扫描培养皿，在成像软件中标记每个性腺的位置（参见 材料表）。
注意：在标记位置之前，请确保性腺在视野中居中。 - 轻轻地取下整个载物台支架组件，将成像盘放在支架中，然后将组件放在工作台上。
- 用含有胰岛素的制备成像培养基替换Ringer的溶液（参见步骤1.2和3.1）。
- 使用P1000从成像皿的内侧上壁架上取下所有Ringer溶液（不要从中央盖玻片区域移液Ringer）。接下来，切换到P200，并将其尖端放在中央区域剩余铃声的表面下方。小心地去除50-100μL林格氏菌;不要删除整个解决方案。
- 抽取约200μL成像培养基，然后再次将P200尖端放在剩余Ringer的表面下方，慢慢加入该成像培养基。接下来，将剩余的成像介质（约1，300μL）加入培养皿中，从上壁架的最外缘开始。移液时，向流体的中央圆顶移动，并最终通过将移液器尖端刷过它们来合并两者。将盖子放在盘子上。
注意：成像介质应覆盖培养皿的整个内径，深度约为2 mm，以防止蒸发（图4D）。
- 将显微镜切换到更高功率的物镜（63x，1.2 NA），根据所使用的物镜（浸入液类型和物镜所需的折射率）应用适当的浸入液，然后更换载物台支架组件。使用明场显微镜聚焦在成像皿底部的组织上。
注意：如果载物台未移动，则一旦物镜聚焦，最后一个性腺应进入视野。 - 逐步浏览每个标记的性腺位置，并根据需要调整该位置。根据图像清晰度，性腺性别等选择要成像的性腺。自定义成像设置（多通道、曝光时间、激光强度、Z 系列增量、具有适当间隔的延时摄影等）。开始成像。
注意：雄性性腺可以通过存在一个生态位和在性腺的另一端，一簇称为雄性特异性体细胞的小型，高度圆形的体细胞来识别，称为雄性特异性体细胞性腺前体（msSGP）。如果使用 六4-eGFP：：moesin荧光标记物，则利基细胞是性腺中第二亮的细胞，最亮的是msSGP。在这个阶段，雌性性腺既没有利基，也没有msSGP。
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Representative Results
我们在 图1中说明了成像皿的制备，如“解剖日准备”中所述。这些方法最终应导致水合良好的胚胎粘附在盖滑条上，该衬裙暂时固定在培养皿的底部并浸没在Ringer的溶液中（图1F）。金刚石刀允许将22 x 22 mm的盖玻片干净地切成三到四条较小的条（图1A）。在用镊子处理这些条时，我们使用移液器转移足够的庚烷胶来涂覆这些条带，这使它们具有粘合性，纹理表面（图1B）。涂层条易于存放在空的盖板滑盒中，以保持粘合剂表面清洁长达2小时（图1C）。一旦这些涂层条制成，目标是将胚胎粘附在条带上，靠近条带的长边缘的聚集体（图1E）。有必要首先将几个胚胎从手表玻璃转移到干净的载玻片上并干燥它们（图1D）。然后，快速使用镊子轻轻地将涂层条接触胚胎，使它们粘附（图1E）。然后，我们立即将剥离物压到胚胎朝上，并将胚胎面朝上，并用Ringer的溶液覆盖胚胎（图1F）。如果达到这一目标，那么在传统的明场立体显微镜下观察胚胎将揭示其卵黄素膜内完全水合的健康胚胎（图1G）。相反，如果将这些胚胎转移到条带上并用溶液覆盖它们的过程大约需要30秒以上，胚胎将脱水并变得松弛（图1G'）。松弛的胚胎不健康，解剖起来非常具有挑战性，因此在此过程中有效工作至关重要。
