Summary
Här tillhandahåller vi ett dissektionsprotokoll som krävs för att levandebilda den sena embryonala Drosophila manliga gonaden. Detta protokoll kommer att möjliggöra observation av dynamiska cellulära processer under normala förhållanden eller efter transgen eller farmakologisk manipulation.
Abstract
Drosophila melanogaster manlig embryonal gonad är en fördelaktig modell för att studera olika aspekter av utvecklingsbiologi inklusive, men inte begränsat till, bakteriecellsutveckling, piRNA-biologi och nischbildning. Här presenterar vi en dissektionsteknik för att levandebilda gonaden ex vivo under en period då in vivo live-imaging är mycket ineffektiv. Detta protokoll beskriver hur man överför embryon till en bildskål, väljer lämpligt iscensatta manliga embryon och dissekerar gonaden från dess omgivande vävnad samtidigt som den bibehåller sin strukturella integritet. Efter dissektion kan gonader avbildas med hjälp av ett konfokalmikroskop för att visualisera dynamiska cellulära processer. Dissektionsproceduren kräver exakt timing och fingerfärdighet, men vi ger insikt i hur man förhindrar vanliga misstag och hur man kan övervinna dessa utmaningar. Såvitt vi vet är detta det första dissektionsprotokollet för Drosophila embryonala gonad, och kommer att tillåta levande avbildning under ett annars otillgängligt tidsfönster. Denna teknik kan kombineras med farmakologiska eller celltypsspecifika transgena manipulationer för att studera eventuella dynamiska processer som förekommer inom eller mellan cellerna i deras naturliga gonadala miljö.
Introduction
Drosophila melanogaster testiklarna har fungerat som ett paradigm för vår förståelse av många dynamiska cellulära processer. Studier av denna modell har belyst stamcellsdelningsreglering 1,2,3, bakteriecellsutveckling 4,5, piRNA-biologi 6,7,8 och nisch-stamcellssignaleringshändelser 9,10,11,12,13. Denna modell är fördelaktig eftersom den är genetiskt dragbar14,15 och är en av få där vi kan levandebilda stamceller i deras naturliga miljö 3,16,17,18. Levande avbildning av denna modell har dock begränsats till vuxen vävnad och tidiga embryonala stadier, vilket lämnar ett gap i vår kunskap om gonadal dynamik i det sena embryot, det exakta stadiet när nischen först bildas och börjar fungera.
Den embryonala gonaden i sent stadium är en sfär som består av somatiska nischceller vid den främre och könsceller encysterade av somatiska gonadala celler i mer bakre regioner19. Detta organ kan avbildas levande in vivo fram till tidigt embryonalt stadium 17 17,20,21. Ytterligare avbildning förhindras på grund av initiering av storskaliga muskelkontraktioner. Dessa sammandragningar är så allvarliga att de skjuter gonaden ut ur bildramen, och sådan rörelse kan inte korrigeras med bildprogramvara. Vårt laboratorium är intresserat av att avslöja mekanismerna för nischbildning, som uppstår under denna svårfångade period för levande avbildning. Därför genererade vi ett ex vivo-tillvägagångssätt för levande bild gonaden som börjar vid embryonalt stadium 16, vilket underlättar studien av celldynamiken under denna avgörande period av gonadutveckling. Tidigare arbete från vårt labb visar att denna ex vivo-avbildning troget rekapitulerar in vivo gonadutveckling17. Denna teknik är den första och enda i sitt slag för Drosophila embryonala gonad.
Här presenterar vi dissektionsprotokollet som krävs för ex vivo live-avbildning av gonaden under sena embryonala stadier. Detta protokoll kan kombineras med farmakologiska behandlingar eller transgen manipulation av specifika cellinjer inom gonaden. Med hjälp av denna teknik har vi framgångsrikt avbildat stegen för stamcellsnischbildning17. Denna avbildningsmetod är således avgörande för området stamcellsbiologi, eftersom det kommer att möjliggöra visualisering av de inledande stadierna av nischbildning i realtid inom dess naturliga miljö15,17. Även om denna metod är fördelaktig för stamcellsbiologi, är den dessutom tillämplig för att visualisera alla dynamiska processer som förekommer i gonaden under denna utvecklingstidpunkt, inklusive cellulära omarrangemang22, celladhesion 2,12,23 och cellmigration23. Detta dissektionsprotokoll kommer således att öka vår förståelse för många grundläggande cellbiologiska processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse dag före dissektion
- Elektrolytiskt skärpa en volframnål24 så att den resulterande diametern är ungefär 0,03 mm. Justera den medföljande spänningen till cirka 14 V och använd 3,3 M NaOH. Skärpning bör inte ta mer än 1 eller 2 min.
VARNING: NaOH är mycket frätande och kommer att orsaka brännskador vid kontakt med huden. Använd handskar och skyddsglasögon under hantering och arbeta inuti en dragskåp.
OBS: Efter användning, förvara NaOH i ett polypropylen Falcon-rör. - Gör det förberedda bildmediet. I ett 15 ml koniskt rör, kombinera 4,25 ml av Schneiders media med 750 μl fetalt bovint serum (FBS, 15% slutkoncentration) och 27,5 μl penicillin-streptomycin (0,05 U / μl penicillin, 0,05 μg / μl slutkoncentration). Förvara detta beredda bildmedium vid 4 °C.
- Gör heptanlimlösning. Tillsätt cirka 0,5 ml heptan till en 20 ml förslutningsbar injektionsflaska fylld med cirka 20 cm dubbelhäftande tejp. Rocka på en nutator i ungefär en timme, eller rör om med en pipettspets tills en konsistens mellan vatten och glycerol uppnås. Denna lösning av upplöst lim kommer att pågå i flera dagar innan heptan avdunstar. För att fräscha upp lösningen, tillsätt ytterligare 0,5 ml heptan och sten.
OBS: En effektiv heptanlimlösning kan framställas med användning av olika förhållanden mellan heptan och tejp, samt varierande varaktigheter av gungning / omrörning. Ovanstående specifikationer är bara förslag för att förbereda eller fräscha upp en sådan adekvat lösning.
