Summary
Hier stellen wir ein Sezierprotokoll zur Verfügung, das erforderlich ist, um die spätembryonale Drosophila-Gonade live zu fotografieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Beobachtung dynamischer zellulärer Prozesse unter normalen Bedingungen oder nach transgener oder pharmakologischer Manipulation.
Abstract
Die männliche embryonale Gonade Drosophila melanogaster ist ein vorteilhaftes Modell, um verschiedene Aspekte der Entwicklungsbiologie zu untersuchen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Entwicklung von Keimzellen, die piRNA-Biologie und die Nischenbildung. Hier stellen wir eine Seziertechnik vor, um die Gonade ex vivo in einer Zeit live abzubilden, in der die Live-Bildgebung in vivo höchst ineffektiv ist. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Embryonen in eine Bildgebungsschale transferiert, geeignete männliche Embryonen auswählt und die Gonade aus ihrem umgebenden Gewebe seziert, während ihre strukturelle Integrität erhalten bleibt. Nach der Dissektion können Gonaden mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet werden, um dynamische zelluläre Prozesse zu visualisieren. Das Sezierverfahren erfordert präzises Timing und Geschicklichkeit, aber wir geben Einblicke, wie häufige Fehler vermieden und diese Herausforderungen überwunden werden können. Unseres Wissens ist dies das erste Dissektionsprotokoll für die embryonale Drosophila-Gonade und ermöglicht Live-Imaging während eines ansonsten unzugänglichen Zeitfensters. Diese Technik kann mit pharmakologischen oder zelltypspezifischen transgenen Manipulationen kombiniert werden, um dynamische Prozesse zu untersuchen, die innerhalb oder zwischen den Zellen in ihrer natürlichen Gonadenumgebung ablaufen.
Introduction
Die Drosophila melanogaster testis hat als Paradigma für unser Verständnis vieler dynamischer zellulärer Prozesse gedient. Studien dieses Modells haben Aufschluss über die Stammzellteilungsregulation 1,2,3, die Keimzellentwicklung4,5, die piRNA-Biologie 6,7,8 und die Nischenstammzell-Signalisierungsereignisse 9,10,11,12,13 gegeben. Dieses Modell ist vorteilhaft, weil es genetisch behandelbar ist14,15 und eines der wenigen ist, bei denen wir Stammzellen in ihrer natürlichen Umgebung live darstellenkönnen 3,16,17,18. Die Live-Bildgebung dieses Modells war jedoch auf adultes Gewebe und frühe Embryonalstadien beschränkt, was eine Lücke in unserem Wissen über die Gonadendynamik im späten Embryo hinterlässt, dem genauen Stadium, in dem sich die Nische zum ersten Mal bildet und zu funktionieren beginnt.
Die embryonale Gonade im Spätstadium ist eine Kugel, die aus somatischen Nischenzellen im vorderen Bereich und Keimzellen besteht, die von somatischen Gonadenzellen in hintereren Regioneneingestreut werden 19. Dieses Organ kann live in vivo bis zum frühen Embryonalstadium 17 17,20,21 abgebildet werden. Eine weitere Bildgebung wird durch die Einleitung großflächiger Muskelkontraktionen verhindert. Diese Kontraktionen sind so stark, dass sie die Gonade aus dem Bildgebungsrahmen drücken, und eine solche Bewegung kann nicht mit einer Bildgebungssoftware korrigiert werden. Unser Labor ist daran interessiert, die Mechanismen der Nischenbildung aufzudecken, die während dieser schwer fassbaren Zeit für die Live-Bildgebung auftritt. Daher haben wir einen Ex-vivo-Ansatz entwickelt, um die Gonade ab dem Embryonalstadium 16 live abzubilden, was die Untersuchung der Zelldynamik während dieser entscheidenden Phase der Gonadenentwicklung erleichtert. Frühere Arbeiten aus unserem Labor zeigen, dass diese Ex-vivo-Bildgebung in vivo Gonadenentwicklung originalgetreu rekapituliert17. Diese Technik ist die erste und einzige ihrer Art für die embryonale Gonade Drosophila.
Hier stellen wir das Dissektionsprotokoll vor, das für die Ex-vivo-Live-Bildgebung der Gonade in späten Embryonalstadien erforderlich ist. Dieses Protokoll kann mit pharmakologischen Behandlungen oder transgener Manipulation spezifischer Zelllinien innerhalb der Gonade kombiniert werden. Mit dieser Technik haben wir die Schritte der Stammzellnischenbildung erfolgreich abgebildet17. Dieser bildgebende Ansatz ist daher für das Gebiet der Stammzellbiologie von entscheidender Bedeutung, da er die Visualisierung der Anfangsstadien der Nischenbildung in Echtzeit in seiner natürlichen Umgebung ermöglicht15,17. Während diese Methode für das Gebiet der Stammzellbiologie von Vorteil ist, ist sie zusätzlich anwendbar, um dynamische Prozesse zu visualisieren, die während dieses Entwicklungszeitpunkts in der Gonade auftreten, einschließlich zellulärer Umlagerungen 22, Zelladhäsion2, 12, 23 und Zellmigration23. Dieses Sezierprotokoll wird somit unser Verständnis vieler grundlegender zellbiologischer Prozesse verbessern.
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Protocol
1. Vorbereitung am Tag vor der Dissektion
- Eine Wolframnadel24 elektrolytisch schärfen, so dass der resultierende Durchmesser ca. 0,03 mm beträgt. Stellen Sie die gelieferte Spannung auf ca. 14 V ein und verwenden Sie 3,3 M NaOH. Das Schärfen sollte nicht länger als 1 oder 2 Minuten dauern.
VORSICHT: NaOH ist stark korrosiv und verursacht Verbrennungen bei Kontakt mit der Haut. Tragen Sie beim Handling Handschuhe und Schutzbrillen und arbeiten Sie in einer Dunstabzugshaube.
HINWEIS: Nach Gebrauch NaOH in einem Falcon-Rohr aus Polypropylen aufbewahren. - Stellen Sie die vorbereiteten Bildmedien her. Kombinieren Sie in einem konischen 15-ml-Röhrchen 4,25 ml Schneider-Medien mit 750 μL fetalem Rinderserum (FBS, 15% Endkonzentration) und 27,5 μL Penicillin-Streptomycin (0,05 U/μL Penicillin, 0,05 μg/μL Endkonzentration). Lagern Sie dieses vorbereitete Bildmedium bei 4 °C.
- Stellen Sie Heptan-Klebstoff-Lösung her. Fügen Sie etwa 0,5 ml Heptan zu einer 20 ml verschließbaren Durchstechflasche hinzu, die mit etwa 20 cm doppelseitigem Klebeband gefüllt ist. Etwa eine Stunde lang auf einem Nutator schaukeln oder mit einer Pipettenspitze umrühren, bis eine Konsistenz zwischen Wasser und Glycerin erreicht ist. Diese Lösung von gelöstem Kleber hält mehrere Tage, bevor das Heptan verdunstet. Um die Lösung aufzufrischen, fügen Sie ein zusätzliches 0,5 ml Heptan und Gestein hinzu.