图1：解剖前安装和保湿胚胎。 （阿–法）将胚胎粘附在胶水涂层盖玻片条上，并将该条带固定到成像皿上的步骤。（A）用金刚石刀（箭头表示的刀）划出一次盖玻片，形成一条带状。（B）将庚烷胶应用于用一对镊子固定的切断盖玻片条上。（C）四条涂胶条在盖玻片盒中干燥。（D–E）箭头指向胚胎。（D）用庚烷收集并排出到显微镜载玻片边缘的脱皮胚胎。用金缕梅除去多余的庚烷。（E）附着胚胎的胶涂条。（F）在解剖前立即对培养皿进行最终设置。请注意林格溶液的浅层（箭头）和条带（箭头）在内部解剖圆上方的位置。（G–G'）胚胎粘附在培养皿中的条带上。（G）适当水合的，浑浊的胚胎。（G'）由于长时间暴露在空气中而脱水的胚胎，通过塌陷的卵黄素膜可见。星号表示松弛的胚胎。比例尺为 0.5 毫米。 请点击此处查看此图的大图。
在立体荧光显微镜下观察胚胎可以清楚地观察肠道，肠道在GFP通道中自动发出荧光。在选择解剖胚胎时，肠道形态学是胚胎年龄的代表。由于粘附在盖玻片条上的胚胎在年龄上会略有不同，因此它们将呈现出各种各样的肠道形态（图2A）。为了实时成像性腺壁龛形态发生，我们剖析了早期的16期胚胎。这些胚胎呈现四个区域化的肠道部分，这些部分堆叠成均匀的行（图2B'，虚线）。较年轻的胚胎呈现出囊状，非区域化的肠道（图2C），并且在其性腺周围没有足够的细胞外基质（ECM）来允许有效培养完整的器官。已经开始生态位压实的较老胚胎存在四个不均匀堆叠的肠道区域，而是彼此相对移动（图2D'，虚线）。这些胚胎具有更厚的角质层，这使得解剖过程更具挑战性。
图2：选择适当老化的胚胎进行性腺解剖。 胚胎在解剖前粘附在胶水包被的盖玻片上。胚胎表达 六4-eGFP：：moesin（绿色），其标记性腺和脂肪身体细胞。请注意，肠道自动发出绿色荧光。箭头表示在每个面板中可见的男性性腺（通过存在明亮荧光的msSGP来识别）。比例尺表示0.25毫米（A）不同阶段的胚胎。（B–D）图像中心不同阶段的胚胎，朝向左侧，背部朝上。（B）早期16期胚胎，适当老化以进行解剖。（B'）四个堆叠的肠道区域用虚线白线表示。（C）太年轻而无法解剖的15期胚胎（下胚胎）。请注意，位于性腺前方的荧光肠囊还没有离散的区域。（D）由于角质层发育而难以解剖的晚期16期胚胎。请注意，四个肠道区域已经开始彼此相对旋转，为肠道循环做准备。（D'）概述了四个肠道区域。 请点击此处查看此图的大图。
重要的是要解剖在性腺中表达不可磨灭荧光标记物的胚胎，并且该标记物必须在立体荧光显微镜下可见。在这里，我们选择使用 six4-eGFP：：moesin20 来标记性腺（图2 和 图3， 箭头），以便在解剖过程中进行可视化。
我们在 图3中说明了性腺解剖过程。在聚赖氨酸包被的培养皿上解剖适当分期的胚胎可以从这些胚胎中干净地分离性腺（图3D）。去活化胚胎将粘附在培养皿上，并且可以在解剖前以方便的行排列（图3A）。胚胎脱活化和转移到聚赖氨酸是一个不精确的过程，使得组织可能从胚胎体的范围内挤出（参见胚胎1和胚胎2之间的组织片，以及残缺的胚胎4; 图 3A）。这种不精确性并不重要，只要性腺毫发无损。标准立体荧光显微镜能够识别脱透膜化胚胎体内的性腺（图3B， 箭头）。用锋利的解剖针头进行的前几次操作应该将性腺与胚胎胴体分开，尽管一些自发荧光组织将保持粘附（图3C）。额外的操作导致分离的性腺直接粘附在涂层皿上（图3D）。
图 3：解剖过程。 （A–D） 在解剖方案的顺序阶段表达 六4-eGFP：：moesin（绿色）的胚胎。（A）四个失活的胚胎，已转移到培养皿的聚赖氨酸包被解剖区域。注意胚胎如何整齐地排列，以促进培养皿中连续向下解剖。胚胎1和2之间的小块组织是胚胎2的肠道的一部分，在手工去活化过程中挤出。（B）从（A）胚胎的更高放大倍率视图，由星号表示。（C）胚胎的剩余胴体，该胴体已沿着中线切成鱼片。箭头表示阻塞的性腺，仍然大量嵌入胚胎组织中。（D）完全解剖的性腺。注意，只有最小的外来组织（箭头）留在性腺附近。箭头指向雄性性腺。比例尺为 0.25 mm。 请点击此处查看此图的大图。