2. Embryosamling— 15–17 timmar före dissektion
- Tillsätt färsk jästpasta på en äppeljuiceagarplatta25. Sätt upp en embryosamlingsbur genom att lägga till vuxna flugor (mindre än 10 dagar gamla) till en tom matflaska, perforerad med små hål26. Täck uppsamlingsburen med den jästa agarplattan, tejpad på flaskan, och placera buren med plattan nedåt i en 25 ° C mörk inkubator i 1 timme.
OBS: Flugorna måste uttrycka en transgen som fluorescerande markerar gonaden, till exempel sex4-eGFP::Moesin20, eftersom dissektion av embryon kommer att ske under ett stereolysrörsmikroskop. Se materialtabell för en lista över genotyper som används för att markera gonaden. - Ta bort buret från inkubatorn och kassera denna första samling. Byt ut den med en nyjäst agarplatta och placera buret tillbaka i inkubatorn i 2 h.
OBS: Den första embryosamlingen används för att rensa honor från befruktade, utvecklande embryon, för att uppnå en tätt tidsinställd andra samling embryon. - Ta bort agarplattan från buren och placera den (med jäst sida vänd uppåt) på en fuktig pappershandduk inuti en förslutbar plastbehållare. Placera denna fuktiga kammare i en 25 °C kuvös för att lagra embryona i 14,5 timmar (slutåldrar, 14,5–16,5 timmar efter äggläggning).
OBS: Omedelbart innan du börjar steg 2.4, slutför steg 3.1 och 3.2. - Ta bort agarplattan från inkubatorn och tillsätt tillräckligt med vatten till agarplattan med en sprutflaska för att lösa upp jästpastan genom att borsta lätt med en pensel. Skölj embryona och lös jäst i en liten maskig skärmkorg som sitter i en vägbåt. Skölj korgen med vattensprutflaskan tills de flesta jästpasta har filtrerats genom nätet.
- Ta bort vattnet från vägbåten och placera korgen tillbaka inuti. Dechorionate embryona genom att nedsänka dem i en 50% blekmedelslösning med en sprutflaska. Blekmedelslösningen ska ha ett djup av 3-5 mm. Håll embryona nedsänkta i blekmedel i ~ 2 minuter, med enstaka virvlande.
VARNING: Blekmedel är frätande och kan irritera eller skada ögon och luftvägar. Använd handskar och skyddsglasögon när du hanterar blekmedel.
OBS: Under denna tid, slutför så mycket som möjligt av steg 3.3. Dechorionationsförloppet kan kontrolleras genom att placera korgen under ett stereomikroskop och kontrollera frånvaron av dorsala bilagor. Sänk ner embryona i blekmedelslösningen ytterligare tid, om det behövs. - Kassera blekmedlet och skölj embryona noggrant inuti korgen med vatten från en sprutflaska (i ~ 3 s, blotta nätkorgen med pappershanddukar; upprepa 2–3 gånger).
3. Förberedelse av dissektionsdag
- Tillsätt 30 μL insulin (10 mg/ml) till 1 500 μl beredda bildmedier (se steg 1.2) i ett 1,5 ml Eppendorf-rör (0,2 mg/ml slutlig koncentration). Blanda väl och låt röret stå på bänkskivan för att balansera till rumstemperatur.
- Förbered täckglasremsor belagda med lim.
- Använd en kniv med diamantspets för att skära ett 22 mm x 22 mm överdrag i fyra lika stora remsor (figur 1A).
- Använd pincett för att plocka upp en remsa och sprid totalt cirka 30 μL heptanlimlösning på båda sidor av remsan (figur 1B). För att uppnå ett jämnt lager av limrester, luta remsan i olika vinklar medan heptan avdunstar.
- Förvara den limtäckta remsan i en tom slits på en täckglaslåda; För att bibehålla klibbigheten, placera remsan i ett lutande men upprätt läge, lutat mot lådans kanter för att minimera kontakt med lådytor (figur 1C). Stäng lådan så att partiklar i luften inte täcker limet och minskar dess klibbighet.
- Placera följande föremål på bänkskivan: en 6-tums Pasteur-pipett i glas, ett mikroskopglas, en P200- och en P1000-pipettman med lämpliga pipettspetsar, Ringers lösning27 (pH justerat till 7,3 med NaOH) och en avtäckt, Poly-D-lysinbelagd 35 mm bildskål.
- Överför embryon från nätskärmskorgen till ett litet klockglas fyllt med 500–750 μl heptan.
- Torka sidorna och botten av korgen torr med en vävnadsservett. Fukta en pensel i heptan, rör penseln mot embryona (det hydrofoba vitellinmembranet ska fästa vid borsten) och doppa penseln tillbaka i heptan i klockglaset (embryon ska sjunka till botten).
OBS: Nästa steg måste utföras så snabbt som möjligt för att förhindra att embryona torkar ut. Embryon bör inte utsättas för luft i mer än 20 s.
- Torka sidorna och botten av korgen torr med en vävnadsservett. Fukta en pensel i heptan, rör penseln mot embryona (det hydrofoba vitellinmembranet ska fästa vid borsten) och doppa penseln tillbaka i heptan i klockglaset (embryon ska sjunka till botten).
- Överför embryona till mikroskopglaset med en Pasteur-pipett (figur 1D). Dra embryon långsamt in i pipetten och begränsa dem till den smala delen av pipetten. Pipettera embryon långsamt på bilden, så att de samlas precis innanför pipettens spets innan de rinner ut på bilden. Vrid hörnet av en vävnadsservett till en fin spets och transportera bort heptan från embryon på bilden. De kommer att aggregera och täcka ett mindre område, vilket gör det lättare att fånga dem på en limtäckt remsa i nästa steg.