HINWEIS: Eine effektive Heptankleberlösung kann unter Verwendung verschiedener Verhältnisse von Heptan zu Band sowie unterschiedlicher Schaukel- / Rührdauer hergestellt werden. Die oben genannten Spezifikationen sind lediglich Vorschläge zur Vorbereitung oder Auffrischung einer solchen geeigneten Lösung.
2. Embryonenentnahme – 15–17 h vor der Dissektion
- Fügen Sie frische Hefepaste zu einer Apfelsaft-Agarplatte25 hinzu. Stellen Sie einen Embryo-Sammelkäfig auf, indem Sie erwachsene Fliegen (weniger als 10 Tage alt) in eine leere Futterflasche geben, die mit kleinen Löchern26 perforiert ist. Verschließen Sie den Sammelkäfig mit der mit Hefe versehenen Agarplatte, die an die Flasche geklebt ist, und stellen Sie den Käfig mit der Tellerseite nach unten für 1 Stunde in einen 25 °C dunklen Inkubator.
HINWEIS: Die Fliegen müssen ein Transgen exprimieren, das die Gonade fluoreszierend markiert, zum Beispiel six4-eGFP::Moesin 20, da die Dissektion von Embryonen unter einemstereofluoreszierenden Mikroskop stattfindet. Siehe Tabelle der Materialien für eine Liste der Genotypen, die zur Markierung der Gonade verwendet werden. - Entfernen Sie den Käfig aus dem Inkubator und verwerfen Sie diese erste Sammlung. Ersetzen Sie es durch eine frisch gehegte Agarplatte und legen Sie den Käfig für 2 Stunden wieder in den Inkubator.
HINWEIS: Die erste Embryonensammlung wird verwendet, um Weibchen von befruchteten, sich entwickelnden Embryonen zu befreien, um eine eng getaktete zweite Sammlung von Embryonen zu erreichen. - Entfernen Sie die Agarplatte aus dem Käfig und legen Sie sie (mit Hefeseite nach oben) auf ein feuchtes Papiertuch in einem verschließbaren Kunststoffbehälter. Legen Sie diese feuchte Kammer in einen 25 ° C-Inkubator, um die Embryonen für 14,5 h zu altern (Endalter, 14,5-16,5 h nach der Eiablage).
HINWEIS: Führen Sie unmittelbar vor Beginn von Schritt 2.4 die Schritte 3.1 und 3.2 aus. - Entfernen Sie die Agarplatte aus dem Inkubator und fügen Sie mit einer Spritzflasche genügend Wasser in die Agarplatte ein, um die Hefepaste aufzulösen, indem Sie sie leicht mit einem Pinsel bürsten. Spülen Sie die Embryonen und die gelöste Hefe in einen kleinen Netzsiebkorb, der in einem Wiegeboot sitzt. Spülen Sie den Korb mit der Wasserspritzflasche ab, bis die meiste Hefepaste durch das Netz gefiltert ist.
- Entfernen Sie das Wasser vom Wiegeboot und legen Sie den Korb wieder hinein. Dechorionieren Sie die Embryonen, indem Sie sie mit einer Spritzflasche in eine 50% ige Bleichlösung tauchen. Die Bleichlösung sollte eine Tiefe von 3–5 mm haben. Halten Sie die Embryonen für ~ 2 min in Bleichmittel getaucht, mit gelegentlichem Wirbeln.
VORSICHT: Bleichmittel ist korrosiv und kann Augen und Atemwege reizen oder schädigen. Tragen Sie Handschuhe und Schutzbrillen, während Sie mit Bleichmittel umgehen.
HINWEIS: Führen Sie während dieser Zeit Schritt 3.3 so weit wie möglich aus. Der Dechorionationsfortschritt kann überprüft werden, indem der Korb unter ein Stereomikroskop gestellt und auf das Fehlen der dorsalen Anhängsel überprüft wird. Tauchen Sie die Embryonen bei Bedarf für zusätzliche Zeit in die Bleichlösung. - Entsorgen Sie das Bleichmittel und spülen Sie die Embryonen im Korb gründlich mit Wasser aus einer Spritzflasche aus (für ~ 3 s, den Netzkorb mit Papiertüchern abtupfen; 2-3 Mal wiederholen).
3. Vorbereitung auf den Tag der Sezierung
- 30 μL Insulin (10 mg/ml) in 1.500 μL präparierte Bildgebungsmedien (siehe Schritt 1.2) in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen (0,2 mg/ml Endkonzentration) geben. Gut mischen und das Rohr auf der Tischplatte lassen, um es auf Raumtemperatur auszugleichen.
- Bereiten Sie mit Kleber beschichtete Deckglasstreifen vor.
- Verwenden Sie ein Messer mit Diamantspitze, um ein 22 mm x 22 mm großes Deckglas in vier gleich große Streifen zu schneiden (Abbildung 1A).
- Verwenden Sie eine Pinzette, um einen Streifen aufzunehmen und insgesamt etwa 30 μL Heptankleberlösung auf beiden Seiten des Bandes zu verteilen (Abbildung 1B). Um eine gleichmäßige Schicht aus Leimrückständen zu erreichen, neigen Sie den Streifen in verschiedenen Winkeln, während das Heptan verdunstet.
- Lagern Sie den mit Leim überzogenen Streifen in einem leeren Schlitz einer Deckglasschachtel; Um seine Klebrigkeit zu erhalten, platzieren Sie den Streifen in einer schrägen, aber aufrechten Position und lehnen Sie sich an die Kanten des Kastens, um den Kontakt mit den Kastenoberflächen zu minimieren (Abbildung 1C). Schließen Sie die Box, damit Partikel in der Luft den Kleber nicht beschichten und seine Klebrigkeit verringern.
- Legen Sie die folgenden Gegenstände auf die Tischplatte: eine 6-Zoll-Pasteur-Pipette aus Glas, einen Objektträger, eine P200- und eine P1000-Pipette mit den entsprechenden Pipettenspitzen, Ringer-Lösung27 (pH-Wert eingestellt auf 7,3 mit NaOH) und eine unbedeckte, Poly-D-Lysin-beschichtete 35-mm-Bildschale.
- Übertragen Sie Embryonen aus dem Netzsiebkorb in ein kleines Uhrenglas, das mit 500–750 μL Heptan gefüllt ist.
- Die Seiten und den Boden des Korbes mit einem Taschentuch trocken tupfen. Befeuchten Sie einen Pinsel im Heptan, berühren Sie den Pinsel mit den Embryonen (die hydrophobe Vitellinmembran sollte an den Borsten haften) und tauchen Sie den Pinsel wieder in das Heptan im Uhrenglas (Embryonen sollten zu Boden sinken).
HINWEIS: Die nächsten Schritte müssen so schnell wie möglich durchgeführt werden, um ein Austrocknen der Embryonen zu verhindern. Embryonen sollten nicht länger als 20 s der Luft ausgesetzt werden.
- Die Seiten und den Boden des Korbes mit einem Taschentuch trocken tupfen. Befeuchten Sie einen Pinsel im Heptan, berühren Sie den Pinsel mit den Embryonen (die hydrophobe Vitellinmembran sollte an den Borsten haften) und tauchen Sie den Pinsel wieder in das Heptan im Uhrenglas (Embryonen sollten zu Boden sinken).
