Summary
Her tilbyr vi en disseksjonsprotokoll som kreves for å live-image den avdøde embryonale Drosophila mannlige gonad. Denne protokollen vil tillate observasjon av dynamiske cellulære prosesser under normale forhold eller etter transgen eller farmakologisk manipulasjon.
Abstract
Drosophila melanogaster mannlige embryonale gonad er en fordelaktig modell for å studere ulike aspekter av utviklingsbiologi, inkludert, men ikke begrenset til, bakteriecelleutvikling, piRNA-biologi og nisjedannelse. Her presenterer vi en disseksjonsteknikk for å live-image gonad ex vivo i en periode da in vivo live-imaging er svært ineffektiv. Denne protokollen skisserer hvordan man overfører embryoer til en bilderett, velger riktig iscenesatte mannlige embryoer og dissekerer gonad fra det omkringliggende vevet samtidig som det opprettholder sin strukturelle integritet. Etter disseksjon kan gonader avbildes ved hjelp av et konfokalt mikroskop for å visualisere dynamiske cellulære prosesser. Disseksjonsprosedyren krever presis timing og fingerferdighet, men vi gir innsikt i hvordan vi kan forhindre vanlige feil og hvordan vi kan overvinne disse utfordringene. Så vidt vi vet er dette den første disseksjonsprotokollen for Drosophila embryonal gonad, og vil tillate levende avbildning i et ellers utilgjengelig tidsvindu. Denne teknikken kan kombineres med farmakologiske eller celle-type spesifikke transgene manipulasjoner for å studere dynamiske prosesser som forekommer i eller mellom cellene i deres naturlige gonadale miljø.
Introduction
Drosophila melanogaster testis har fungert som et paradigme for vår forståelse av mange dynamiske cellulære prosesser. Studier av denne modellen har belyst stamcelledivisjonsregulering 1,2,3, bakteriecelleutvikling 4,5, piRNA-biologi 6,7,8 og nisje-stamcellesignaleringshendelser 9,10,11,12,13. Denne modellen er fordelaktig fordi den er genetisk gjennomførbar14,15 og er en av de få der vi kan leve-bilde stamceller i deres naturlige miljø 3,16,17,18. Imidlertid har levende avbildning av denne modellen vært begrenset til voksenvev og tidlige embryonale stadier, og etterlater et gap i vår kunnskap om gonadaldynamikk i sen embryo, det nøyaktige stadiet når nisjen først dannes og begynner å fungere.
Den senfase embryonale gonad er en sfære, bestående av somatiske nisjeceller i fremre, og bakterieceller som er viklet inn av somatiske gonadale celler i flere bakre regioner19. Dette organet kan avbildes levende in vivo frem til tidlig embryonal stage 17 17,20,21. Videre avbildning er forhindret på grunn av initiering av store muskelsammentrekninger. Disse sammentrekningene er så alvorlige at de skyver gonad ut av bilderammen, og slik bevegelse kan ikke korrigeres med bildeprogramvare. Laboratoriet vårt er interessert i å avduke mekanismene for nisjedannelse, som oppstår i denne unnvikende perioden for levende avbildning. Derfor genererte vi en ex vivo-tilnærming til levende bilde gonad som starter på embryonal trinn 16, og letter studiet av celledynamikken i denne avgjørende perioden med gonadutvikling. Tidligere arbeid fra laboratoriet vårt viser at denne ex vivo-avbildningen trofast recapitulates in vivo gonad utvikling17. Denne teknikken er den første og eneste av sitt slag for Drosophila embryonal gonad.
Her presenterer vi disseksjonsprotokollen som kreves for ex vivo live-imaging av gonad under sene embryonale stadier. Denne protokollen kan kombineres med farmakologiske behandlinger, eller transgen manipulering av spesifikke celleforinger i gonad. Ved hjelp av denne teknikken har vi vellykket avbildet trinnene i stamcellenisjedannelse17. Denne bildemetoden er dermed medvirkende for stamcellebiologien, da den vil muliggjøre visualisering av de første stadiene av nisjedannelse i sanntid i sitt naturlige miljø15,17. Selv om denne metoden er gunstig for stamcellebiologi, er den i tillegg anvendelig for visualisering av dynamiske prosesser som forekommer i gonad under dette utviklingstidspunktet, inkludert cellulære omorganiseringer22, celleadhesjon 2,12,23 og cellemigrasjon23. Denne disseksjonsprotokollen vil dermed styrke vår forståelse av mange grunnleggende cellebiologiske prosesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse av dag før disseksjon
- Gjør en wolframnål24 enda skarpere slik at den resulterende diameteren er ca. 0,03 mm. Juster spenningen som følger med til ca. 14 V, og bruk 3,3 M NaOH. Sliping bør ikke ta mer enn 1 eller 2 min.
FORSIKTIG: NaOH er svært korrosiv og vil forårsake brannskader ved kontakt med huden. Bruk hansker og vernebriller under håndtering, og arbeid inne i en avtrekkshette.
MERK: Oppbevar NaOH i et polypropylenfalkrør etter bruk. - Lag det klargjorte bildemediet. I et 15 ml konisk rør kombinerer du 4,25 ml Schneiders medier med 750 μL foster bovint serum (FBS, 15 % endelig konsentrasjon) og 27,5 μL Penicillin-Streptomycin (0,05 U/μL penicillin, 0,05 μg/μL totalkonsentrasjon). Oppbevar dette forberedte bildemediet ved 4 °C.
- Lag heptanlimløsning. Tilsett ca 0,5 ml heptan til et 20 ml forseglet hetteglass fylt med ca. 20 cm dobbeltsidig tape. Rock på en mutter i omtrent en time, eller rør med en pipettespiss til en konsistens mellom vann og glyserol oppnås. Denne løsningen av oppløst lim vil vare i flere dager før heptane fordamper. For å friske opp løsningen, legg til ytterligere 0,5 ml heptan og stein.
MERK: En effektiv heptanlimløsning kan fremstilles ved hjelp av ulike forhold mellom heptan og tape, samt varierende varighet av gynging/omrøring. Ovennevnte spesifikasjoner er bare forslag til å forberede eller friske opp en slik tilstrekkelig løsning.