- Med pincett, plocka upp en limtäckt remsa och rör den försiktigt mot embryona (figur 1E). Placera remsan i bildskålen, embryosidan uppåt och strax utanför poly-D-lysin-belagda centrum. Tryck på remsan på skålen med pincett för att säkerställa att den sitter fast på plats. Översvämma omedelbart skålen med 2–3,5 ml Ringers lösning; sänk ner embryona först för att förhindra att de torkar ut (figur 1F).
4. Dissektion
OBS: Dessa steg måste utföras under ett stereolysrörsmikroskop.
- Devitellinisera 10-15 embryon.
OBS: Detta kan sträcka sig från två embryon, för nybörjare, till femton embryon, för experter.- Välj steg 16-embryon baserat på tarmmorfologi (figur 2). I detta skede har embryon tre tarmförträngningar som skapar fyra staplade tarmsegment (figur 2B,B'). För att börja devitellinisering, genomborra det valda embryot i ena änden, helst den främre, med volframnålen. Embryot kan dyka upp ur sitt vitellinmembran, men om inte, skala membranet från embryot.
OBS: Embryon som är för unga för att dissekera har icke-regionaliserade tarmar (figur 2C). Dissektion av embryon i steg 17 är möjlig, men mer utmanande än dissektion av embryon i steg 16 eftersom nagelbandet börjar utvecklas i detta skede. Embryon i tidigt stadium 17 finns med fyra tarmsegment som förskjuts i förhållande till varandra (figur 2D,D'). - Haka nålen genom embryot i en region långt ifrån gonaderna. Överför det krokade embryot till det poly-lysinbelagda området i skålen (härifrån och framåt kallat helt enkelt "täckglidning") och dra det mot botten tills det fäster. Upprepa dessa steg och ordna devitelliniserade embryon i rad längs toppen av den poly-lysinbelagda täckglidningen (figur 3A), vilket ger gott om utrymme nedan för ytterligare dissektion.
OBS: Gonaderna visas som små sfäriska aggregat av celler som ska fluorescera starkt, beroende på den specifika markören som används och transgenkopieringsnummer. I detta skede ligger gonaderna i sidled i segment A5, vid cirka 70%-80% av embryolängden från främre. Under hela dissektionsprotokollet kan vävnaden hålla fast vid nålen. För att befria nålen från skräpet, lyft den strax ovanför ytan på Ringers lösning. Devitellinisering kan vara stökigt så länge gonaden störs så lite som möjligt.
- Välj steg 16-embryon baserat på tarmmorfologi (figur 2). I detta skede har embryon tre tarmförträngningar som skapar fyra staplade tarmsegment (figur 2B,B'). För att börja devitellinisering, genomborra det valda embryot i ena änden, helst den främre, med volframnålen. Embryot kan dyka upp ur sitt vitellinmembran, men om inte, skala membranet från embryot.
- Finslipa gonaderna ur embryot och på skålen (figur 3C,D).
- Först fileta embryot för att exponera dess inre (figur 3C). Skär genom embryot från dess centrum, flytta nålen bakåt, mellan gonaderna. Reta ut lite inre vävnad, eftersom detta kommer att hålla fast vid skålen mycket bättre än den yttre nagelbandet. Vävnadens klibbighet gör det möjligt för nästa manipuleringar att avslöja gonaden och låta den fästa vid täckglidningen.
OBS: Om vävnad inte fastnar på skålen, försök att locka den till ett oförorenat område av den belagda täckglidningen; de yttre områdena på täckglidningen kommer att vara särskilt klibbiga. Som anges i steg 4.1.2 spelar det ingen roll om dissektionsmanipulationerna resulterar i en manglad embryokropp, så länge gonaderna förblir oskadda. - Använd nålen för att skära runt en gonad tills en bit vävnad, inklusive gonaden, separeras från den återstående slaktkroppen. Med nålen drar du denna vävnad till ett nytt område med belagd täckglidning och lirkar den mot botten tills den fäster vid skålen.
OBS: Den bästa avbildning kommer att uppnås för de fall där gonaden själv fäster direkt på täckglidningen, snarare än indirekt fastsättning via överliggande vävnad. Därför, när vävnaden styrs bort från slaktkroppen, försök att få gonaden att röra vid locket först, snarare än främmande vävnad. - Ta bort så mycket omgivande vävnad från gonaden som möjligt (figur 3D) genom att försiktigt dra bort vidhäftande vävnad från gonaden med nålen. Undvik att röra vid gonaden direkt, vilket skulle skada den (figur 4E). För att säkerställa att gonaden är tillräckligt fäst vid skålen, flytta nålen i en mild cirkulär rörelse runt gonaden - om den rör sig, rör nålen till den återstående vidhäftande vävnaden och rikta gonaden mot en ny region med klibbig täckglidning. Upprepa denna process tills det inte finns någon detekterbar rörelse av gonaden.
- Återgå till embryokroppen och dissekera ut den andra gonaden. Upprepa denna process på så många embryon som möjligt men överskrid INTE 25 min. Vävnadens livskraft kommer att äventyras i Ringers lösning efter mer än ~ 40–45 min.
- Först fileta embryot för att exponera dess inre (figur 3C). Skär genom embryot från dess centrum, flytta nålen bakåt, mellan gonaderna. Reta ut lite inre vävnad, eftersom detta kommer att hålla fast vid skålen mycket bättre än den yttre nagelbandet. Vävnadens klibbighet gör det möjligt för nästa manipuleringar att avslöja gonaden och låta den fästa vid täckglidningen.
- När dissektionerna är klara använder du en outplånlig markör för att lägga till registreringsmärken på bildskålens yttre kant för att registrera dess orientering under dissektion.
- Ta bort den limbelagda remsan från skålen.
- Sätt försiktigt in bottenstiftet på ett par pincett under remsan, lås och luta långsamt remsan uppåt för att frigöra den från skålen med så lite sloshing av Ringers lösning som möjligt för att minimera störningar av de vidhäftade gonaderna.
OBS: Remsan ska lutas bort från de dissekerade gonaderna.
- Sätt försiktigt in bottenstiftet på ett par pincett under remsan, lås och luta långsamt remsan uppåt för att frigöra den från skålen med så lite sloshing av Ringers lösning som möjligt för att minimera störningar av de vidhäftade gonaderna.