- Die Embryonen werden mit einer Pasteur-Pipette auf den Objektträger übertragen (Abbildung 1D). Ziehen Sie Embryonen langsam in die Pipette und beschränken Sie sie auf den schmalen Teil der Pipette. Pipettenembryonen langsam auf den Objektträger, so dass sie sich direkt in der Spitze der Pipette aggregieren, bevor sie auf den Objektträger fließen. Drehen Sie die Ecke eines Gewebewischtuchs in eine feine Spitze und leiten Sie Heptan von Embryonen auf dem Objektträger ab. Sie aggregieren und bedecken eine kleinere Fläche, wodurch es einfacher wird, sie im nächsten Schritt auf einem mit Leim bedeckten Streifen zu erfassen.
- Nehmen Sie mit einer Pinzette einen mit Leim bedeckten Streifen auf und berühren Sie ihn vorsichtig mit den Embryonen (Abbildung 1E). Legen Sie den Streifen in die Bildgebungsschüssel, mit der Embryonenseite nach oben und direkt außerhalb des Poly-D-Lysin-beschichteten Zentrums. Drücken Sie den Streifen mit einer Pinzette auf die Schale, um sicherzustellen, dass er an Ort und Stelle fixiert ist. Sofort die Schale mit 2–3,5 ml Ringer-Lösung überfluten; Tauchen Sie zuerst in die Embryonen ein, um zu verhindern, dass sie austrocknen (Abbildung 1F).
4. Sezieren
HINWEIS: Diese Schritte müssen unter einem stereofluoreszierenden Mikroskop durchgeführt werden.
- Devitellinisieren Sie 10-15 Embryonen.
HINWEIS: Dies kann von zwei Embryonen für Anfänger bis zu fünfzehn Embryonen für Experten reichen.- Wählen Sie Embryonen im Stadium 16 basierend auf der Darmmorphologie aus (Abbildung 2). In diesem Stadium haben Embryonen drei Darmverengungen, die vier gestapelte Darmsegmente erzeugen (Abbildung 2 B, B'). Um mit der Devitellinisierung zu beginnen, durchbohren Sie den ausgewählten Embryo an einem Ende, vorzugsweise am vorderen Ende, mit der Wolframnadel. Der Embryo kann aus seiner Vitellinmembran herausspringen, aber wenn nicht, schälte die Membran vom Embryo ab.
HINWEIS: Embryonen, die zu jung sind, um sie zu sezieren, haben nicht regionalisierte Eingeweide (Abbildung 2C). Die Dissektion von Embryonen im Stadium 17 ist möglich, aber schwieriger als die Dissektion von Embryonen im Stadium 16, da sich die Kutikula in diesem Stadium zu entwickeln beginnt. Embryonen im Frühstadium 17 mit vier Darmsegmenten, die relativ zueinander verschoben sind (Abbildung 2D,D'). - Haken Sie die Nadel durch den Embryo in einer Region, die weit von den Gonaden entfernt ist. Übertragen Sie den hakenförmigen Embryo in die mit Polylysin beschichtete Region der Schale (von hier an einfach als "Deckblatt" bezeichnet) und ziehen Sie ihn gegen den Boden, bis er anhaftet. Wiederholen Sie diese Schritte und ordnen Sie devitellinisierte Embryonen in einer Reihe entlang der Oberseite des mit Polylysin beschichteten Deckglases an (Abbildung 3A), so dass unten viel Platz für eine weitere Sezierung bleibt.
HINWEIS: Die Gonaden erscheinen als kleine sphärische Aggregate von Zellen, die je nach verwendetem Marker und Transgenkopienzahl hell fluoreszieren sollten. In diesem Stadium befinden sich die Gonaden lateral im Segment A5, bei etwa 70% -80% der Embryonenlänge von vorne. Während des gesamten Dissektionsprotokolls kann das Gewebe an der Nadel haften bleiben. Um die Nadel von den Ablagerungen zu befreien, heben Sie sie direkt über die Oberfläche der Ringer-Lösung. Die Devitellinisierung kann unordentlich sein, solange die eigentliche Gonade so wenig wie möglich gestört wird.
- Wählen Sie Embryonen im Stadium 16 basierend auf der Darmmorphologie aus (Abbildung 2). In diesem Stadium haben Embryonen drei Darmverengungen, die vier gestapelte Darmsegmente erzeugen (Abbildung 2 B, B'). Um mit der Devitellinisierung zu beginnen, durchbohren Sie den ausgewählten Embryo an einem Ende, vorzugsweise am vorderen Ende, mit der Wolframnadel. Der Embryo kann aus seiner Vitellinmembran herausspringen, aber wenn nicht, schälte die Membran vom Embryo ab.
- Finesse die Gonaden aus dem Embryo und auf die Schale (Abbildung 3C,D).
- Filetieren Sie zuerst den Embryo, um sein Inneres freizulegen (Abbildung 3C). Schneiden Sie den Embryo von seiner Mitte durch und bewegen Sie die Nadel nach hinten zwischen den Gonaden. Necken Sie etwas inneres Gewebe heraus, da dieses viel besser an der Schale haften bleibt als die äußere Kutikula. Die Klebrigkeit des Gewebes ermöglicht es den nächsten Manipulationen, die Gonade zu enthüllen und sie am Deckglas haften zu lassen.
HINWEIS: Wenn das Gewebe nicht an der Schale haftet, versuchen Sie, es an einen nicht kontaminierten Bereich des beschichteten Deckglases zu locken. Die äußeren Bereiche des Deckglases werden besonders klebrig sein. Wie in Schritt 4.1.2 erwähnt, spielt es keine Rolle, ob die Dissektionsmanipulationen zu einem verstümmelten Embryokadaver führen, solange die Gonaden unversehrt bleiben. - Verwenden Sie die Nadel, um eine Gonade zu schneiden, bis ein Stück Gewebe, einschließlich der Gonade, vom verbleibenden Kadaver getrennt ist. Ziehen Sie dieses Gewebe mit der Nadel in einen frischen Bereich aus beschichtetem Deckglas und locken Sie es gegen den Boden, bis es an der Schale haftet.
HINWEIS: Die beste Bildgebung wird für die Fälle erreicht, in denen die Gonade selbst direkt am Deckglas befestigt wird, anstatt indirekt über darüber liegendes Gewebe befestigt zu werden. Versuchen Sie daher, wenn das Gewebe vom Kadaver weggeführt wird, dass die Gonade zuerst den Deckslip berührt, anstatt Fremdgewebe. - Entfernen Sie so viel umgebendes Gewebe wie möglich aus der Gonade (Abbildung 3D), indem Sie das anhaftende Gewebe vorsichtig mit der Nadel von der Gonade wegziehen. Vermeiden Sie es, die Gonade direkt zu berühren, da sie beschädigt werden könnte (Abbildung 4E). Um sicherzustellen, dass die Gonade ausreichend an der Schale haftet, bewegen Sie die Nadel in einer sanften kreisförmigen Bewegung um die Gonade - wenn sie sich bewegt, berühren Sie die Nadel mit dem verbleibenden anhaftenden Gewebe und richten Sie die Gonade auf einen frischen Bereich aus klebrigem Deckglas. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis keine Bewegung der Gonade mehr erkennbar ist.