2. Embryoinnsamling – 15–17 timer før disseksjon
- Tilsett fersk gjærpasta til en eplejuice agarplate25. Sett opp et embryooppsamlingsbur ved å legge til voksne fluer (mindre enn 10 dager gamle) til en tom matflaske, perforert med små hull26. Cap oppsamlingsburet ved hjelp av gjæret agarplate, teipet til flasken, og legg buret med platesiden ned i en 25 ° C mørk inkubator i 1 time.
MERK: Fluene må uttrykke en transgene som fluorescerende vil markere gonad, for eksempel seks4-eGFP::Moesin20, fordi disseksjon av embryoer vil finne sted under et stereo-fluorescerende mikroskop. Se Materialfortegnelse for en liste over genotyper som brukes til å markere gonad. - Fjern buret fra inkubatoren og kast denne første samlingen. Erstatt den med en nygjært agarplate og legg buret tilbake i inkubatoren i 2 timer.
MERK: Den første embryosamlingen brukes til å fjerne kvinner av befruktede, utviklende embryoer, for å oppnå en tett tidsbetimet andre samling av embryoer. - Fjern agarplaten fra buret og plasser den (med gjæret side vendt oppover) på et fuktig papirhåndkle inne i en forseglet plastbeholder. Plasser dette fuktige kammeret i en 25 °C inkubator for å alder av embryoene i 14,5 timer (siste alder, 14,5–16,5 timer etter egglegging).
MERK: Rett før du begynner trinn 2.4, fullfører du trinn 3.1 og 3.2. - Fjern agarplaten fra inkubatoren, og bruk en spruteflaske, tilsett nok vann til agarplaten til å oppløse gjærpastaen ved å pusse lett med en pensel. Skyll embryoene og oppløst gjær i en liten nettingskjermkurv som sitter inne i en veiebåt. Skyll kurven med vannsprutflasken til de fleste gjærpastaene er filtrert gjennom nettet.
- Fjern vannet fra veiebåten og plasser kurven innvendig igjen. Dechorionate embryoene ved å nedsenke dem i en 50% blekemiddelløsning, ved hjelp av en spruteflaske. Blekemiddeloppløsningen skal ha en dybde på 3-5 mm. Hold embryoene nedsenket i blekemiddel i ~ 2 min, med sporadisk virvlende.
FORSIKTIG: Blekemiddel er etsende og kan irritere eller skade øynene og luftveiene. Bruk hansker og vernebriller under håndtering av blekemiddel.
MERK: I løpet av denne tiden må du fylle ut så mye som mulig av trinn 3.3. Dechorionation fremgang kan kontrolleres ved å plassere kurven under et stereomikroskop og se etter fraværet av dorsale vedlegg. Senk embryoene ned i blekemiddelløsningen i ekstra tid, om nødvendig. - Kast blekemiddelet, og skyll embryoene grundig inne i kurven med vann fra en spruteflaske (for ~ 3 s, blotting av nettkurven med papirhåndklær; gjenta 2-3 ganger).
3. Forberedelse av disseksjonsdagen
- Tilsett 30 μL insulin (10 mg/ml) til 1500 μL preparerte bildemedier (se trinn 1.2) i et 1,5 ml Eppendorf-rør (0,2 mg/ml endelig konsentrasjon). Bland godt og la røret stå på benken for å likevekte til romtemperatur.
- Forbered dekslerlip strimler belagt med lim.
- Bruk en diamantspisset kniv til å skjære en 22 mm x 22 mm deksler i fire, like store strimler (figur 1A).
- Bruk tang til å plukke opp en stripe og spre totalt ca. 30 μL heptanlimoppløsning på begge sider av stripen (figur 1B). For å oppnå et jevnt lag limrester, vipp stripen i forskjellige vinkler mens heptane fordamper.
- Oppbevar den limdekkede stripen i et tomt spor på en coverlip-boks; For å opprettholde sin klebrighet, plasser stripen i skrå, men oppreist stilling, lener seg mot kantene på esken for å minimere kontakt med boksflater (figur 1C). Lukk boksen slik at partikler i luften ikke belegge limet og redusere sin klebrighet.
- Plasser følgende gjenstander på benken: en 6-tommers pasteurpipette i glass, et mikroskopsklie, en P200 og en P1000 pipettemann med passende pipettespisser, Ringers løsning27 (pH justert til 7,3 med NaOH), og en udekket Poly-D-Lysine-belagt 35 mm bildefat.
- Overfør embryoer fra nettingskjermkurven til et lite klokkeglass fylt med 500-750 μL heptan.
- Flekk sidene og bunnen av kurven tørr med en vevsserviett. Fukt en pensel i heptanen, berør penselen til embryoene (den hydrofobe vitellinemembranen skal feste seg til børstene), og dypp penselen tilbake i heptan i klokkeglasset (embryoer skal synke til bunnen).
MERK: De neste trinnene må utføres så raskt som mulig for å forhindre at embryoene tørker ut. Embryoer bør ikke utsettes for luft i mer enn 20 s.
- Flekk sidene og bunnen av kurven tørr med en vevsserviett. Fukt en pensel i heptanen, berør penselen til embryoene (den hydrofobe vitellinemembranen skal feste seg til børstene), og dypp penselen tilbake i heptan i klokkeglasset (embryoer skal synke til bunnen).
- Overfør embryoene til mikroskopet med en Pasteur pipette (figur 1D). Trekk embryoer sakte inn i pipetten og begrens dem til den smale delen av pipetten. Pipette embryoer på lysbildet sakte, slik at de aggregeres like innenfor spissen av pipetten før de strømmer på lysbildet. Vri hjørnet av en vevsserviett inn i en fin spiss, og veke bort heptane fra embryoer på lysbildet. De vil aggregere og dekke et mindre område, noe som gjør det lettere å fange dem på en limdekket stripe i neste trinn.
- Med tang, plukk opp en limdekket stripe, og berør den forsiktig til embryoene (figur 1E). Plasser stripen i bildefatet, embryoet side opp, og like utenfor poly-D-Lysine-belagt senter. Trykk stripen på parabolen med tang for å sikre at den er festet på plass. Oversvømme straks parabolen med 2-3,5 ml Ringers løsning; embryoene først for å hindre at de tørker ut (figur 1F).