- Bär försiktigt skålen till bildmikroskopet på ett sätt som undviker att Ringers lösning slopas.
5. Bildbehandling
- Placera bildskålen i scenhållaren med hjälp av registreringsmärkena för att placera skålen i ungefärlig riktning som under dissektion. Med hjälp av ljusfältsmikroskopi och ett mål med låg effekt (~ 10x) kan du identifiera och fokusera på alla bitar av vävnad som är fästa vid täckglidningen. Byt okularinställningarna för att avslöja fluorescens, och använd de binokulära okularen, skanna systematiskt skålen och markera positionen för varje gonad i bildprogramvaran (se materialtabell).
OBS: Se till att gonader är centrerade i synfältet innan du markerar positioner. - Ta försiktigt bort hela steghållaren med bildskålen i hållaren och placera enheten på arbetsbänken.
- Byt ut Ringers lösning mot det beredda bildmediet som innehåller insulin (se steg 1.2 och 3.1).
- Använd en P1000 för att ta bort all Ringers lösning från den inre övre avsatsen på bildskålen (pipettera inte Ringer från det centrala täckglidområdet). Byt sedan till en P200 och placera dess spets strax under ytan på de återstående ringerarna i det centrala området. Ta försiktigt bort 50–100 μl ringer; ta INTE bort hela lösningen.
- Rita upp ~ 200 μL bildmedia och placera igen P200-spetsen precis under ytan på de återstående Ringers, lägg långsamt till detta bildmedium. Lägg sedan till det återstående bildmediet (~ 1 300 μL) i skålen, med början vid den övre avsatsens yttersta kant. Medan du pipetterar, rör dig mot vätskans centrala kupol och slå så småningom samman de två genom att borsta pipettspetsen över dem båda. Placera locket på skålen.
OBS: Bildmediet bör täcka hela skålens innerdiameter, med ett djup på cirka 2 mm, för att förhindra avdunstning (figur 4D).
- Byt mikroskopet till ett högre effektmål (63x, 1.2 NA), applicera rätt nedsänkningsvätska baserat på det använda målet (nedsänkningsvätsketyp och brytningsindex som krävs av målet) och byt sedan ut steghållarenheten. Använd brightfield-mikroskopi för att fokusera på vävnad som fästs på botten av bildskålen.
OBS: Om scenen inte flyttades bör den sista gonaden komma i sikte när målet är fokuserat. - Gå igenom varje markerad gonadposition och justera den positionen efter behov. Välj vilka gonader som ska avbildas baserat på bildklarhet, gonadsex etc. Anpassa bildinställningarna (flerkanaliga, exponeringstider, laserintensiteter, steg i Z-serien, tidsfördröjning med lämpliga intervall etc.). Börja avbilda.
OBS: Manliga gonader kan identifieras genom närvaron av både en nisch och i motsatt ände av gonaden, ett kluster av små, mycket cirkulära somatiska celler som kallas manliga specifika somatiska gonadprekursorer (msSGP). Om den sex4-eGFP::moesin fluorescerande markören används är nischcellerna de näst ljusaste cellerna i gonaden, den ljusaste är msSGP: erna. I detta skede har kvinnliga gonader varken en nisch eller msSGP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi illustrerar beredningen av bildskålen i figur 1, som beskrivs i "Dissektionsdagsberedning". Dessa metoder bör i slutändan resultera i välhydrerade embryon som fästs på en täckglidremsa, som tillfälligt fixeras på botten av skålen och nedsänks i Ringers lösning (figur 1F). En kniv med diamantspets gör att man rent kan skära ett 22 x 22 mm lock glida i tre till fyra mindre remsor (figur 1A). När vi hanterar dessa remsor med pincett använder vi en pipett för att överföra tillräckligt med heptanlim för att belägga dessa remsor, vilket ger dem en självhäftande, texturerad yta (figur 1B). De belagda remsorna förvaras enkelt i en tom locklåda för att hålla de självhäftande ytorna rena i upp till 2 timmar (figur 1C). När dessa belagda remsor är gjorda är målet att fästa embryon till remsan i ett aggregat, nära remsans långa kant (figur 1E). Det är nödvändigt att först överföra några embryon från klockglaset till en ren glasskiva och torka dem (figur 1D). Använd sedan snabbt pincett för att försiktigt röra den belagda remsan till embryona så att de fäster (figur 1E). Vi trycker sedan omedelbart remsan till botten av dissektionsskålen med embryon uppåt och täcker embryona med Ringers lösning (figur 1F). Om detta mål uppnås kommer visning av embryon under ett traditionellt ljusfältsteremkrooskop att avslöja helt hydratiserade, friska embryon i deras vitellinmembran (figur 1G). Om processen att överföra dessa embryon till remsan och täcka dem med lösning i stället tar mer än cirka 30 s, kommer embryona att dehydrera och bli slappa (figur 1G'). Slappa embryon är inte friska och är otroligt utmanande att dissekera, så det är viktigt att arbeta effektivt under denna process.
