Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Анализ флуоресцентных утечек для исследования дестабилизации мембраны проникающим в клетки пептидом

Published: December 19, 2020 doi: 10.3791/62028
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1PHYMEDEXP, INSERM U1046 - CNRS UMR 9214 - University of Montpellier

Summary

Анализ утечки флуоресценции является простым методом, который позволяет иследовать пептидно-мембранные взаимодействия, чтобы понять их участие в нескольких биологических процессах и особенно способность проникающих в клетки пептидов нарушать бислои фосфолипидов во время прямого процесса клеточной транслокации.

Abstract

Проникающие в клетки пептиды (CPP) определяются как носители, которые способны пересекать плазматическую мембрану и переносить груз в клетки. Одна из основных общих черт, необходимых для этой активности, является результатом взаимодействия CPP с плазматической мембраной (липидами) и, в частности, с компонентами внеклеточного матрикса самой мембраны (гепарансульфат). Действительно, независимо от прямой транслокации или эндоцитоз-зависимой интернализации, липидные бислои участвуют в процессе интернализации как на уровне плазматической мембраны, так и на уровне внутриклеточного трафика (эндосомальные везикулы). В этой статье мы представляем подробный протокол, описывающий различные этапы формулирования больших одноламелярных везикул (LUV), очистки, характеристики и применения в анализе утечки флуоресценции с целью обнаружения возможной дестабилизации / взаимодействия CPP-мембраны и рассмотрения их роли в механизме интернализации. LUV с липидной композицией, отражающей содержание плазматической мембраны, генерируются для того, чтобы инкапсулировать как флуоресцентный краситель, так и гаситель. Таким образом, добавление пептидов во вневезикулярную среду и индукция пептидно-мембранных взаимодействий на LUV могут, таким образом, вызывать дозозависимым образом значительное увеличение флуоресценции, выявляющее утечку. Здесь приведены недавно разработанные триптофан (W)- и богатые аргинином (R)амфипатические пептиды (WRAPs), которые показали быструю и эффективную доставку siRNA в различных клеточных линиях. Наконец, природа этих взаимодействий и сродство к липидам обсуждаются для понимания и улучшения транслокации мембраны и/или эндосомального выхода.

Introduction

После их открытия в девяностые годы были разработаны проникающие в клетки пептиды (CPP) для содействия эффективной клеточной доставке грузов через плазматическую мембрану1,2. CPP обычно представляют собой короткие пептиды, обычно от 8 до 30 аминокислот, имеющие широкий спектр происхождения. Сначала они были определены как «прямо-транслокирующие» носители, то есть они были способны пересекать плазматическую мембрану и переносить груз в клетки независимо от любого эндоцитотического пути, ни от потребности в энергии, ни от участия рецептора. Однако дальнейшие исследования показали, что эти первые наблюдения в основном произошли от переоценки флуоресценции из-за экспериментального артефакта и / или протоколов фиксации с использованием метанола3. В настоящее время широко признано, что поглощение CPP происходит как эндоцитозом, так и энергонезависимой транслокацией4,5,6,7 в зависимости от различных параметров, таких как характер груза, используемая связь между CPP и грузом, исследуемая клеточная линия и т. Д.

CPP могут быть использованы в качестве трансфекционных агентов в соответствии с двумя стратегиями, либо включающими химическую связь (ковалентная стратегия), либо электростатические/гидрофобные взаимодействия (нековалентная стратегия) между CPP и его грузом8,9,10,11. Хотя обе стратегии показали свою эффективность в клеточном переносе нескольких грузов, понимание механизма интернализации СПП все еще находится под спорным вопросом, и баланс между путями эндоцитоза или прямым проникновением все еще трудно измерить12,13. Хотя имеется набор экспериментальных инструментов и стратегий для четкого решения проблемы участия эндоцитарных процессов, прямую транслокацию, по-видимому, сложнее охарактеризовать, поскольку она подразумевает более дискретные взаимодействия с компонентами плазматической мембраны. Биологические мембраны обычно состоят из многочисленных компонентов, от фосфолипидов до мембранных белков, которые могут варьироваться в зависимости от типа клеток и / или окружающей среды (стрессовые условия, деление клеток и т. Д.). Такое разнообразие состава, а следовательно, и отсутствие универсальной модели клеточной мембраны не позволяет проводить исследования единым способом. Однако для обхода этих ограничений были разработаны пошаговые подходы с искусственными мембранными или мембранными экстрактами. От небольших одноламеллярных везикул до однослойных подходов, каждая модель явно уместна для ответа на конкретные вопросы14,15. Среди них большие одноламелляторные везикулы (LUV) представляют собой подходящую модель, имитирурующей мембрану, для изучения пептидных / мембранных взаимодействий в качестве ключевого момента в процессе интернализации.