4. Disseksjon
MERK: Disse trinnene må utføres under et stereo-fluorescerende mikroskop.
- Devitellinize 10-15 embryoer.
MERK: Dette kan variere fra to embryoer, for nybegynnere, til femten embryoer, for eksperter.- Velg stadium 16 embryoer basert på tarmmorfologi (figur 2). På dette stadiet har embryoer tre innsnevringer i tarmen som skaper fire stablede tarmsegmenter (figur 2B,B'). For å begynne devitellinisering, pierce det valgte embryoet i den ene enden, helst fremre, med wolframnålen. Embryoet kan poppe ut av vitellinemembranen, men hvis ikke, skrell membranen av embryoet.
MERK: Embryoer som er for unge til å dissekeres, har ikke-regionaliserte tarmer (figur 2C). Disseksjon av stadium 17 embryoer er mulig, men mer utfordrende enn disseksjon av stadium 16 embryoer fordi kutiklet begynner å utvikle seg på dette stadiet. Tidlige stadium 17 embryoer presenterer med fire tarmsegmenter som er forskjøvet i forhold til hverandre (figur 2D,D'). - Hekt nålen gjennom embryoet i en region langt fra gonadene. Overfør det hektede embryoet til den polylyinbelagte delen av parabolen (herfra og utover referert til som bare "dekkslipp") og dra den mot bunnen til den fester seg. Gjenta disse trinnene, og ordne devitelliniserte embryoer på rad langs toppen av polylyinbelagt dekselslipp (figur 3A), og la det være god plass nedenfor for videre disseksjon.
MERK: Gonadene fremstår som små sfæriske aggregater av celler som skal fluoresce sterkt, avhengig av den spesifikke markøren som brukes og transgene kopinummer. På dette stadiet ligger gonadene lateralt i segment A5, på ca. 70% -80% av embryolengden fra fremre. Gjennom disseksjonsprotokollen kan vevet holde seg til nålen. For å kvitte nålen av rusk, løft den like over overflaten av Ringers løsning. Devitellinisering kan være ryddig så lenge gonad riktig er forstyrret så lite som mulig.
- Velg stadium 16 embryoer basert på tarmmorfologi (figur 2). På dette stadiet har embryoer tre innsnevringer i tarmen som skaper fire stablede tarmsegmenter (figur 2B,B'). For å begynne devitellinisering, pierce det valgte embryoet i den ene enden, helst fremre, med wolframnålen. Embryoet kan poppe ut av vitellinemembranen, men hvis ikke, skrell membranen av embryoet.
- Finss gonadene ut av embryoet og på parabolen (figur 3C,D).
- Først fileterer embryoet for å eksponere interiøret (figur 3C). Skjær gjennom embryoet fra midten, flytt nålen bakre, mellom gonadene. Ert ut litt internt vev, da dette vil holde seg til parabolen mye bedre enn den eksterne kutikol. Vevets klebrighet vil gjøre det mulig for de neste manipulasjonene å avsløre gonad og la den holde seg til dekselslippet.
MERK: Hvis vevet ikke fester seg til parabolen, kan du prøve å koaksialisere det til et ukontaminert område av den belagte dekselslippet; De ytre områdene av dekselslippet vil være spesielt klebrig. Som nevnt i trinn 4.1.2, spiller det ingen rolle om disseksjonsmanipulasjonene resulterer i en ødelagt embryokroppe, så lenge gonadene forblir uskadd. - Bruk nålen til å skjære rundt en gonad til et stykke vev, inkludert gonad, er skilt fra den gjenværende slaktkroppen. Med nålen, trekk dette vevet til en frisk region med belagt dekselslipp, og koaksialisere det mot bunnen til det fester seg til parabolen.
MERK: Det beste bildet vil bli oppnådd for de tilfellene der selve gonadet festes direkte til dekselslippet, i stedet for indirekte vedlegg via overlysende vev. Derfor, som vev styres bort fra slaktkroppen, forsøk å få gonad berøre dekselet slip først, i stedet for fremmed vev. - Fjern så mye omkringliggende vev fra gonaden som mulig (figur 3D) ved å forsiktig dra tilhengervevet bort fra gonaden med nålen. Unngå å berøre gonad direkte, noe som vil skade den (figur 4E). For å sikre at gonaden er tilstrekkelig festet til parabolen, beveg nålen i en mild sirkulær bevegelse rundt gonaden - hvis den beveger seg, berør nålen til det gjenværende festevevet og rett gonaden mot en frisk region med klebrig dekselglidning. Gjenta denne prosessen til det ikke er noen påviselig bevegelse av gonaden.
- Gå tilbake til embryokroppen og disseker ut den andre gonad. Gjenta denne prosessen på så mange embryoer som mulig, men ikke overskrid 25 min. Vevs levedyktighet vil bli kompromittert i Ringers løsning etter mer enn ~ 40-45 min.
- Først fileterer embryoet for å eksponere interiøret (figur 3C). Skjær gjennom embryoet fra midten, flytt nålen bakre, mellom gonadene. Ert ut litt internt vev, da dette vil holde seg til parabolen mye bedre enn den eksterne kutikol. Vevets klebrighet vil gjøre det mulig for de neste manipulasjonene å avsløre gonad og la den holde seg til dekselslippet.
- Når disseksjonene er fullført, bruker du en uutslettelig markør for å legge til registreringsmerker på ytterkanten av bildefatet for å registrere retningen under disseksjonen.
- Fjern den limbelagte stripen fra parabolen.
- Sett forsiktig inn den nederste pinnen på et par tang under stripen, lås og vipp stripen sakte oppover for å frigjøre den fra parabolen med så lite sloshing av Ringers løsning som mulig for å minimere forstyrrelsen av de festede gonadene.
MERK: Stripen skal vippes bort fra de dissekerte gonadene.
- Sett forsiktig inn den nederste pinnen på et par tang under stripen, lås og vipp stripen sakte oppover for å frigjøre den fra parabolen med så lite sloshing av Ringers løsning som mulig for å minimere forstyrrelsen av de festede gonadene.