Figur 1: Montering och hydratisering av embryon före dissektion. (A–F) Steg för att fästa embryon på en remsa av limbelagd täckglas och fästa remsan i en bildskål. (A) Coverslip görs en gång med diamantspetsad kniv (kniv indikerad med pilspets) för att skapa en remsa. (B) Applicering av heptanlim på avskuren täckglasremsa, som hålls med ett par pincett. (C) Fyra limbelagda remsor som torkar i en täckglaslåda. (D–E) Pilar pekar på embryon. D) Dechorionerade embryon som har samlats i heptan och utvisats på kanten av ett mikroskopglas. Överskott av heptan avlägsnades med en kimwipe. (E) Limbelagd remsa med embryon fästa. (F) Den slutliga inställningen av skålen omedelbart före dissektion. Notera det grunda lagret av Ringers lösning (pilspets) och placeringen av remsan (pilen) ovanför den inre dissektionscirkeln. (G–G') Embryon klibbade på remsan i skålen. (G) Korrekt hydratiserade, turgid embryon. (G') Embryon som har blivit uttorkade på grund av långvarig luftexponering, vilket framgår av kollapsade vitellinmembran. Asterisker indikerar slappa embryon. Skalstängerna är 0,5 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Att titta på ett embryo under ett stereolysrörsmikroskop möjliggör tydlig visualisering av tarmen, som automatiskt fluorescerar i GFP-kanalen. Gut morfologi fungerar som en proxy för embryonal ålder när man väljer embryon att dissekera. Eftersom embryon som fäster vid täcklisten kommer att variera något i ålder, kommer de att presentera en mängd olika tarmmorfologier (figur 2A). För att leva-bild gonad nischmorfogenes dissekerar vi tidiga stadium 16-embryon. Dessa embryon presenterar fyra regionaliserade tarmsektioner som staplas i en jämn rad (figur 2B ', prickade linjer). Yngre embryon presenterar en säckliknande, icke-regionaliserad tarm (figur 2C) och har ännu inte tillräcklig extracellulär matris (ECM) runt sina gonader för att möjliggöra effektiv odling av det intakta organet. Äldre embryon som redan har börjat nischkomprimera presenterar fyra tarmregioner som inte är jämnt staplade och istället förskjuts i förhållande till varandra (figur 2D', prickade linjer). Dessa embryon har tjockare nagelband, vilket gör dissektionsprocessen mer utmanande.
Figur 2: Välja embryon i lämplig ålder för gonaddissektion. Embryon fastnade på en limbelagd täckglas före dissektion. Embryon uttrycker sex4-eGFP::moesin (grön), som markerar gonad- och fettkroppscellerna. Observera att tarmen automatiskt fluorescerar i grönt. Pilar indikerar manliga gonader (urskiljs av närvaron av starkt fluorescerande msSGP) som är synliga i varje panel. Skalstänger indikerar 0,25 mm. (A) Embryon av olika steg. (B–D) Embryon av distinkta stadier i mitten av bilden, orienterade med främre till vänster och dorsala uppåt. (B) Ett embryo i tidigt stadium 16 som har lagrats på lämpligt sätt för dissektion. (B') De fyra staplade tarmregionerna indikeras med prickade vita linjer. (C) Ett stadium 15-embryo som är för ungt för att dissekera (nedre embryot). Observera att den fluorescerande tarmsäcken precis framför gonaden ännu inte har diskreta regioner. (D) Ett embryo i sent stadium 16 som är svårt att dissekera på grund av att det utvecklar nagelband. Observera att de fyra tarmregionerna har börjat rotera i förhållande till varandra som förberedelse för tarmslinga. (D') De fyra tarmregionerna beskrivs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Det är viktigt att dissekera embryon som uttrycker en outplånlig fluorescerande markör i gonaden, och denna markör måste vara synlig under ett stereo-fluorescerande mikroskop. Här har vi valt att använda six4-eGFP::moesin20 för att markera gonaden (Figur 2 och Figur 3, pilar) för visualisering under dissektion.
Vi illustrerar gonaddissektionsprocessen i figur 3. Dissektion av embryon i lämpligt stadium på den poly-lysinbelagda skålen möjliggör ren isolering av gonaderna från dessa embryon (figur 3D). Embryon som devitelliniseras kommer att fästa vid skålen och kan ordnas i en lämplig rad före dissektion (figur 3A). Embryodevitellinisering och överföring till poly-lysin är en oprecis process så att vävnad kan extruderas från embryokroppens gränser (se vävnadsbit mellan embryo 1 och embryo 2 och manglat embryo 4; Figur 3A). Denna oprecision har ingen betydelse, så länge gonaderna förblir oskadda. Ett vanligt stereolysrörsmikroskop möjliggör identifiering av gonaden i den devitelliniserade embryokroppen (figur 3B, pil). De första manipuleringarna med en skarp dissektionsnål bör separera gonaderna från embryokroppen, även om viss auto-fluorescerande vävnad kommer att förbli vidhäftad (Figur 3C). Ytterligare manipuleringar resulterar i isolerade gonader som fäster direkt på den belagda skålen (figur 3D).
Figur 3: Dissektionsprocessen. (A–D) Embryon som uttrycker sex4-eGFP::moesin (grön) i sekventiella stadier i dissektionsprotokollet. (A) Fyra devitelliniserade embryon som har överförts till skålens poly-lysinbelagda dissektionsområde. Observera hur embryona är inriktade i en snygg rad för att underlätta successiva nedåtdissektioner i skålen. Den lilla vävnadsbiten mellan embryon 1 och 2 är en del av tarmen från embryo 2, extruderad under handdevitellinisering. B) Högre förstoringsvy av embryot från (A), markerat med asterisken. C) Den återstående slaktkroppen av ett embryo som har fileats längs mittlinjen. Pilspetsen indikerar en ockluderad gonad, fortfarande starkt inbäddad i embryonala vävnader. (D) En helt dissekerad gonad. Observera att endast minimal främmande vävnad (pilspets) förblir nära gonaden. Pilar pekar på manliga gonader. Skalstängerna är 0,25 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
När gonaderna har dissekerats kan man ersätta Ringers lösning med bildmedia och bildodlade gonader direkt i samma maträtt som används för dissektion. Vi använder ett spinndiskkonfokalmikroskop. Brightfield-visualisering av en isolerad gonad på ett konfokalmikroskop avslöjar en mörk skugga som omger gonadperiferin (figur 4A–B, pilar), vilket är ECM som upprätthåller gonadens integritet under avbildning. Vi presenterar ett exempel på en hälsosam, välkulturerad gonad som uttrycker GFP-märkt F-aktin i somatiska gonadala celler20 och en RFP-märkt histonmarkör för att visualisera alla kärnor28 (figur 4C–C'). Eftersom alla celler i detta embryo uttrycker RFP-histonmarkören observeras både gonadala celler och celler i annan vidhäftande vävnad vid visning av röd emission. Vi urskiljer gränserna för gonaden med hjälp av den gonadspecifika GFP-markören (figur 4C ', kontur). Det är uppenbart att denna odlade gonad är frisk eftersom gonadgränsen är slät och rund (figur 4C ', kontur), och eftersom gonadala celler har jämna nivåer av RFP -histonfluorescens genom kärnor (figur 4C ', pil). Om gonader istället inte är tillräckligt hydratiserade under avbildning kan kärnor och sex4-eGFP::moesinfluorescens punkteras (figur 4D, pil) när gonadvävnaden krymper. Vidare, om gonaden ECM skadas för mycket under dissektion, äventyras gonadgränsen, vilket framgår av närvaron av gonadspecifika celler (figur 4E, asterisker) utanför gonadens gränser (figur 4E, pil).