В этом контексте следующий протокол описывает исследование влияния пептидов и пептидно-мембранных взаимодействий на целостность LUV посредством мониторинга как анионного флуоресцентного красителя, так и соответствующего ему поликатионного гасища, инкапсулированного в липосомах. Этот инструмент используется для изучения взаимодействия CPP / мембраны, чтобы понять, способны ли они выполнять прямую мембранную транслокацию. Хотя этот анализ утечки флуоресценции LUV обычно применяется для сравнения различных мембранно-взаимодействующих пептидов, он также может быть использован для исследования как конъюгатов CPP-груза (ковалентная стратегия), так и комплексов CPP: груз (нековалентная стратегия).

Таким образом, настоящий протокол будет впервые проиллюстрирован недавно разработанными триптофанами (W)- и аргинин(R)-богатыми амфипатическими пептидами (WRAP)16. WRAP способен образовывать наночастицы на основе пептидов для быстрой и эффективной доставки малых интерферионных РНК (siRNA) в несколько клеточных линий16. Для характеристики их механизма клеточной интернализации контролировались свойства флуоресцентной утечки только пептида WRAP или наночастиц на основе WRAP, нагруженных siRNA. Мы показали, что их механизм интернализации в основном связан с прямой транслокацией7. Во втором примере пептид WRAP был ковалентно конъюгирован с белком/белковым интерферирующим пептидом iCAL36 (WRAP-iCAL36)17, и его способность дестабилизировать мембраны сравнивали в анализе утечки флуоресценции с iCAL36 в сочетании с Penetratin18 (Penetratin-iCAL36), другим CPP.

Наконец, преимущества и ограничения метода будут обсуждаться как с технологической точки зрения, так и с точки зрения биологической значимости.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка больших одноламелярных везикул (LUV)