- Bær forsiktig parabolen til bildemikroskopet på en måte som unngår sloshing av Ringers løsning.
5. Bildebehandling
- Plasser bildefatet i sceneholderen ved hjelp av registreringsmerkene for å plassere parabolen i omtrentlig retning som under disseksjonen. Bruk brightfield mikroskopi og et mål med lav effekt (~ 10x) for å identifisere og sette fokus på alt stykke vev som følges av dekselslippet. Bytt okularinnstillingene for å avdekke fluorescens, og bruk de kikkerte okularokularene, skann systematisk parabolen, og posisjonen til hver gonad i bildeprogramvaren (se Materialfortegnelse).
MERK: Kontroller at gonadene er sentrert i synsfeltet før du markerer posisjoner. - Fjern forsiktig hele sceneholderenheten, med bildefatet i holderen, og legg enheten på arbeidsbenken.
- Bytt ut Ringers oppløsning med det klargjorte bildemediet som inneholder insulin (se trinn 1.2 og 3.1).
- Bruk en P1000 til å fjerne alle Ringers oppløsning fra innsiden av bildefatet (ikke pipette Ringers fra det sentrale dekselskliområdet). Deretter bytter du til en P200, og plasserer spissen like under overflaten av de gjenværende Ringer's i den sentrale regionen. Fjern forsiktig 50-100 μL ringer; IKKE fjern hele oppløsningen.
- Tegn opp ~ 200 μL bildemedier, og igjen plassere P200-spissen like under overflaten av de gjenværende Ringer's, legg sakte til dette bildemediet. Deretter legger du til de resterende bildemediene (~ 1300 μL) i parabolen, og starter ved den ytterste kanten av den øvre kanten. Mens pipettering, bevege seg mot den sentrale kuppelen av væsken, og til slutt slå sammen de to ved å pusse pipettespissen over dem begge. Sett lokket på parabolen.
MERK: Bildemedier skal dekke hele den innvendige diameteren på parabolen, med en dybde på ca. 2 mm, for å forhindre fordampning (figur 4D).
- Bytt mikroskopet til et høyere effektmål (63x, 1,2 NA), bruk riktig nedsenkningsvæske basert på målet som brukes (nedsenkningsvæsketype og brytningsindeks som kreves av målet), og erstatt deretter trinnholderenheten. Bruk brightfield mikroskopi for å fokusere på vev festet til bunnen av bildebehandlingsfatet.
MERK: Hvis scenen ikke ble flyttet, bør den siste gonad komme til syne når målet er fokusert. - Gå gjennom hver markerte gonadposisjon og juster den posisjonen etter behov. Velg hvilke gonader til bilde basert på bildeklarhet, gonadsex, etc. Tilpass bildeinnstillingene (flerkanals, eksponeringstider, laserintensiteter, Z-serieintervaller, tidsforløp med passende intervaller osv.). Begynn å forestille deg.
MERK: Mannlige gonader kan identifiseres ved tilstedeværelsen av både en nisje, og i motsatt ende av gonaden, en klynge av små, svært sirkulære somatiske celler kalt mannsspesifikke somatiske gonadale forløpere (msSGPs). Hvis den seks4-eGFP: : moesin fluorescerende markøren brukes, er nisjecellene de nest lyseste cellene i gonad, den lyseste er msSGPs. På dette stadiet har kvinnelige gonader verken en nisje eller msSGPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi illustrerer tilberedning av bilderetten i figur 1, som beskrevet i "Forberedelse av disseksjonsdagen". Disse metodene bør til slutt resultere i godt hydrerte embryoer festet til en dekselslipstrimmel, som er midlertidig festet til bunnen av parabolen og nedsenket i Ringers løsning (figur 1F). En diamantspisset kniv gjør det mulig for en å skjære et 22 x 22 mm deksel i tre til fire mindre strimler (figur 1A). Mens vi håndterer disse stripene med tang, bruker vi en pipette for å overføre nok heptanlim til å belegge disse stripene, noe som gir dem en klebende, strukturert overflate (figur 1B). De belagte strimlene lagres enkelt i en tom dekselslippboks for å holde klebeflatene rene i opptil 2 timer (figur 1C). Når disse belagte strimlene er laget, er målet å holde embryoer til stripen i et aggregat, nær den lange kanten av stripen (figur 1E). Det er nødvendig å først overføre noen embryoer fra klokkeglasset til en ren glasssklie og tørke dem (figur 1D). Bruk deretter raskt tang for å berøre den belagte stripen forsiktig til embryoene slik at de fester seg (figur 1E). Deretter trykker vi straks på stripen til bunnen av disseksjonsfatet med embryoer vendt opp, og dekker embryoene med Ringers løsning (figur 1F). Hvis dette målet er oppfylt, vil visning av embryoer under et tradisjonelt brightfield stereomikroskop avsløre fullt hydrerte, sunne embryoer i deres vitelline membraner (figur 1G). Hvis prosessen med å overføre disse embryoene til stripen og dekke dem med løsning tar mer enn ca. 30 s, vil embryoene dehydrere og bli slapp (figur 1G'). Slapp embryoer er ikke sunne og er utrolig utfordrende å dissekere, så det er viktig å jobbe effektivt under denne prosessen.