Figur 4: Hitta friska gonader under levande avbildning. (A) Låg och (B) ljusfältsvyer med hög förstoring av två dissekerade gonader som fästs vid täckglaset. (C–C') En filmram från ex vivo avbildning av nischkomprimering i en frisk gonad. Somatiska gonadala celler uttrycker sex4-eGFP::moesin (grön), och alla celler uttrycker His2Av-mRFP (röd). (C') Gonadgräns markerad med en vit prickad linje. His2Av-mRFP synlig utanför gonadgränsen är sannolikt fet kropp som fortfarande är fäst vid den dissekerade gonaden. Pilen pekar på en bakteriecellkärna med enhetlig His2Av-mRFP-signal, vilket indikerar att gonaden är frisk. (D–E) Representativa negativa resultat av ex vivo-dissektionsprotokollet. (D) En ram från en avbildningssession där gonaden har uttorkats på grund av medieavdunstning. Notera pyknotiska kärnor när His2Av-mRFP kondenserar (pil) och diskontinuerliga fläckar av sex4-eGFP::moesin längs gonadgränsen. (E) Ex vivo bildram där extracellulär matris har äventyrats under dissektion. Observera att vissa bakterieceller (asterisker) lämnar gonadgränsen (pilen). Könsceller är märkta med nos-lifeact::tdtomato (magenta) och somatiska gonadala celler med sex4-eGFP::moesin (grön). Skalstreck visar 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Gonader kan odlas i cirka 5 timmar med hjälp av denna ex vivo-avbildningsmetod , vilket möjliggör bildförvärv av de dynamiska morfogeneshändelserna som inträffar vid sen embryonal gonadutveckling. I vårt laboratorium har vi framgångsrikt använt detta protokoll för att avbilda komprimeringen av den bildande stamcellsnischen17 (figur 5). Före komprimering är nischen ett löst aggregat av somatiska celler vid gonadens främre (figur 5A, grön), omgiven av könsceller märkta med nos-lifeact::tdtomato29 (se materialtabell), vars första nivå kommer att vara könsstamceller (figur 5A, magenta). Detta nischaggregat presenterar initialt en oregelbunden gräns (figur 5A ', prickad linje). Under hela avbildningsförloppet observerar vi enskilda nischceller som omorganiserar sina positioner medan nischaggregatet får mjukare gränser. Dessa cellulära omarrangemang resulterar också i en minskning av nischområdet (figur 5C). Våra observationer av cellomläggningar och angränsande könscellsdelningar som sker samtidigt med denna utvecklingsfas informerade vår förståelse av mekanismer som ligger till grund för nischkomprimering17. Detta protokoll ger således förmågan att visualisera cellomläggningar, formförändringar, uppdelningar och andra cellulära händelser med den upplösning som krävs för att analysera morfogenetiska händelser i gonader i sent stadium.
Figur 5: En ex vivo odlad gonad som genomgår nischkomprimering. Stillbilder från en bildserie som förvärvats omedelbart efter dissektion av gonader från embryon i tidigt stadium 16. (A–C) Könsceller (magenta) är märkta med nos-lifeact::tdtomato och somatiska gonadala celler (gröna) är märkta med six4-eGFP::moesin. Nischen (prickad vit linje) beskrivs i A'–C'. Skalstreck visar 10 μm. Främre är till vänster och bakre är till höger. (A) Vid den första tidpunktpunkten (t = 0 min) i bildserien har nischceller slutat monteras vid gonadens främre del och befinner sig i ett tidigt kompakteringsstadium. (B) Halvvägs genom bildserien och komprimeringsprocessen (t = 1 h 48 min) har nischen börjat cirkla, men dess kant förblir oregelbunden. (C) Nära slutet av bildserien (t = 4 h 21 min) har nischen en mycket utjämnad, cirkulär gräns. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under gonadogenes genomgår den embryonala gonaden, och särskilt stamcellsnischen inom den manliga gonaden15, snabba morfologiska förändringar. Utvecklingsmekanismer som ligger till grund för dessa dynamiska förändringar förstås bäst genom levande avbildningstekniker. Vid embryonalt stadium 17 omöjliggörs emellertid in vivo-avbildning av gonaden genom uppkomsten av storskaliga muskelsammandragningar17. Med detta protokoll tillhandahåller vi ett framgångsrikt alternativ: dissektion av gonaderna direkt på en bildskål för ex vivo live-imaging. Detta protokoll presenterar den enda tillgängliga metoden för att åstadkomma levande avbildning av den embryonala gonaden i sent stadium.
De kritiska stegen i protokollet bör utföras med ett akut fokus på fingerfärdighet och timing. Före dissektion är snabb montering av embryon av största vikt för att säkerställa att embryona inte dehydrerar och förblir friska och grumliga, vilket underlättar devitellinisering och dissektion. Under dissektion är det viktigt att undvika störningar i den gonadala extracellulära matrisen, vilket uppnås med endast känsliga och exakta manipuleringar. Användning av sådan fingerfärdighet kommer också att säkerställa att gonaden är i direkt kontakt med bildskålen, vilket möjliggör tydlig avbildning direkt genom täckglaset. Efter dissektion måste Ringers lösning bytas mot bildmedia med endast försiktig sugning och utdrivning med en pipett för att förhindra att gonad lossnar. Slutligen är det viktigt att begränsa den totala dissektionstiden till 25 min. Detta säkerställer att den tid som spenderas i Ringers lösning under dissektion och placeringen av vävnaden vid konfokalen är begränsad till en giftfri exponering. Med ökad övning kommer dissektionshastigheten att förbättras och personalisering av dissektionssekvensen kommer att ske. Enligt vår erfarenhet kan tillräcklig dissektion uppnås efter ungefär en veckas regelbunden övning, med full behärskning av dissektionen som kan uppnås på cirka 1 månad. För att underlätta inlärningen rekommenderar vi att du övar enskilda steg innan du kör hela protokollet.