- Kehren Sie zum Embryokadaver zurück und sezieren Sie die zweite Gonade. Wiederholen Sie diesen Vorgang an so vielen Embryonen wie möglich, überschreiten Sie jedoch NICHT 25 Minuten. Die Lebensfähigkeit des Gewebes wird in Ringers Lösung nach mehr als ~ 40-45 Minuten beeinträchtigt.
- Filetieren Sie zuerst den Embryo, um sein Inneres freizulegen (Abbildung 3C). Schneiden Sie den Embryo von seiner Mitte durch und bewegen Sie die Nadel nach hinten zwischen den Gonaden. Necken Sie etwas inneres Gewebe heraus, da dieses viel besser an der Schale haften bleibt als die äußere Kutikula. Die Klebrigkeit des Gewebes ermöglicht es den nächsten Manipulationen, die Gonade zu enthüllen und sie am Deckglas haften zu lassen.
- Nachdem die Dissektionen abgeschlossen sind, verwenden Sie einen unauslöschlichen Marker, um Registrierungsmarkierungen am äußeren Rand der Bildschale hinzuzufügen, um ihre Ausrichtung während der Dissektion aufzuzeichnen.
- Entfernen Sie den mit Leim beschichteten Streifen von der Schale.
- Führen Sie den unteren Stift einer Pinzette vorsichtig unter den Streifen ein, umschließen und neigen Sie den Streifen langsam nach oben, um ihn mit so wenig Schwappen der Ringerlösung wie möglich aus der Schale zu befreien, um die Störung der anhaftenden Gonaden zu minimieren.
HINWEIS: Der Streifen sollte von den sezierten Gonaden weggeneigt werden.
- Führen Sie den unteren Stift einer Pinzette vorsichtig unter den Streifen ein, umschließen und neigen Sie den Streifen langsam nach oben, um ihn mit so wenig Schwappen der Ringerlösung wie möglich aus der Schale zu befreien, um die Störung der anhaftenden Gonaden zu minimieren.
- Tragen Sie die Schale vorsichtig zum bildgebenden Mikroskop, so dass ein Schwappen der Ringerlösung vermieden wird.
5. Bildgebung
- Legen Sie die abbildende Schale in den Bühnenhalter und verwenden Sie die Eintragungszeichen, um die Schale in der ungefähren Ausrichtung wie bei der Dissektion zu platzieren. Identifizieren und fokussieren Sie mit Hilfe der Hellfeldmikroskopie und eines Objektivs mit geringem Stromverbrauch (~ 10x) jedes Stück Gewebe, das auf dem Deckglas haftet. Schalten Sie die Okulareinstellungen um, um die Fluoreszenz anzuzeigen, und scannen Sie mit den binokularen Okularen systematisch die Schale und markieren Sie die Position jeder Gonade in der Bildgebungssoftware (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Gonaden im Sichtfeld zentriert sind, bevor Sie Positionen markieren. - Entfernen Sie vorsichtig die gesamte Bühnenhalterbaugruppe mit der abbildenden Schale in der Halterung, und legen Sie die Baugruppe auf die Werkbank.
- Ersetzen Sie die Lösung des Ringers durch die vorbereiteten bildgebenden Medien, die Insulin enthalten (siehe Schritte 1.2 und 3.1).
- Verwenden Sie einen P1000, um alle Ringer-Lösungen von der inneren oberen Leiste der Bildschale zu entfernen (pipettieren Sie Ringer nicht aus dem zentralen Deckglasbereich). Als nächstes wechseln Sie zu einem P200 und platzieren Sie seine Spitze direkt unter der Oberfläche der verbleibenden Ringer's in der zentralen Region. Entfernen Sie vorsichtig 50–100 μL Ringer's; Entfernen Sie NICHT die gesamte Lösung.
- Ziehen Sie ~ 200 μL Bildmedien auf und platzieren Sie die P200-Spitze wieder direkt unter der Oberfläche der verbleibenden Ringer-Medien, fügen Sie diese Bildgebungsmedien langsam hinzu. Als nächstes fügen Sie die verbleibenden Bildmedien (~ 1.300 μL) in die Schale hinzu, beginnend am äußersten Rand der oberen Kante. Bewegen Sie sich beim Pipettieren in Richtung der zentralen Kuppel der Flüssigkeit und verschmelzen Sie schließlich die beiden, indem Sie die Pipettenspitze über beide streichen. Legen Sie den Deckel auf die Schüssel.
HINWEIS: Bildgebende Medien sollten den gesamten Innendurchmesser der Schale mit einer Tiefe von etwa 2 mm abdecken, um eine Verdunstung zu verhindern (Abbildung 4D).
- Schalten Sie das Mikroskop auf ein Objektiv mit höherer Leistung (63x, 1,2 NA) um, wenden Sie die richtige Tauchflüssigkeit basierend auf dem verwendeten Objektiv an (Tauchflüssigkeitstyp und Brechungsindex für das Objektiv erforderlich) und ersetzen Sie dann die Tischhalterbaugruppe. Verwenden Sie die Hellfeldmikroskopie, um sich auf das Gewebe zu konzentrieren, das am Boden der Bildgebungsschale haftet.
HINWEIS: Wenn die Bühne nicht bewegt wurde, sollte die letzte Gonade in Sicht kommen, sobald das Ziel fokussiert ist. - Gehen Sie durch jede markierte Gonadenposition und passen Sie diese Position bei Bedarf an. Wählen Sie aus, welche Gonaden basierend auf Bildklarheit, Gonadengeschlecht usw. abgebildet werden sollen. Passen Sie die Bildgebungseinstellungen an (Mehrkanal, Belichtungszeiten, Laserintensitäten, Inkremente der Z-Serie, Zeitraffer mit geeigneten Intervallen usw.). Beginnen Sie mit der Bildgebung.
HINWEIS: Männliche Gonaden können durch das Vorhandensein sowohl einer Nische als auch am gegenüberliegenden Ende der Gonade identifiziert werden, einem Cluster kleiner, stark kreisförmiger somatischer Zellen, die als männlich-spezifische somatische Gonadenvorläufer (msSGPs) bezeichnet werden. Wenn der Fluoreszenzmarker six4-eGFP::moesin verwendet wird, sind die Nischenzellen die zweithellsten Zellen in der Gonade, wobei die hellsten die msSGPs sind. In diesem Stadium haben weibliche Gonaden weder eine Nische noch msSGPs.