一旦性腺被解剖，就可以用成像介质代替Ringer的溶液，并直接在用于解剖的同一培养皿中对培养的性腺进行成像。我们使用旋转盘共聚焦显微镜。在共聚焦显微镜上对孤立性腺进行明场可视化，可显示性腺周边周围的暗影（图4A-B， 箭头），这是在成像过程中保持性腺完整性的ECM。我们提出了一个健康，培养良好的性腺的例子，该性腺在体细胞性腺细胞20 中表达GFP标记的F-肌动蛋白，以及一个RFP标记的组蛋白标记物，以可视化所有细胞核28 （图4C-C'）。由于该胚胎中的所有细胞都表达RFP组蛋白标记物，因此在观察红色发射时观察到性腺细胞和其他贴壁组织的细胞。我们使用性腺特异性GFP标记物来辨别性腺的边界（图4C'， 轮廓）。很明显，这种培养的性腺是健康的，因为性腺边界是光滑和圆形的（图4C'，轮廓），并且因为性腺细胞在整个细胞核中具有均匀水平的RFP组蛋白荧光（图4C'，箭头）。相反，如果在成像过程中性腺未充分水合，则随着性腺组织的萎缩，细胞核和 六4-eGFP：：moesin荧光会变得点状（图4D， 箭头）。此外，如果在解剖过程中性腺ECM过度受损，则性腺边界受损，这可以通过性腺范围之外存在性腺特异性细胞（图4E， 星号）来明显（图4E， 箭头）。
图4：在实时成像期间定位健康的性腺。 （A）粘附在盖玻片上的两个解剖性腺的低和（B）高放大倍率明场视图。（C–C'）来自健康性腺中利基压实的 离体 成像的一个电影帧。体细胞性腺细胞表达 64-eGFP：：moesin（绿色），所有细胞表达 His2Av-mRFP（红色）。（C'）用白色虚线标记的性腺边界。在性腺边界外可见的 His2Av-mRFP可能是仍然附着在解剖性腺上的脂肪身体。箭头指向具有均匀 His2Av-mRFP信号的生殖细胞核，表明性腺是健康的。（D–E） 离体 解剖方案的代表性阴性结局。（D）来自成像会话的帧，其中性腺由于介质蒸发而脱水。注意 His2Av-mRFP凝结的pyknotic核（箭头），以及沿着性腺边界的 六4-eGFP：：moesin的不连续斑点。（E）在解剖过程中细胞外基质受损的 离体 成像框架。请注意，一些生殖细胞（星号）正在离开性腺边界（箭头）。生殖细胞用 nos-lifeact：：tdtomato（洋红色）标记，体细胞用 六4-eGFP：：moesin（绿色）标记。比例尺显示20μm。 请点击此处查看此图的大图。
使用这种 离体 成像方法可以培养性腺约5小时，从而能够获得晚期胚胎性腺发育中发生的动态形态发生事件的图像。在我们的实验室中，我们已经成功地使用该协议对形成中的干细胞位17 的压实进行成像（图5）。在压实之前，壁龛是性腺前部的松散体细胞聚集体（图5A， 绿色），周围是用 nos-lifeact：：tdtomato29 标记的种系细胞（参见 材料表），其中第一层将是生殖细胞干细胞（图5A， 品红色）。该利基聚集体最初呈现不规则边界（图5A'，虚线）。在整个成像过程中，我们观察到单个利基细胞重新排列其位置，而利基聚集体获得更平滑的边界。这些细胞重排也导致利基面积的减少（图5C）。我们对细胞重排以及与这一发展阶段同时发生的邻近生殖细胞分裂的观察，使我们对生态位压实背后的机制的理解提供了信息17。因此，该协议提供了可视化细胞重排，形状变化，分裂和其他细胞事件的能力，具有分析晚期性腺形态发生事件所需的分辨率。