Figur 1: Montering og fuktighetsgivende embryoer før disseksjon. (A–F) Trinn for å feste embryoer til en stripe limbelagt deksler, og sikre stripen til en bilderett. (A) Coverlip scoret en gang med diamantspisset kniv (kniv indikert med pilspiss) for å lage en stripe. (B) Påføring av heptanlim til avkuttet deksler, holdt med et par tang. (C) Fire limbelagte strimler som tørker i en coverlip-boks. (D–E) Piler peker på embryoer. (D) Avkorionerte embryoer som er samlet inn i heptane og utvist på kanten av et mikroskopsklie. Overflødig heptane ble fjernet med en kimwipe. (E) Limbelagt stripe med embryoer festet. (F) Det endelige oppsettet av retten umiddelbart før disseksjon. Legg merke til det grunne laget av Ringers løsning (pilspiss) og plassering av stripen (pilen) over den indre disseksjonssirkelen. (G–G)) Embryoer festet til stripen i parabolen. (G) Riktig hydrerte, turgid embryoer. (G') Embryoer som har blitt dehydrert på grunn av langvarig lufteksponering, tydelig av kollapsede vitelline membraner. Stjerner indikerer slapp embryoer. Skalastenger er 0,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Visning av et embryo under et stereo-fluorescerende mikroskop tillater klar visualisering av tarmen, som automatisk fluoresces i GFP-kanalen. Tarmmorfologi fungerer som en proxy for embryonal alder når du velger embryoer å dissekere. Fordi embryoer som følges av stripen av dekselslipp vil variere litt i alderen, vil de presentere et mangfoldig utvalg av tarmmorfologier (figur 2A). For å live-image gonad nisje morphogenesis, dissekerer vi tidlig stadium 16 embryoer. Disse embryoene presenterer fire regionaliserte tarmseksjoner som er stablet i en jevn rad (figur 2B', stiplede linjer). Yngre embryoer presenterer en sak-lignende, ikke-regionalisert tarm (figur 2C), og har ennå ikke tilstrekkelig ekstracellulær matrise (ECM) rundt sine gonader for å muliggjøre effektiv dyrking av det intakte organet. Eldre embryoer som allerede har begynt nisjekomprimering, presenterer fire tarmregioner som ikke er jevnt stablet og i stedet forskyves i forhold til hverandre (figur 2D', stiplede linjer). Disse embryoene har tykkere kutikol, noe som gjør disseksjonsprosessen mer utfordrende.
Figur 2: Velge passende alderen embryoer for gonad disseksjon. Embryoer festet til en limbelagt dekslelip før disseksjon. Embryoer uttrykker six4-eGFP::moesin (grønn), som markerer gonad og fett kroppsceller. Vær oppmerksom på at tarmen auto-fluoresces i grønt. Piler indikerer mannlige gonader (oppfattet av tilstedeværelsen av sterkt fluoreserende msSGPer) som er synlige i hvert panel. Skalastenger indikerer 0,25 mm. (A) embryoer i ulike stadier. (B–D) Embryoer av distinkte stadier i midten av bildet, orientert med fremre til venstre og dorsal opp. (B) Et tidlig stadium 16 embryo som er i alderen hensiktsmessig for disseksjon. (B') De fire stablede tarmområdene er indikert med prikkede hvite linjer. (C) Et stadium 15 embryo som er for ung til å dissekere (lavere embryo). Legg merke til at den fluorescerende tarmsekken bare fremre til gonad ennå ikke har diskrete regioner. (D) Et sen stadium 16 embryo som er vanskelig å dissekere på grunn av utvikling av kutikal. Legg merke til at de fire tarmregionene har begynt å rotere i forhold til hverandre som forberedelse til tarmsløyfe. (D') De fire tarmregionene er skissert. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Det er viktig å dissekere embryoer som uttrykker en uutslettelig fluorescerende markør i gonad, og denne markøren må være synlig under et stereo-fluorescerende mikroskop. Her har vi valgt å bruke six4-eGFP::moesin20 for å markere gonad (figur 2 og figur 3, piler) for visualisering under disseksjon.
Vi illustrerer gonad disseksjonsprosessen i figur 3. Disseksjonen av passende iscenesatte embryoer på den polylyinbelagte parabolen gir mulighet for ren isolasjon av gonadene fra disse embryoene (figur 3D). Embryoer som er devitellinert vil holde seg til parabolen, og kan ordnes i en praktisk rad før disseksjon (figur 3A). Embryodevitellinisering og overføring til polylyin er en upresis prosess slik at vev kan bli ekstrudert fra embryokroppens grenser (se stykke vev mellom embryo 1 og embryo 2, og ødelagt embryo 4; Figur 3A). Denne upresistensen har ingen betydning, så lenge gonadene forblir uskadd. Et standard stereo-fluorescerende mikroskop muliggjør identifisering av gonaden i det devitelliniserte embryolegemet (figur 3B, pil). De første manipulasjonene med en skarp disseksjonsnål bør skille gonadene fra embryokroppen, selv om noe auto-fluorescerende vev vil forbli festet (figur 3C). Ytterligere manipulasjoner resulterer i isolerte gonader som fester seg direkte til den belagte parabolen (figur 3D).
Figur 3: Disseksjonsprosessen. (A–D) Embryoer som uttrykker seks4-eGFP::moesin (grønn) på sekvensielle stadier i disseksjonsprotokollen. (A) Fire devitelliniserte embryoer som er overført til den polylyinbelagte disseksjonsområdet på parabolen. Legg merke til hvordan embryoene er justert i en fin rad for å lette påfølgende nedadgående disseksjoner i parabolen. Det lille vevet mellom embryo 1 og 2 er en del av tarmen fra Embryo 2, ekstrudert under hånddevitellinisering. (B) Høyere forstørrelsesvisning av embryo fra (A), indikert av stjernen. (C) Den gjenværende av et embryo som har blitt filetert ned midtlinjen. Pilspissen indikerer en okkludert gonad, fortsatt tungt innebygd i embryonalt vev. (D) En fullstendig dissekert gonad. Legg merke til at bare minimalt fremmedvev (pilspiss) forblir i nærheten av gonad. Piler peker på mannlige gonader. Skalastenger er 0,25 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Når gonadene er dissekert, kan man erstatte Ringers løsning med bildemedier, og bildekulturerte gonader direkte i samme tallerken som brukes til disseksjon. Vi bruker et spinnende disk konfokalt mikroskop. Brightfield-visualisering av en isolert gonad på et konfokalt mikroskop avslører en mørk skygge rundt gonadperiphery (figur 4A-B, piler), som er ECM som opprettholder integriteten til gonad under avbildning. Vi presenterer et eksempel på en sunn, godt dyrket gonad som uttrykker GFP-merket F-aktin i somatiske gonadale celler20 og en RFP-merket histonemarkør for å visualisere alle kjerner28 (figur 4C–C).). Fordi alle celler i dette embryoet uttrykker RFP-histonemarkøren, observeres både gonadale celler og celler av annet tilhengervev ved visning av røde utslipp. Vi skjelner grensene til gonad ved hjelp av den gonadspesifikke GFP-markøren (figur 4C', omriss). Det er klart at denne kultiverte gonaden er sunn fordi gonadgrensen er jevn og rund (figur 4C', omriss), og fordi gonadale celler har jevne nivåer av RFP-histonfluorescens gjennom kjerner (figur 4C', pil). Hvis i stedet gonader ikke er tilstrekkelig hydrert under avbildning, kan kjerner og seks4-eGFP::moesinfluorescens bli punktert (figur 4D, pil) når gonadvevet krymper. Videre, hvis gonad ECM er skadet for mye under disseksjonen, er gonadgrensen kompromittert, noe som fremgår av tilstedeværelsen av gonadspesifikke celler (figur 4E, stjerner) utenfor gonadens grenser (figur 4E, pil).