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Representative Results
Wir veranschaulichen die Zubereitung der bildgebenden Schale in Abbildung 1, wie unter "Tag der Dissektionsvorbereitung" beschrieben. Diese Methoden sollten letztendlich dazu führen, dass gut hydrierte Embryonen an einem Deckglasstreifen haften, der vorübergehend am Boden der Schale befestigt und in Ringers Lösung eingetaucht wird (Abbildung 1F). Ein Messer mit Diamantspitze ermöglicht es, einen 22 x 22 mm großen Deckschlitten sauber in drei bis vier kleinere Streifen zu schneiden (Abbildung 1A). Bei der Handhabung dieser Streifen mit einer Pinzette verwenden wir eine Pipette, um genügend Heptankleber zu übertragen, um diese Streifen zu beschichten, wodurch sie eine haftende, strukturierte Oberfläche erhalten (Abbildung 1B). Die beschichteten Streifen können einfach in einer leeren Deckglasbox aufbewahrt werden, um die Klebeflächen bis zu 2 Stunden sauber zu halten (Abbildung 1C). Sobald diese beschichteten Streifen hergestellt sind, besteht das Ziel darin, Embryonen in einem Aggregat in der Nähe des langen Randes des Streifens an den Streifen zu haften (Abbildung 1E). Es ist notwendig, zunächst einige Embryonen aus dem Uhrenglas auf einen sauberen Glasträger zu übertragen und zu trocknen (Abbildung 1D). Verwenden Sie dann schnell eine Pinzette, um den beschichteten Streifen vorsichtig mit den Embryonen zu berühren, damit sie haften (Abbildung 1E). Wir drücken dann sofort den Streifen mit den Embryonen nach oben auf den Boden der Dissektionsschale und bedecken die Embryonen mit Ringer-Lösung (Abbildung 1F). Wenn dieses Ziel erreicht wird, zeigt die Betrachtung von Embryonen unter einem herkömmlichen Hellfeld-Stereomikroskop vollständig hydratisierte, gesunde Embryonen in ihren Vitellinmembranen (Abbildung 1G). Wenn stattdessen der Prozess des Transfers dieser Embryonen auf den Streifen und des Bedeckens mit Lösung mehr als etwa 30 s dauert, werden die Embryonen dehydrieren und schlaff (Abbildung 1G'). Flockige Embryonen sind nicht gesund und unglaublich schwierig zu sezieren, daher ist es wichtig, während dieses Prozesses effizient zu arbeiten.
Abbildung 1: Einsetzen und Hydratisieren von Embryonen vor der Dissektion. (A–F) Schritte zum Anhaften von Embryonen an einem Streifen aus leimbeschichtetem Deckglas und zum Sichern des Streifens an einer bildgebenden Schale. (A) Coverslip einmal mit einem Messer mit Diamantspitze (Messer durch Pfeilspitze gekennzeichnet) geritzt, um einen Streifen zu erzeugen. (B) Auftragen von Heptankleber auf abgetrennte Deckglasstreifen, die mit einer Pinzette gehalten werden. (C) Vier verklebte Streifen, die in einer Deckglasbox trocknen. (D–E) Pfeile zeigen auf Embryonen. (D) Dechorionierte Embryonen, die in Heptan gesammelt und auf den Rand eines Objektträgers des Mikroskops ausgestoßen wurden. Überschüssiges Heptan wurde mit einem Kimwipe entfernt. (E) Leamtbeschichteter Streifen mit befestigten Embryonen. (F) Die endgültige Einrichtung der Schale unmittelbar vor der Dissektion. Beachten Sie die flache Schicht der Ringer-Lösung (Pfeilspitze) und die Platzierung des Streifens (Pfeil) über dem inneren Sezierkreis. (G–G') Embryonen klebten an dem Streifen in der Schale. (G) Richtig hydratisierte, pralle Embryonen. (G') Embryonen, die aufgrund längerer Lufteinwirkung dehydriert wurden, erkennbar an kollabierten Vitellinmembranen. Sternchen weisen auf schlaffe Embryonen hin. Die Maßstabsbalken sind 0,5 mm groß. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die Betrachtung eines Embryos unter einem stereofluoreszierenden Mikroskop ermöglicht eine klare Visualisierung des Darms, der im GFP-Kanal automatisch fluoresziert. Die Darmmorphologie dient als Stellvertreter für das embryonale Alter bei der Auswahl der zu sezierenden Embryonen. Da Embryonen, die am Streifen des Deckglases haften, im Alter leicht variieren, weisen sie eine Vielzahl von Darmmorphologien auf (Abbildung 2A). Um die Morphogenese in der Gonadennische live abzubilden, sezieren wir Embryonen im frühen Stadium 16. Diese Embryonen weisen vier regionalisierte Darmabschnitte auf, die in einer geraden Reihe gestapelt sind (Abbildung 2B', gepunktete Linien). Jüngere Embryonen weisen einen sackartigen, nicht regionalisierten Darm auf (Abbildung 2C) und verfügen noch nicht über eine ausreichende extrazelluläre Matrix (ECM) um ihre Gonaden, um eine effiziente Kultivierung des intakten Organs zu ermöglichen. Ältere Embryonen, die bereits mit der Nischenverdichtung begonnen haben, weisen vier Darmregionen auf, die nicht gleichmäßig gestapelt sind und stattdessen relativ zueinander verschoben sind (Abbildung 2D', gepunktete Linien). Diese Embryonen haben eine dickere Kutikula, was den Dissektionsprozess schwieriger macht.
Abbildung 2: Auswahl geeigneter gealterter Embryonen für die Gonadendissektion. Embryonen klebten vor der Dissektion an einem mit Klebstoff beschichteten Deckglas. Embryonen exprimieren six4-eGFP::moesin (grün), das die Gonaden- und Fettkörperzellen markiert. Beachten Sie, dass der Darm automatisch grün fluoresziert. Pfeile zeigen männliche Gonaden an (erkennbar an hell fluoreszierenden msSGPs), die in jedem Panel sichtbar sind. Maßstabsstäbe zeigen 0,25 mm an. (A) Embryonen verschiedener Stadien. (B–D) Embryonen verschiedener Stadien in der Mitte des Bildes, ausgerichtet mit anterior nach links und dorsal nach oben. (B) Ein Embryo im Frühstadium 16, der für die Dissektion angemessen gealtert ist. B') Die vier gestapelten Darmregionen sind mit gepunkteten weißen Linien gekennzeichnet. (C) Ein Embryo im Stadium 15, der zu jung ist, um ihn zu sezieren (unterer Embryo). Beachten Sie, dass der fluoreszierende Darmsack direkt vor der Gonade noch keine diskreten Bereiche hat. (D) Ein Embryo im Spätstadium 16, der aufgrund der sich entwickelnden Kutikula schwer zu sezieren ist. Beachten Sie, dass die vier Darmregionen begonnen haben, sich in Vorbereitung auf die Darmschleife relativ zueinander zu drehen. (D') Die vier Darmregionen sind umrissen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Es ist wichtig, Embryonen zu sezieren, die einen unauslöschlichen fluoreszierenden Marker in der Gonade exprimieren, und dieser Marker muss unter einem stereofluoreszierenden Mikroskop sichtbar sein. Hier haben wir uns entschieden, six4-eGFP::moesin 20 zu verwenden, um die Gonade (Abbildung 2 und Abbildung 3, Pfeile) für die Visualisierung während der Dissektion zu markieren.