图5：进行利基压实的 离体 培养性腺。在从早期16期胚胎解剖性腺后立即获得的成像系列的剧照。（A–C）生殖细胞（洋红色）由 nos-lifeact：：tdtomato标记，体细胞性腺细胞（绿色）由 six4-eGFP：：moesin标记。壁龛（虚线白线）在 A'–C'中概述。比例尺显示 10 μm。前部向左，后部向右。（A）在成像系列的第一个时间点（t = 0分钟），利基细胞在性腺前部完成组装，并处于压实的早期阶段。（B）在成像系列和压实过程的中途（t = 1 h 48 min），壁龛已经开始圆周化，但其边缘仍然不规则。（C）在成像系列结束时（t = 4小时21分钟），壁龛具有高度平滑的圆形边界。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在性腺发生期间，胚胎性腺，特别是雄性性腺15内的干细胞位，经历快速的形态变化。这些动态变化背后的发育机制最好通过实时成像技术来理解。然而，在胚胎阶段17，性腺的 体内 成像由于大规模肌肉收缩的发作而变得不可能17。通过该协议，我们提供了一种成功的替代方案：将性腺直接解剖到成像盘上进行 体外 实时成像。该协议是完成晚期胚胎性腺活体成像的唯一方法。
协议的关键步骤应该在执行时重点关注灵活性和时间。在解剖之前，胚胎的快速安装对于确保胚胎不会脱水并保持健康和浑浊至关重要，这有利于脱膜和解剖。在解剖过程中，至关重要的是避免性腺细胞外基质的破坏，这仅使用精细和精确的操作即可完成。使用这种灵巧性还将确保性腺与成像盘直接接触，从而能够直接通过盖玻片进行清晰成像。解剖后，必须将Ringer的溶液切换为成像介质，仅使用轻柔的抽吸和移液管排出，以防止性腺脱落。最后，重要的是将整体解剖时间限制在25分钟。这确保了解剖期间在Ringer溶液中花费的时间以及组织在共聚焦处的位置仅限于无毒暴露。随着实践的增加，解剖速度将提高，解剖序列的个性化将发生。根据我们的经验，经过大约一周的常规练习后，可以实现足够的解剖，并在大约1个月内完全掌握解剖。为了便于学习，我们建议在执行整个实验方案之前练习各个步骤。
有许多最佳实践可以改善与该协议相关的挑战，从用于解剖的胚胎的基因型开始。掺入用于标记性腺的转基因的多个拷贝将使性腺更亮，因此更容易可视化和剖析。解剖本身最适合使用锋利的针头，尽管它不应该过度锐化，因为它会弯曲到成像盘的底部并变得有外来组织。施耐德的成像介质在绿色发射光谱中自动发出荧光，这使得在添加介质后定位标有GFP的性腺变得具有挑战性。因此，当性腺仍在Ringer的解决方案中时，使用共聚焦成像软件标记性腺的位置至关重要。如果将性腺定位在共聚焦处仍然很困难，在下一次解剖后，我们建议在夹层显微镜下绘制或拍摄性腺在培养皿中相对位置的图像。然后，标记培养皿的外部以指示其在解剖过程中的方向，并在过渡到共聚焦显微镜时匹配该方向。一旦定位在共聚焦处，如果性腺出现破坏或残缺，在下一次解剖中尝试在性腺周围留下更多的粘附组织。相反，如果存在性腺，但在整个平面上看起来模糊，则盖玻片和性腺之间可能存在组织，并且未来的解剖应力求更好地将性腺与贴壁组织隔离。根据我们的经验，采用这些做法有助于学习和执行该协议。
在该协议形成过程中，我们确定了可以应用的几种更改。对于利基压实研究，我们的目标是在第16阶段解剖胚胎。在这个阶段，胚胎尚未发育出大量的角质层，并且容易粘附在聚赖氨酸包被的培养皿上。然而，这种技术可以被修改为通过将它们粘在聚赖氨酸包被区域的内壁上进行第一个切口来解剖具有角质层的较老胚胎。一旦内部组织暴露，胚胎胴体将粘附在聚赖氨酸上，解剖可以正常进行。除了调整胚胎年龄外，我们还成功地调整了这项技术，以解剖同一培养皿中的多种基因型。例如，纯合突变体可以通过在平衡染色体上使用易于识别的标记物（例如 变形的YFP）从兄弟杂合子中分离出来。脱活化后，胚胎应根据标志物的存在与否转移到盖玻片的任一侧。解剖应按照方案中所述在培养皿中向下进行，并格外小心以保持不同基因型的分离。此外，该协议可能会被修改为使用施耐德以外的培养基，尽管对Shields和Sang M3昆虫培养基的表面研究产生了不可行的性腺（数据未显示）。此外，该方案通过简单地将药物与成像介质结合，与药理学操作很好地配对。在5小时的成像期间，可能需要重新加药以维持有效浓度。最后，尽管该协议的开发目的是可视化利基压实，这是男性性腺特有的现象，但从理论上讲，该协议也可以通过简单地解剖和成像缺乏生态位和msSGP的性腺来实时成像发育中的卵巢。