Figur 4: Finne friske gonader under levende bildebehandling. (A) Lav og (B) høy forstørrelse brightfield utsikt over to dissekerte gonads festet til coverlip. (C–C)) En filmramme fra ex vivo-avbildning av nisjekomprimering i en sunn gonad. Somatiske gonadale celler uttrykker six4-eGFP::moesin (grønn), og alle celler uttrykker His2Av-mRFP (rød). (F') Gonad grense merket med en hvit prikket linje. His2Av-mRFP synlig utenfor gonad grensen er sannsynligvis fett kroppen som fortsatt er festet til dissekert gonad. Pil peker på en bakteriecellekjerne med ensartet His2Av-mRFP-signal, noe som indikerer at gonad er sunt. (D–E) Representative negative utfall av ex vivo disseksjonsprotokollen. (D) En ramme fra en bildeøkt der gonaden har dehydrert på grunn av mediefordampning. Legg merke til pyknotiske kjerner når His2Av-mRFP kondenserer (pil) og diskontinuerlige flekker på seks4-eGFP::moesin langs gonadgrensen. (E) Ex vivo bilderamme der ekstracellulær matrise har blitt kompromittert under disseksjon. Legg merke til at noen bakterieceller (stjerner) går ut av gonadgrensen (pil). Bakterieceller er merket med nos-lifeact::tdtomato (magenta) og somatiske gonadale celler med six4-eGFP::moesin (grønn). Skalastenger viser 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Gonader kan dyrkes i ca 5 timer ved hjelp av denne ex vivo-avbildningsmetoden, noe som muliggjør bildeinnhenting av de dynamiske morfogenesehendelsene som oppstår i sen embryonal gonadutvikling. I laboratoriet vårt har vi med hell brukt denne protokollen til å avbilde komprimeringen av den dannende stamcellenisjen17 (figur 5). Før komprimering er nisjen et løst aggregat av somatiske celler i gonad-fremre (figur 5A, grønn), omgitt av bakterieceller merket med nos-lifeact::tdtomato29 (se Materialtabell), hvorav den første delen vil være bakterieformede stamceller (figur 5A, magenta). Dette nisjeaggregatet presenterer i utgangspunktet en uregelmessig grense (figur 5A', prikket linje). Gjennom hele bildebehandlingsforløpet observerer vi individuelle nisjeceller som omorganiserer sine posisjoner mens nisjeaggregatet får jevnere grenser. Disse cellulære omorganiseringene resulterer også i en nedgang i nisjeområdet (figur 5C). Våre observasjoner av celle omorganiseringer, og nærliggende bakteriecelledelinger som forekommer samtidig med denne utviklingsfasen, informerte vår forståelse av mekanismer som ligger til grunn for nisjekomprimering17. Denne protokollen gir dermed muligheten til å visualisere celle omorganiseringer, formendringer, divisjoner og andre cellulære hendelser med oppløsningen som kreves for å analysere morfogenetiske hendelser i senfase gonads.
Figur 5: En ex vivo dyrket gonad som gjennomgår nisjekomprimering. Stillbilder fra en bildeserie ervervet raskt etter disseksjon av gonader fra tidlig stadium 16 embryoer. (A–C) Bakterieceller (magenta) er merket med nos-lifeact::tdtomato og somatiske gonadale celler (grønn) er merket med seks4-eGFP::moesin. Nisjen (prikket hvit linje) er skissert i A'-C'. Skalastenger viser 10 μm. Fremre er til venstre, og bakre er til høyre. (A) Ved første gangs punkt (t = 0 min) i bildeserien er nisjeceller ferdig montert på gonad fremre og er på et tidlig stadium av komprimering. (B) Midtveis i bildeserien og komprimeringsprosessen (t = 1 t 48 min), har nisjen begynt å sirkulærisere, men kanten forblir uregelmessig. (C) Nær slutten av bildeserien (t = 4 t 21 min), har nisjen en svært glattet, sirkulærisert grense. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under gonadogenesis gjennomgår den embryonale gonad, og spesielt stamcellenisjen i den mannlige gonad15, raske morfologiske endringer. Utviklingsmekanismer som ligger til grunn for disse dynamiske endringene, forstås best gjennom live-avbildningsteknikker. Men ved embryonal trinn 17 blir in vivo-avbildning av gonad gjort umulig ved utbruddet av store muskelsammentrekninger17. Med denne protokollen gir vi et vellykket alternativ: disseksjon av gonadene direkte på en bilderett for ex vivo live-imaging. Denne protokollen presenterer den eneste metoden som er tilgjengelig for å oppnå live-avbildning av senfase embryonal gonad.