Wir veranschaulichen den Prozess der Gonadendissektion in Abbildung 3. Die Sezierung von entsprechend inszenierten Embryonen auf der mit Polylysin überzogenen Schale ermöglicht eine saubere Isolierung der Gonaden von diesen Embryonen (Abbildung 3D). Embryonen, die devitellinisiert sind, haften an der Schale und können vor der Dissektion in einer geeigneten Reihe angeordnet werden (Abbildung 3A). Die Devitellinisierung des Embryos und der Transfer auf das Polylysin ist ein unpräziser Prozess, bei dem Gewebe aus den Grenzen des Embryokörpers extrudiert werden kann (siehe Gewebestück zwischen Embryo 1 und Embryo 2 und verstümmeltem Embryo 4; Abbildung 3A). Diese Ungenauigkeit spielt keine Rolle, solange die Gonaden unversehrt bleiben. Ein Standard-Stereofluoreszenzmikroskop ermöglicht die Identifizierung der Gonade innerhalb des devitellinisierten Embryokörpers (Abbildung 3B, Pfeil). Die ersten Manipulationen mit einer scharfen Dissektionsnadel sollten die Gonaden vom Embryokadaver trennen, obwohl etwas autofluoreszierendes Gewebe haften bleibt (Abbildung 3C). Zusätzliche Manipulationen führen zu isolierten Gonaden, die direkt an der beschichteten Schale haften (Abbildung 3D).
Abbildung 3: Der Sezierprozess. (A–D) Embryonen, die six4-eGFP::moesin (grün) in aufeinanderfolgenden Stadien des Dissektionsprotokolls exprimieren. (A) Vier devitellinisierte Embryonen, die in die polylysinbeschichtete Dissektionsregion der Schale übertragen wurden. Beachten Sie, wie die Embryonen in einer ordentlichen Reihe ausgerichtet sind, um sukzessive Abwärtsdissektionen in der Schale zu erleichtern. Das kleine Stück Gewebe zwischen den Embryonen 1 und 2 ist Teil des Darms von Embryo 2, das während der Handverformung extrudiert wird. (B) Ansicht des Embryos mit höherer Vergrößerung von (A), gekennzeichnet durch das Sternchen. c) das verbleibende Schlachtgut eines Embryos, das in der Mittellinie filetiert wurde. Die Pfeilspitze weist auf eine verschlossene Gonade hin, die noch stark in embryonales Gewebe eingebettet ist. (D) Eine vollständig sezierte Gonade. Beachten Sie, dass nur minimales Fremdgewebe (Pfeilspitze) in der Nähe der Gonade verbleibt. Pfeile zeigen auf männliche Gonaden. Die Maßstabsstäbe betragen 0,25 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Sobald die Gonaden seziert sind, kann man die Lösung des Ringers durch bildgebende Medien ersetzen und kultivierte Gonaden direkt in derselben Schale abbilden, die für die Dissektion verwendet wird. Wir verwenden ein konfokales Mikroskop mit rotierender Scheibe. Die Hellfeldvisualisierung einer isolierten Gonade auf einem konfokalen Mikroskop zeigt einen dunklen Schatten, der die Gonadenperipherie umgibt (Abbildung 4A–B, Pfeile), das ECM, das die Integrität der Gonade während der Bildgebung aufrechterhält. Wir präsentieren ein Beispiel für eine gesunde, gut kultivierte Gonade, die GFP-markiertes F-Aktin in somatischen Gonadenzellen20 exprimiert, und einen RFP-markierten Histonmarker zur Visualisierung aller Kerne28 (Abbildung 4C-C'). Da alle Zellen in diesem Embryo den RFP-Histonmarker exprimieren, werden sowohl Gonadenzellen als auch Zellen anderer adhärenter Gewebe bei der Betrachtung der roten Emission beobachtet. Wir erkennen die Grenzen der Gonade anhand des gonadenspezifischen GFP-Markers (Abbildung 4C', Umriss). Es ist klar, dass diese kultivierte Gonade gesund ist, weil die Gonadengrenze glatt und rund ist (Abbildung 4 C', Umriss) und weil Gonadenzellen gleichmäßige RFP-Histonfluoreszenzenz in den Kernen aufweisen (Abbildung 4 C', Pfeil). Wenn stattdessen die Gonaden während der Bildgebung nicht ausreichend hydratisiert werden, können Kerne und six4-eGFP::moesin-Fluoreszenz punktförmig werden (Abbildung 4D, Pfeil), wenn das Gonadengewebe schrumpft. Wenn das EZM der Gonade während der Dissektion übermäßig beschädigt wird, ist die Gonadengrenze gefährdet, was durch das Vorhandensein von gonadenspezifischen Zellen (Abbildung 4E, Sternchen) außerhalb der Grenzen der Gonade deutlich wird (Abbildung 4E, Pfeil).
Abbildung 4: Auffinden gesunder Gonaden während der Live-Bildgebung. (A) Hellfeldansichten mit niedriger und (B) hoher Vergrößerung von zwei sezierten Gonaden, die am Deckglas haften. (C–C') Ein Filmframe aus der Ex-vivo-Bildgebung der Nischenverdichtung in einer gesunden Gonade. Somatische Gonadenzellen exprimieren six4-eGFP::moesin (grün), und alle Zellen exprimieren His2Av-mRFP (rot). (C') Gonadengrenze, die mit einer weiß gepunkteten Linie markiert ist. His2Av-mRFP, das außerhalb der Gonadengrenze sichtbar ist, ist wahrscheinlich ein Fettkörper, der noch an der sezierten Gonade befestigt ist. Arrow zeigt auf einen Keimzellkern mit einheitlichem His2Av-mRFP-Signal, was darauf hinweist, dass die Gonade gesund ist. (D–E) Repräsentative negative Ergebnisse des Ex-vivo-Dissektionsprotokolls. (D) Ein Rahmen aus einer Bildgebungssitzung, in der die Gonade aufgrund von Medienverdunstung dehydriert ist. Beachten Sie pyknotische Kerne, da His2Av-mRFP kondensiert (Pfeil), und diskontinuierliche Flecken von six4-eGFP::moesin entlang der Gonadengrenze. (E) Ex-vivo-Bildgebungsrahmen, in dem die extrazelluläre Matrix während der Dissektion kompromittiert wurde. Beachten Sie, dass einige Keimzellen (Sternchen) die Gonadengrenze verlassen (Pfeil). Keimzellen sind mit nos-lifeact::tdtomato (magenta) und somatische Gonadenzellen mit six4-eGFP::moesin (grün) markiert. Maßstabsstäbe zeigen 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Mit dieser Ex-vivo-Bildgebungsmethode können Gonaden etwa 5 h lang kultiviert werden, was eine Bildaufnahme der dynamischen Morphogenese-Ereignisse ermöglicht, die in der späten embryonalen Gonadenentwicklung auftreten. In unserem Labor haben wir dieses Protokoll erfolgreich eingesetzt, um die Verdichtung der sich bildenden Stammzellnische17 abzubilden (Abbildung 5). Vor der Verdichtung ist die Nische ein loses Aggregat von somatischen Zellen an der vorderen Gonade (Abbildung 5A, grün), umgeben von Keimbahnzellen, die mit nos-lifeact::tdtomato29 markiert sind (siehe Materialtabelle), deren erste Stufe Keimbahnstammzellen sind (Abbildung 5A, Magenta). Dieses Nischenaggregat weist zunächst eine unregelmäßige Grenze auf (Abbildung 5A', gepunktete Linie). Im Laufe der Bildgebung beobachten wir, wie einzelne Nischenzellen ihre Positionen neu anordnen, während das Nischenaggregat glattere Grenzen erhält. Diese zellulären Umlagerungen führen auch zu einer Abnahme der Nischenfläche (Abbildung 5C). Unsere Beobachtungen von Zellumlagerungen und benachbarten Keimzellteilungen, die gleichzeitig mit dieser Entwicklungsphase auftreten, beeinflussten unser Verständnis der Mechanismen, die der Nischenverdichtung zugrunde liegen17. Dieses Protokoll bietet somit die Möglichkeit, Zellumlagerungen, Formänderungen, Teilungen und andere zelluläre Ereignisse mit der Auflösung zu visualisieren, die erforderlich ist, um morphogenetische Ereignisse in Gonaden im Spätstadium zu analysieren.