与该技术相关的限制涉及培养时间的长度和培养物的 离体 性质。与中期 果蝇 卵室30的情况一样，培养的性腺在 离体 活体成像约5小时后开始死亡，表现为组织完整性丧失（细胞核变为pyknotic并且细胞膜萎缩）。因此，如果一个人希望探索雄性性腺的后期事件，则需要通过修改此处介绍的方案来解剖1龄或较老幼虫的性腺，然后在与此处介绍的相似的条件下对那些进行成像。然而，如果培养条件得到改善，我们不排除在五小时内 进行离体 活体成像的可能性，但如果来自胚胎内部的机械线索对于性腺发育是必要的，则可能存在限制。也许该技术最严重的缺点是由于其固有的 离体 性质。当 离体 培养时，细胞可以具有不自然的电位，不代表 体内 生物学31。此外，培养环境的微妙之处，包括培养基含量和基质刚度，可以对细胞行为产生巨大影响32。考虑到这种敏感性，确保培养条件准确反映 体内 生物学至关重要。我们已经采取措施来证明 体内 利基开发和信号传导是 体外17的概括。简而言之，我们使用标记物Fasciclin-III和E-cadherin确定利基细胞命运得到维持并且利基细胞数量不变。此外，存在STAT信号传导并且生殖细胞正交分裂，这表明利基功能得以维持。然而，我们尚未验证相关的 体内生物学在 性腺内的其他非生态位组织中保持完整。未来对这些其他组织的 离体 检查应包括全面的分析，以确保情况确实如此。
该协议可能采取的未来方向将包括在成像盘内加入屏障，使得一次解剖会议可能既包含对照组，也包含药物治疗组。这种改进将最大限度地减少技术重复之间的误差，从而提高科学的严谨性。
该协议没有其他真正的替代方案，因为它是在胚胎发育后期检查该器官的活体事件的唯一方法。因此，随着这一进步，以前无法回答的关于性腺形态发生的问题现在可以进入。这些问题包括细胞分裂的复杂性，细胞骨架变化以及控制干细胞生态位形成和性腺发生性的细胞插层事件。在使用固定和染色技术获取的这些过程的静止图像中，这些事件都无法检测到。总体而言，这种方法开启了研究晚期胚胎 果蝇性 腺动力学的可能性，这样的突破对无数生物学领域的进步具有很强的意义，包括干细胞生态位生物学，piRNA生物学和器官发生。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢Lindsey W. Plasschaert和Justin Sui对该协议的早期开发做出的重大贡献。作者感谢苍蝇界对试剂的慷慨解囊，特别是Ruth Lehmann和Benjamin Lin在出版前赠送的 Nos5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'系列。本研究使用了从布卢明顿果蝇库存中心（NIH P40OD018537）获得的股票。这项工作得到了NIH RO1 GM060804，R33AG04791503和R35GM136270（S.D）以及培训补助金T32GM007229（B.W.）和F32GM125123（L.A.）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
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