De kritiske trinnene i protokollen bør utføres med et akutt fokus på fingerferdighet og timing. Før disseksjon er rask montering av embryoer avgjørende for å sikre at embryoene ikke dehydrerer og forblir sunne og turgid, noe som letter devitellinisering og disseksjon. Under disseksjonen er det viktig å unngå forstyrrelse av gonadal ekstracellulær matrise, som oppnås ved hjelp av bare delikate og presise manipulasjoner. Bruk av slik fingerferdighet vil også sikre at gonad er i direkte kontakt med bildebehandlingsfatet, og dermed muliggjør klar bildebehandling direkte gjennom dekslene. Etter disseksjonen må Ringers løsning byttes for bildemedier ved hjelp av bare skånsom sug og utvisning med pipette for å forhindre gonad dislodgement. Til slutt er det viktig å begrense den totale disseksjonstiden til 25 min. Dette sikrer at tiden som brukes i Ringers løsning under disseksjon, og plassering av vevet på konfekten, er begrenset til en ikke-giftig eksponering. Med økt praksis vil disseksjonshastigheten bli bedre, og personalisering av disseksjonssekvensen vil skje. Vår erfaring er at tilstrekkelig disseksjon kan oppnås etter omtrent en uke med regelmessig praksis, med full mestring av disseksjonen som kan oppnås om ca. 1 måned. For å lette læringen anbefaler vi å øve på individuelle trinn før du utfører hele protokollen.
Det finnes en rekke beste praksiser som forbedrer utfordringene knyttet til denne protokollen, og starter med genotypen til embryoene som brukes til disseksjon. Inkorporering av flere kopier av transgene som brukes til å markere gonad vil gjøre gonad lysere, og derfor lettere å visualisere og dissekere. Disseksjonen i seg selv fungerer best med en skarp nål, selv om den ikke skal slipes for mye, da den vil bøye seg mot bunnen av bildefatet og bli belastet med fremmedvev. Schneiders bildemedier auto-fluoresces i det grønne utslippsspekteret, noe som gjør det utfordrende å finne gonader merket med GFP når media er lagt til. Derfor er det viktig å bruke den kondokale bildebehandlingsprogramvaren for å markere plasseringen av gonader mens de fortsatt er i Ringers løsning. Hvis det fortsatt er vanskelig å finne gonader på konfekten, foreslår vi etter neste disseksjon å skissere eller ta et bilde av den relative plasseringen av gonader i parabolen mens du fortsatt er på disseksjonsmikroskopet. Merk deretter utsiden av parabolen for å indikere orienteringen under disseksjonen, og match denne retningen når du går over til konfektmikroskopet. Når du er plassert på konfekten, hvis en gonad virker forstyrret eller ødelagt, i neste disseksjon prøv å forlate mer tilhengervev rundt gonad. Tvert imot, hvis en gonad er til stede, men virker uklar gjennom alle fly, er det sannsynlig vev mellom dekslene og gonaden, og fremtidige disseksjoner bør strebe etter bedre isolasjon av gonaden fra det tilhørende vevet. Vår erfaring er at det å ta i bruk denne praksisen har lagt til rette for læring og gjennomføring av denne protokollen.
Under dannelsen av denne protokollen identifiserte vi flere endringer som kunne brukes. For nisjekomprimeringsstudier tar vi sikte på å dissekere embryoer på trinn 16. På dette stadiet har embryoet ennå ikke utviklet betydelige mengder kutikal, og holder seg lett til den polylyinbelagte parabolen. Denne teknikken kan imidlertid modifiseres for å dissekere eldre embryoer med kutikyl ved å stikke dem til den indre veggen i den polylyinbelagte regionen for det første snittet. Når indre vev er utsatt, vil embryokroppen holde seg til polylyinen, og disseksjonen kan fortsette som normalt. I tillegg til justeringer for embryoalder har vi justert denne teknikken for å dissekere flere genotyper i samme tallerken. For eksempel kan homozygote mutanter skilles fra søsken heterozygoter ved bruk av en lett merkbar markør som deformert-YFP på balanserekromosomet. Etter devitellinisering skal embryoer overføres til hver side av dekslet basert på tilstedeværelsen eller fraværet av markøren. Disseksjonen bør fortsette nedover i parabolen som beskrevet i protokollen, med ekstra forsiktighet for å opprettholde segregering av forskjellige genotyper. Denne protokollen kan også potensielt endres til å bruke annet kulturmedium enn Schneiders, selv om en overfladisk undersøkelse av Shields og Sang M3 Insect Media ga uunngåelige gonader (data ikke vist). I tillegg parer denne protokollen seg godt med farmakologiske manipulasjoner ved ganske enkelt å kombinere stoffet med bildemediene. Over en 5 h periode med avbildning, kan re-addisjon av stoff være nødvendig for å opprettholde en effektiv konsentrasjon. Til slutt, selv om denne protokollen ble utviklet med den hensikt å visualisere nisjekomprimering, et fenomen som er spesifikt for mannlige gonader, kan denne protokollen i teorien også implementeres for å live-image den utviklende eggstokken ved ganske enkelt å dissekere og avbilde gonader som mangler en nisje og msSGPer.
Begrensninger knyttet til denne teknikken er knyttet til lengden på dyrkingstid, og kulturens eksvivo natur. Som det er tilfellet med midtstadiet Drosophila eggkamre30, begynner kultiverte gonader å dø etter ca 5 h ex vivo live-imaging, bevist ved tap av vevsintegritet (kjerner blir pyknotiske og cellemembraner krymper). Dermed, hvis man ønsket å utforske senere hendelser i den mannlige gonad, måtte man dissekere gonader fra første instar eller eldre larver ved å gjøre endringer i protokollen som presenteres her, og deretter bilde de under forhold som ligner de som presenteres her. Vi utelukker imidlertid ikke muligheten for ex vivo live-imaging de siste fem timene hvis forbedrede kulturforhold utvikles, selv om det kan være en grense hvis mekaniske signaler fra embryoet er nødvendige for gonadutvikling. Kanskje den mest alvorlige ulempen ved teknikken skyldes dens iboende ex vivo natur. Når dyrket ex vivo, celler kan ha unaturlig potensial som er upretensiøs av in vivo biologi31. I tillegg kan finesser av kultiveringsmiljøer, inkludert medieinnhold og matrisestivhet, ha drastisk innflytelse over celleatferd32. Med denne følsomheten i tankene er det viktig å sikre at kultiveringsforholdene nøyaktig reflekterer in vivobiologi . Vi har iverksatt tiltak for å bevitne at in vivo nisjeutvikling og signalering er recapitulated ex vivo17. Kort sagt, vi konstaterte at nisjecelle skjebne opprettholdes og antall nisjeceller er uendret ved hjelp av markørene Fasciclin-III og E-cadherin. STAT-signalering er også til stede, og bakterie stamceller deler ortogonalt, noe som tyder på at nisjefunksjonalitet opprettholdes. Vi har imidlertid ikke bekreftet at den relevante in vivo-biologien forblir intakt i andre, ikke-nisjevev i gonad. Fremtidige ex vivo undersøkelser av disse andre vev bør inkludere en omfattende analyse for å sikre at dette faktisk er tilfelle.