Det finns ett antal bästa metoder som förbättrar utmaningarna i samband med detta protokoll, med början i genotypen för de embryon som används för dissektion. Införlivande av flera kopior av transgenen som används för att markera gonaden kommer att göra gonaden ljusare och därför lättare att visualisera och dissekera. Dissektionen i sig fungerar bäst med en vass nål, även om den inte bör skärpas alltför mycket, eftersom den kommer att böjas mot botten av bildskålen och bli belastad med främmande vävnad. Schneiders bildmedier fluorescerar automatiskt i det gröna emissionsspektrumet, vilket gör det utmanande att hitta gonader märkta med GFP när mediet har lagts till. Därför är det viktigt att använda den konfokala bildprogramvaran för att markera platsen för gonader medan de fortfarande finns i Ringers lösning. Om det fortfarande är svårt att hitta gonader vid konfokalen, föreslår vi efter nästa dissektion att skissa eller ta en bild av den relativa positioneringen av gonader i skålen medan du fortfarande är vid dissektionsmikroskopet. Markera sedan utsidan av skålen för att indikera dess orientering under dissektion och matcha denna orientering vid övergång till konfokalmikroskopet. En gång placerad vid konfokalen, om en gonad verkar störd eller manglad, försök i nästa dissektion att lämna mer vidhäftande vävnad som omger gonaden. Tvärtom, om en gonad är närvarande men verkar suddig i alla plan, finns det sannolikt vävnad mellan täckglaset och gonaden, och framtida dissektioner bör sträva efter bättre isolering av gonaden från den vidhäftande vävnaden. Enligt vår erfarenhet har antagandet av dessa metoder underlättat inlärning och genomförande av detta protokoll.
Under bildandet av detta protokoll identifierade vi flera ändringar som kunde tillämpas. För nischade kompakteringsstudier strävar vi efter att dissekera embryon i steg 16. I detta skede har embryot ännu inte utvecklat betydande mängder nagelband och fastnar lätt på den poly-lysinbelagda skålen. Denna teknik kan dock modifieras för att dissekera äldre embryon med nagelband genom att fästa dem på innerväggen i det poly-lysinbelagda området för det första snittet. När inre vävnader exponeras kommer embryokroppen att hålla fast vid poly-lysinet, och dissektion kan fortsätta som vanligt. Förutom justeringar för embryoålder har vi framgångsrikt justerat denna teknik för att dissekera flera genotyper i samma maträtt. Till exempel kan homozygota mutanter separeras från syskon heterozygoter genom användning av en lätt urskiljbar markör såsom deformerad-YFP på balanskromosomen. Efter devitellinisering ska embryon överföras till vardera sidan av täckglaset baserat på närvaron eller frånvaron av markören. Dissektion bör fortsätta nedåt i skålen enligt beskrivningen i protokollet, med extra försiktighet för att upprätthålla segregering av olika genotyper. Detta protokoll kan också potentiellt modifieras för att använda andra odlingsmedier än Schneiders, även om en ytlig undersökning av Shields och Sang M3 Insect Media gav ogenomförbara gonader (data visas inte). Dessutom passar detta protokoll bra med farmakologiska manipuleringar genom att helt enkelt kombinera läkemedlet med bildmediet. Under en 5-timmarsperiod av avbildning kan återinsättning av läkemedel vara nödvändigt för att upprätthålla en effektiv koncentration. Slutligen, även om detta protokoll utvecklades med avsikt att visualisera nischkomprimering, ett fenomen som är specifikt för manliga gonader, kan detta protokoll i teorin också implementeras för att levande avbilda den utvecklande äggstocken genom att helt enkelt dissekera och avbilda gonader som saknar en nisch och msSGP.
Begränsningar förknippade med denna teknik avser odlingstidens längd och kulturens ex vivo-natur . Som det är fallet med mellanstadiet Drosophila äggkammare30, börjar odlade gonader dö efter cirka 5 h av ex vivo live-avbildning, vilket framgår av förlust av vävnadsintegritet (kärnor blir pyknotiska och cellmembran skrumpnar). Således, om man ville utforska händelser i senare skeden hos den manliga gonaden, skulle man behöva dissekera gonader från 1: a instar eller äldre larver genom att göra ändringar i protokollet som presenteras här och sedan avbilda dem under förhållanden som liknar dem som presenteras här. Vi utesluter dock inte möjligheten till ex vivo live-avbildning efter fem timmar om förbättrade odlingsförhållanden utvecklas, även om det kan finnas en gräns om mekaniska signaler inifrån embryot är nödvändiga för gonadutveckling. Den kanske allvarligaste nackdelen med tekniken beror på dess inneboende ex vivo-natur . När de odlas ex vivo kan celler ha onaturlig potential som inte är representativ för in vivo-biologi 31. Dessutom kan subtiliteter av odlingsmiljöer, inklusive medieinnehåll och matrisstyvhet, ha drastiskt inflytande över cellbeteende32. Med denna känslighet i åtanke är det viktigt att se till att odlingsförhållandena korrekt återspeglar in vivo-biologin . Vi har vidtagit åtgärder för att intyga att nischutveckling och signalering in vivo rekapituleras ex vivo17. Kortfattat konstaterade vi att nischcellens öde upprätthålls och antalet nischceller är oförändrat med hjälp av markörerna Fasciclin-III och E-cadherin. STAT-signalering är också närvarande och könsstamceller delar sig ortogonalt, vilket tyder på att nischfunktionalitet bibehålls. Vi har dock inte verifierat att den relevanta in vivo-biologin förblir intakt i andra, icke-nischade vävnader i gonaden. Framtida ex vivo-undersökningar av dessa andra vävnader bör omfatta en omfattande analys för att säkerställa att så verkligen är fallet.