Abbildung 5: Eine ex vivo kultivierte Gonade, die sich einer Nischenverdichtung unterzieht. Standbilder aus einer Bildgebungsserie, die unmittelbar nach der Sezierung von Gonaden aus Embryonen im frühen Stadium 16 aufgenommen wurden. (A–C) Keimzellen (Magenta) werden durch nos-lifeact::tdtomato markiert und somatische Gonadenzellen (grün) werden durch six4-eGFP::moesin markiert. Die Nische (gepunktete weiße Linie) ist in A'–C' umrissen. Maßstabsstäbe zeigen 10 μm. Anterior ist nach links und posterior ist nach rechts. (A) Zum ersten Zeitpunkt (t = 0 min) in der Bildgebungsreihe haben Nischenzellen die Montage an der Gonade anterior abgeschlossen und befinden sich in einem frühen Stadium der Verdichtung. (B) In der Mitte der Bildgebungsreihe und des Verdichtungsprozesses (t = 1 h 48 min) hat die Nische begonnen, sich zu kreisen, aber ihre Kante bleibt unregelmäßig. (C) Gegen Ende der Bildgebungsreihe (t = 4 h 21 min) weist die Nische eine stark geglättete, kreisförmige Grenze auf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Während der Gonadogenese erfährt die embryonale Gonade und insbesondere die Stammzellnische innerhalb der männlichen Gonade15 schnelle morphologische Veränderungen. Entwicklungsmechanismen, die diesen dynamischen Veränderungen zugrunde liegen, lassen sich am besten durch Live-Imaging-Techniken verstehen. Im embryonalen Stadium 17 wird die In-vivo-Bildgebung der Gonade jedoch durch den Beginn großflächiger Muskelkontraktionenunmöglich gemacht 17. Mit diesem Protokoll bieten wir eine erfolgreiche Alternative: die Sezierung der Gonaden direkt auf eine Bildschale für Ex-vivo-Live-Imaging . Dieses Protokoll stellt die einzige verfügbare Methode dar, um eine Live-Bildgebung der embryonalen Gonade im Spätstadium durchzuführen.
Die kritischen Schritte des Protokolls sollten mit einem akuten Fokus auf Geschicklichkeit und Timing ausgeführt werden. Vor der Dissektion ist eine schnelle Embryonalmontage von größter Bedeutung, um sicherzustellen, dass die Embryonen nicht dehydrieren und gesund und prall bleiben, was die Verformung und Dissektion erleichtert. Während der Dissektion ist es wichtig, eine Störung der extrazellulären Matrix der Gonaden zu vermeiden, die nur mit empfindlichen und präzisen Manipulationen erreicht wird. Die Verwendung einer solchen Geschicklichkeit stellt auch sicher, dass die Gonade in direktem Kontakt mit der Bildschale steht, wodurch eine klare Bildgebung direkt durch das Deckglas ermöglicht wird. Nach der Dissektion muss Ringers Lösung für bildgebende Medien nur mit sanftem Absaugen und Ausstoßen mit einer Pipette gewechselt werden, um eine Verdrängung der Gonade zu verhindern. Schließlich ist es wichtig, die Gesamtdissektionszeit auf 25 min zu begrenzen. Dies stellt sicher, dass die Zeit, die während der Dissektion in Ringers Lösung verbracht wird, und die Lage des Gewebes am Konfokal auf eine ungiftige Exposition beschränkt ist. Mit zunehmender Übung wird sich die Dissektionsgeschwindigkeit verbessern und eine Personalisierung der Dissektionssequenz wird erfolgen. Nach unserer Erfahrung kann nach etwa einer Woche regelmäßiger Übung eine ausreichende Sezierung erreicht werden, wobei die vollständige Beherrschung der Dissektion in etwa 1 Monat erreichbar ist. Um das Lernen zu erleichtern, empfehlen wir, einzelne Schritte zu üben, bevor das gesamte Protokoll ausgeführt wird.
Es gibt eine Reihe von Best Practices, die die mit diesem Protokoll verbundenen Herausforderungen verbessern, beginnend mit dem Genotyp der für die Dissektion verwendeten Embryonen. Die Einbeziehung mehrerer Kopien des Transgens, das zur Markierung der Gonade verwendet wird, macht die Gonade heller und daher leichter zu visualisieren und zu sezieren. Die Dissektion selbst funktioniert am besten mit einer scharfen Nadel, obwohl sie nicht übermäßig geschärft werden sollte, da sie sich gegen den Boden der Bildschale biegt und mit Fremdgewebe belastet wird. Die Bildgebungsmedien von Schneider fluoreszieren automatisch im grünen Emissionsspektrum, was es schwierig macht, mit GFP markierte Gonaden zu lokalisieren, sobald die Medien hinzugefügt wurden. Daher ist es wichtig, die konfokale Bildgebungssoftware zu verwenden, um die Position von Gonaden zu markieren, während sie sich noch in der Ringer-Lösung befinden. Wenn das Auffinden von Gonaden am Konfokus schwierig bleibt, empfehlen wir nach der nächsten Sezierung, die relative Positionierung der Gonaden in der Schale zu skizzieren oder zu fotografieren, während sie sich noch am Seziermikroskop befinden. Markieren Sie dann die Außenseite der Schale, um ihre Ausrichtung während der Dissektion anzuzeigen, und passen Sie diese Ausrichtung beim Übergang zum konfokalen Mikroskop an. Sobald eine Gonade gestört oder verstümmelt erscheint, versuchen Sie bei der nächsten Dissektion, mehr anhaftendes Gewebe um die Gonade herum zu lassen. Im Gegenteil, wenn eine Gonade vorhanden ist, aber in allen Ebenen verschwommen erscheint, befindet sich wahrscheinlich Gewebe zwischen dem Deckglas und der Gonade, und zukünftige Sezierungen sollten eine bessere Isolierung der Gonade vom anhaftenden Gewebe anstreben. Nach unserer Erfahrung hat die Übernahme dieser Praktiken das Erlernen und Ausführen dieses Protokolls erleichtert.