En fremtidig retning man kan ta med denne protokollen vil omfatte inkorporering av en barriere i bilderetten, slik at en disseksjonsøkt kan inneholde både en kontrollgruppe og en narkotikabehandlingsgruppe. Denne forbedringen vil tillate minimering av feil mellom tekniske repliker, og dermed forbedre vitenskapelig strenghet.
Det er ingen andre sanne alternativer til denne protokollen, da det er den eneste metoden som er tilgjengelig for å undersøke live-hendelsene i dette organet under sen embryonal utvikling. Som sådan er tidligere ubesvarte spørsmål om gonad morphogenesis nå tilgjengelige med dette fremskrittet. Disse spørsmålene inkluderer vanskelighetene ved celledelinger, cytoskeletale endringer og celleinterkaleringshendelser som styrer stamcellenisjedannelse og gonadogenesis. Ingen av disse hendelsene kan oppdages i stillbildene av disse prosessene som er anskaffet ved hjelp av en fix-and-stain-teknikk. Totalt sett låser denne metoden opp muligheten for å undersøke dynamikken i den sene embryonale Drosophila gonad, og et slikt gjennombrudd har sterke implikasjoner for fremme av et utall biologiske felt, inkludert stamcelle-nisjebiologi, piRNA-biologi og organogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil takke Lindsey W. Plasschaert og Justin Sui for deres betydelige bidrag til den tidlige utviklingen av denne protokollen. Forfatterne er takknemlige for flysamfunnet for deres generøsitet med reagenser, og spesielt til Ruth Lehmann og Benjamin Lin for deres gave av nos5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3 'linje før utgivelsen. Aksjer hentet fra Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537) ble brukt i denne studien. Dette arbeidet ble støttet av NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 og R35GM136270 (S.D.) samt opplæringsstipend T32GM007229 (B.W.) og F32GM125123 (L.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
References
- Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science. 301, 1547-1550 (2003).
- Inaba, M., Yuan, H., Salzmann, V., Fuller, M. T., Yamashita, Y. M. E-Cadherin is required for centrosome and spindle orientation in Drosophila male germline stem cells. PLoS One. 5, 1-7 (2010).
- Lenhart, K. F., DiNardo, S. Somatic cell encystment promotes abscission in germline stem cells following a regulated block in cytokinesis. Developmental Cell. 34, 192-205 (2015).
- Hardy, R. W., Tokuyasu, K. T., Lindsley, D. L., Garavito, M. The Germinal Proliferation Center in the Testis of Drosophila melanogaster. Journal of Ultrastructure Research. 69, 180-190 (1979).
- Fuller, M. T. Spermatogenesis. The Development of Drosophila Melanogaster. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
- Lin, H., Spradling, A. C. A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Development. 124, 2463-2476 (1997).
- Emilie, Q., Amit, A., Kai, T. The piRNA pathway is developmentally regulated during spermatogenesis in Drosophila. RNA. 22, 1044-1054 (2016).
- Marie, P. P., Ronsseray, S., Boivin, A. From embryo to adult: PiRNA-mediated silencing throughout germline development in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7, 505-516 (2017).
- Michel, M., Raabe, I., Kupinski, A. P., Pérez-Palencia, R., Bökel, C. Local BMP receptor activation at adherens junctions in the Drosophila germline stem cell niche. Nature Communications. 2, (2011).
- Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
- Leatherman, J. L., Dinardo, S. Zfh-1 controls somatic stem cell self-renewal in the Drosophila testis and nonautonomously influences germline stem cell self-renewal. Cell Stem Cell. 3, 44-54 (2008).
- Leatherman, J. L., DiNardo, S. Germline self-renewal requires cyst stem cells, while stat regulates niche adhesion in Drosophila testes. Nature Cell Biology. 12, (2010).
- Tulina, N., Matunis, E. Control of stem cell self-renewal in Drosophila Spermatogenesis by JAK-STAT signaling. Science. 294, 2546-2549 (2001).
- Gonczy, P., Viswanathan, S., Dinardo, S. Probing spermatogenesis in Drosophila with P-element enhancer detectors. Development. 114, 89-98 (1992).
- Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Developmental Biology. 294, 92-103 (2006).
- Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in drosophila testis. Current Protocols in Stem Cell Biology. 0331, 1-9 (2009).
- Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche. Developmental Biology. 446, 102-118 (2019).
- Rebecca Sheng, X., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
- Aboim, A. N. Developpement embryonnaire et post-embryonnaire des gonades normales et agametiques de Drosophila melanogaster. Revue Suisse De Zoologie. 52, 53 (1945).
- Sano, H., et al. The Drosophila actin regulator ENABLED regulates cell shape and orientation during gonad morphogenesis. PLoS One. 7, (2012).
- Clark, I. B. N., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Devlopmental Biology. 7, 1-9 (2007).
- Sheng, X. R., Brawley, C. M., Matunis, E. L. Dedifferentiating spermatogonia outcompete somatic stem cells for niche occupancy in the Drosophila testis. Cell Stem Cell. 5, 191-203 (2009).
- Tanentzapf, G., Devenport, D., Godt, D., Brown, N. H. Europe PMC Funders Group integrin-dependent anchoring of a stem cell niche. Nature Cell Biology. 9, 1413-1418 (2007).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically a motorized molluscicide dispenser. Bulletin of the World Health Organization. , 105-106 (1960).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- JoVE. Embryo and Larva Harvesting and Preparation. JoVE Science Education Database. , (2020).
- Cold Spring Harbor Protocols. Ringer's solution for Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).
- Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase. Current Biology. 17, 237-243 (2007).
- Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo. Nature Communications. 11, 1-16 (2020).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
- Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro. Neuron. 40, 485-499 (2003).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