En framtida riktning man kan ta med detta protokoll skulle inkludera införlivande av en barriär i bildskålen, så att en dissektionssession kan innehålla både en kontrollgrupp och en läkemedelsbehandlingsgrupp. Denna förbättring skulle möjliggöra minimering av fel mellan tekniska replikat, vilket förbättrar den vetenskapliga noggrannheten.
Det finns inga andra sanna alternativ till detta protokoll, eftersom det är den enda tillgängliga metoden för att undersöka levande händelser hos detta organ under sen embryonal utveckling. Som sådan är tidigare obesvarbara frågor om gonadmorfogenes nu tillgängliga med detta framsteg. Dessa frågor inkluderar komplikationerna med celldelningar, cytoskelettförändringar och cellinterkalationshändelser som styr stamcellsnischbildning och gonadogenes. Ingen av dessa händelser kan detekteras i stillbilderna av dessa processer som förvärvats med hjälp av en fix-and-stain-teknik. Sammantaget låser denna metod upp möjligheten att undersöka dynamiken i den sena embryonala Drosophila-gonaden , och ett sådant genombrott har starka konsekvenser för utvecklingen av en myriad av biologiska fält, inklusive stamcellsnischbiologi, piRNA-biologi och organogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Lindsey W. Plasschaert och Justin Sui för deras betydande bidrag till den tidiga utvecklingen av detta protokoll. Författarna är tacksamma mot flugsamhället för deras generositet med reagenser, och särskilt till Ruth Lehmann och Benjamin Lin för deras gåva av nr5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nr3 'linje före publiceringen. Lager erhållna från Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537) användes i denna studie. Detta arbete stöddes av NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 och R35GM136270 (S.D) samt utbildningsbidrag T32GM007229 (B.W.) och F32GM125123 (LA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
References
- Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science. 301, 1547-1550 (2003).
- Inaba, M., Yuan, H., Salzmann, V., Fuller, M. T., Yamashita, Y. M. E-Cadherin is required for centrosome and spindle orientation in Drosophila male germline stem cells. PLoS One. 5, 1-7 (2010).
- Lenhart, K. F., DiNardo, S. Somatic cell encystment promotes abscission in germline stem cells following a regulated block in cytokinesis. Developmental Cell. 34, 192-205 (2015).
- Hardy, R. W., Tokuyasu, K. T., Lindsley, D. L., Garavito, M. The Germinal Proliferation Center in the Testis of Drosophila melanogaster. Journal of Ultrastructure Research. 69, 180-190 (1979).
- Fuller, M. T. Spermatogenesis. The Development of Drosophila Melanogaster. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
- Lin, H., Spradling, A. C. A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Development. 124, 2463-2476 (1997).
- Emilie, Q., Amit, A., Kai, T. The piRNA pathway is developmentally regulated during spermatogenesis in Drosophila. RNA. 22, 1044-1054 (2016).
- Marie, P. P., Ronsseray, S., Boivin, A. From embryo to adult: PiRNA-mediated silencing throughout germline development in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7, 505-516 (2017).
- Michel, M., Raabe, I., Kupinski, A. P., Pérez-Palencia, R., Bökel, C. Local BMP receptor activation at adherens junctions in the Drosophila germline stem cell niche. Nature Communications. 2, (2011).
- Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
- Leatherman, J. L., Dinardo, S. Zfh-1 controls somatic stem cell self-renewal in the Drosophila testis and nonautonomously influences germline stem cell self-renewal. Cell Stem Cell. 3, 44-54 (2008).
- Leatherman, J. L., DiNardo, S. Germline self-renewal requires cyst stem cells, while stat regulates niche adhesion in Drosophila testes. Nature Cell Biology. 12, (2010).
- Tulina, N., Matunis, E. Control of stem cell self-renewal in Drosophila Spermatogenesis by JAK-STAT signaling. Science. 294, 2546-2549 (2001).
- Gonczy, P., Viswanathan, S., Dinardo, S. Probing spermatogenesis in Drosophila with P-element enhancer detectors. Development. 114, 89-98 (1992).
- Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Developmental Biology. 294, 92-103 (2006).
- Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in drosophila testis. Current Protocols in Stem Cell Biology. 0331, 1-9 (2009).
- Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche. Developmental Biology. 446, 102-118 (2019).
- Rebecca Sheng, X., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
- Aboim, A. N. Developpement embryonnaire et post-embryonnaire des gonades normales et agametiques de Drosophila melanogaster. Revue Suisse De Zoologie. 52, 53 (1945).
- Sano, H., et al. The Drosophila actin regulator ENABLED regulates cell shape and orientation during gonad morphogenesis. PLoS One. 7, (2012).
- Clark, I. B. N., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Devlopmental Biology. 7, 1-9 (2007).
- Sheng, X. R., Brawley, C. M., Matunis, E. L. Dedifferentiating spermatogonia outcompete somatic stem cells for niche occupancy in the Drosophila testis. Cell Stem Cell. 5, 191-203 (2009).
- Tanentzapf, G., Devenport, D., Godt, D., Brown, N. H. Europe PMC Funders Group integrin-dependent anchoring of a stem cell niche. Nature Cell Biology. 9, 1413-1418 (2007).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically a motorized molluscicide dispenser. Bulletin of the World Health Organization. , 105-106 (1960).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- JoVE. Embryo and Larva Harvesting and Preparation. JoVE Science Education Database. , (2020).
- Cold Spring Harbor Protocols. Ringer's solution for Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).
- Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase. Current Biology. 17, 237-243 (2007).
- Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo. Nature Communications. 11, 1-16 (2020).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
- Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro. Neuron. 40, 485-499 (2003).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