Während der Erstellung dieses Protokolls identifizierten wir mehrere Änderungen, die angewendet werden könnten. Für Nischenverdichtungsstudien zielen wir darauf ab, Embryonen im Stadium 16 zu sezieren. In diesem Stadium hat der Embryo noch keine signifikanten Mengen an Nagelhaut entwickelt und haftet leicht an der mit Polylysin beschichteten Schale. Diese Technik kann jedoch modifiziert werden, um ältere Embryonen mit Kutikula zu sezieren, indem sie für den ersten Schnitt an die Innenwand der polylysinbeschichteten Region geklebt werden. Sobald das innere Gewebe freigelegt ist, haftet der Embryokadaver am Polylysin, und die Dissektion kann wie gewohnt verlaufen. Zusätzlich zu den Anpassungen für das Alter des Embryos haben wir diese Technik erfolgreich angepasst, um mehrere Genotypen in derselben Schale zu sezieren. Zum Beispiel können homozygote Mutanten von Geschwisterheterozygoten durch die Verwendung eines leicht erkennbaren Markers wie deformiert-YFP auf dem Balancer-Chromosom getrennt werden. Nach der Devitellinisierung sollten die Embryonen basierend auf dem Vorhandensein oder Fehlen des Markers auf beide Seiten des Deckglases übertragen werden. Die Dissektion sollte in der Schale wie im Protokoll beschrieben nach unten verlaufen, wobei besonders darauf geachtet wird, dass die Trennung verschiedener Genotypen aufrechterhalten wird. Außerdem könnte dieses Protokoll möglicherweise modifiziert werden, um ein anderes Kulturmedium als das von Schneider zu verwenden, obwohl eine oberflächliche Untersuchung von Shields und Sang M3 Insect Media unbrauchbare Gonaden ergab (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus passt dieses Protokoll gut zu pharmakologischen Manipulationen, indem es einfach das Medikament mit den bildgebenden Medien kombiniert. Über einen Zeitraum von 5 Stunden Bildgebung kann eine erneute Zugabe des Arzneimittels erforderlich sein, um eine wirksame Konzentration aufrechtzuerhalten. Obwohl dieses Protokoll mit der Absicht entwickelt wurde, die Nischenverdichtung zu visualisieren, ein Phänomen, das für männliche Gonaden spezifisch ist, könnte dieses Protokoll theoretisch auch implementiert werden, um den sich entwickelnden Eierstock live abzubilden, indem einfach Gonaden seziert und abgebildet werden, denen eine Nische und msSGPs fehlen.
Einschränkungen, die mit dieser Technik verbunden sind, beziehen sich auf die Länge der Kultivierungszeit und die Ex-vivo-Natur der Kultur. Wie bei den Drosophila-Eizellen im mittleren Stadium30 beginnen kultivierte Gonaden nach etwa 5 h Ex-vivo-Live-Bildgebung zu sterben, was sich durch den Verlust der Gewebeintegrität zeigt (Kerne werden pyknotisch und Zellmembranen schrumpfen). Wenn man also spätere Ereignisse in der männlichen Gonade erforschen wollte, müsste man Gonaden aus dem 1. Stadium oder älteren Larven sezieren, indem man Änderungen an dem hier vorgestellten Protokoll vornimmt, und diese dann unter ähnlichen Bedingungen wie den hier dargestellten abbilden. Wir schließen jedoch die Möglichkeit einer Ex-vivo-Live-Bildgebung nach fünf Stunden nicht aus, wenn sich verbesserte Kulturbedingungen entwickeln, obwohl es eine Grenze geben kann, wenn mechanische Hinweise aus dem Inneren des Embryos für die Entwicklung der Gonaden erforderlich sind. Der vielleicht schwerwiegendste Nachteil der Technik ist auf ihre inhärente Ex-vivo-Natur zurückzuführen. Wenn sie ex vivo kultiviert werden, können Zellen ein unnatürliches Potenzial haben, das für die In-vivo-Biologie nicht repräsentativ ist31. Darüber hinaus können Feinheiten der Kultivierungsumgebungen, einschließlich Medieninhalt und Matrixsteifigkeit, drastischen Einfluss auf das Zellverhaltenhaben 32. Mit dieser Sensibilität im Hinterkopf ist es wichtig sicherzustellen, dass die Kultivierungsbedingungen die In-vivo-Biologie genau widerspiegeln. Wir haben Maßnahmen ergriffen, um zu bezeugen, dass die Entwicklung und Signalgebung von In-vivo-Nischen ex vivo17 rekapituliert wird. Kurz gesagt, wir stellten fest, dass das Schicksal der Nischenzellen erhalten bleibt und die Anzahl der Nischenzellen mit den Markern Fasciclin-III und E-Cadherin unverändert bleibt. Außerdem ist eine STAT-Signalgebung vorhanden und Keimbahnstammzellen teilen sich orthogonal, was darauf hindeutet, dass die Nischenfunktionalität erhalten bleibt. Wir haben jedoch nicht nachgewiesen, dass die relevante In-vivo-Biologie in anderen, nicht nischigen Geweben innerhalb der Gonade intakt bleibt. Zukünftige Ex-vivo-Untersuchungen dieser anderen Gewebe sollten eine umfassende Analyse umfassen, um sicherzustellen, dass dies tatsächlich der Fall ist.
Eine zukünftige Richtung, die man mit diesem Protokoll einschlagen könnte, wäre die Integration einer Barriere in die Bildgebungsschale, so dass eine Dissektionssitzung sowohl eine Kontrollgruppe als auch eine medikamentöse Behandlungsgruppe enthalten kann. Diese Verbesserung würde es ermöglichen, Fehler zwischen technischen Replikaten zu minimieren und dadurch die wissenschaftliche Strenge zu verbessern.
Es gibt keine anderen echten Alternativen zu diesem Protokoll, da es die einzige verfügbare Methode ist, um die Live-Ereignisse dieses Organs während der späten Embryonalentwicklung zu untersuchen. Daher sind bisher unbeantwortbare Fragen zur Gonadenmorphogenese mit diesem Fortschritt nun zugänglich. Zu diesen Fragen gehören die Feinheiten von Zellteilungen, Zytoskelettveränderungen und Zellinterkalationsereignissen, die die Bildung von Stammzellen und die Gonadogenese steuern. Keines dieser Ereignisse ist in den Standbildern dieser Prozesse nachweisbar, die mit einer Fix-and-Stain-Technik aufgenommen wurden. Insgesamt eröffnet diese Methode die Möglichkeit, die Dynamik in der späten embryonalen Drosophila-Gonade zu untersuchen, und ein solcher Durchbruch hat starke Auswirkungen auf die Weiterentwicklung einer Vielzahl von biologischen Feldern, einschließlich Stammzell-Nischenbiologie, piRNA-Biologie und Organogenese.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken Lindsey W. Plasschaert und Justin Sui für ihre wesentlichen Beiträge zur frühen Entwicklung dieses Protokolls. Die Autoren danken der Fliegengemeinschaft für ihre Großzügigkeit mit Reagenzien und insbesondere Ruth Lehmann und Benjamin Lin für ihr Geschenk der Linie nos5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' vor der Veröffentlichung. In dieser Studie wurden Bestände aus dem Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537) verwendet. Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 und R35GM136270 (S.D) sowie Schulungszuschüsse T32GM007229 (B.W.) und F32GM125123 (L.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
References
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