  1. Подготовьте LUV к их использованию в качестве имитации клеточной мембраны для анализа утечки флуоресценции.
  2. Смешать со стеклянным шприцем Гамильтона фосфатидилхолин (DOPC, 786,11 г/моль), сфингомиелин (SM, 760,22 г/моль) и холестерин (Chol, 386,65 г/моль) при молярном соотношении 4:4:2. Липидный раствор получают из запасного раствора каждого липида, солюбилизированного в растворителе метанола/хлороформа (3/1; объем/объем) при 25 мг/мл в стеклянной колбе круглого дна объемом 25 мл. На основе 4 мкмоль DOPC, 4 мкмоль SM и 2 мкмоль Chol липидный раствор получают из запасного раствора путем смешивания 126 мкл, 117 мкл и 31 мкл соответственно.
    ВНИМАНИЕ: Метанол является токсичным и легковоспламеняемым растворителем, а хлороформ токсичен и канцерогенен. Оба должны быть обработаны с соответствующей защитой под капотом.
  3. Выпаривают метанол/хлороформ с помощью роторного испарителя под вакуумом в течение 45-60 мин при 60 °С до образования высушенной липидной пленки.
  4. Подготовьте два запаса буферных раствора HEPES. Приготовьте буфер HEPES 1, перемешав 20 мМ HEPES (238,3 г/моль) и 75 мМ NaCl (58,44 г/моль) и отрегулируйте рН до 7,4. Приготовьте буфер HEPES 2 путем смешивания 20 мМ HEPES и 145 мМ NaCl и отрегулируйте рН до 7,4. Буферы HEPES можно хранить при 4 °C в течение 1 месяца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется проверить осмолярность буферов с помощью осмометра.
  5. Готовят раствор для гидратации липидов, растворяя мембранную непроницаемую флуоресцентную пару краситель-квенчер, 8-аминонафталин-1, 3, 6-трисульфоновую кислоту, динатриевую соль при 12,5 мМ (ANTS, 427,33 г/моль) и п-ксилол-биспиридиний бромид при 45 мМ (DPX, 422,16 г/моль) в буферном растворе HEPES. Смешивание ANTS с DPX приводит к желтому цвету раствора. Для достижения концентраций 12,5 мМ ANTS и 45 мМ DPX растворяют 21,4 мг и 76 мг соответственно в 4 мл буфера HEPES 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для гидратации липидов можно хранить в течение 2 недель при 4 °C, обернув тубу алюминиевой фольгой.
  6. Воссоздание многоламеллярных везикул (MLV) путем повторного усвоения высушенной липидной пленки с 1 мл раствора для гидратации липидов и путем вихря до растворения высушенной липидной пленки. Убедитесь, что раствор полностью солюбилизирован, так как небольшие липидные агрегаты негативно повлияют на предыдущие этапы. Кроме того, проверьте стенку стеклянной колбы с круглым дном, чтобы убедиться, что в ней не осталось липидной пленки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После солюбилизации раствор будет выглядеть опалесцируется и светло-желтым.
  7. Подвергайте везикулы пяти циклам замораживания/оттаивания для получения одноламелярных везикул. Выполните каждый цикл, поместив стеклянную колбу с круглым дном на 30 с в жидкий азот для этапа замораживания, а затем оставив ее на водяной бане на 2 мин для этапа оттаивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Температура воды в ванне должна быть на 5-10°C выше температуры плавления липидов.
  8. Подготовьте липидный экструдер, вставив две фильтрующие опоры, предварительно увлажненные буфером HEPES, в каждую деталь экструдера из политетрафторэтилена (PTFE), помещенную в канистру металлического экструдера.
  9. Поместите увлажненную поликарбонатную мембрану HEPES (размер пор 0,1 мкм, диаметр 25 мм) на верхнюю часть одной опоры фильтра.
  10. Соберите две металлические канистры экструдера и прикрутите их.
  11. Поместите собранный экструдер в держатель и введите шприц 1 мл в соответствующее отверстие на оконечности каждого куска экструдера политетрафторэтилена. Экструзия соответствует прохождению искомой жидкости от одного шприца к другому через поликарбонатную мембрану.
  12. Испытайте экструдер с 1 мл буфера HEPES, загруженным в один из шприцев 1 мл, чтобы убедиться в отсутствии утечек или проблем.
  13. Замените буфер HEPES 1 мл образцом MLV.
  14. Выполняют экструзию путем пропускания образца MLV из одного шприца в другой через поликарбонатную мембрану не менее 21 раза для получения однородных LUV одинакового размера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экструзия должна проводиться при температуре, превышающей температуру плавления липидной смеси.

2. Очистка LUV

  1. Подготовьте очистку колонны для удаления неинкапсулированных излишков ANTS и DPX.
  2. Вводят сшитый декстран-гель (G-50), повторно суспендированный в водной среде с 0,01% NaN3 (65 г/моль) в столбик жидкой хроматографии (Luer Lock, без оболочки, 1,0 см х 20 см, объем ложа 16 мл) до 1 см ниже верхней части бесцветной части колонки.
  3. Откройте кран и дайте жидкости течь, чтобы осесть сшитый декстран-гель.
  4. Промыть колонну, элюируя 20 мл буфера HEPES 2 и отбросить выходной поток колонны.
  5. Закройте кран, как только мертвый объем растворителя над колонкой будет сведен к минимуму (<100 мкл), но достаточно, чтобы избежать высыхания сшитого декстран-геля.
  6. Поместите свежеэкструдированные LUV (желтый) на столбец и дайте им войти в сшитый декстран-гель.
  7. Непрерывно добавляйте буфер HEPES 2 в столбец для выполнения очистки LUV.
  8. Элюируют примерно 2 мл буфера HEPES 2 (не забывайте регулярно заполнять верхнюю часть колонки, чтобы избежать высыхания сшитого декстранового геля): свободный желтый раствор ANTS и DPX мигрирует медленнее, чем липосомы.
  9. Начинают сбор очищенных LUV в пробирки (1,5 мл).
  10. Наблюдают за каплями элюента из колонки и когда они становятся опалесцентными, они содержат липосомы. Замените трубку, чтобы восстановить LUV-содержащую фракцию.
  11. Элюируют до тех пор, пока капли не перерасти не будут опалесцированными (~1 мл). После этого элюируют еще 0,5 мл в отдельной фракции, а затем прекращают элюирование.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стандарты в настоящее время доступны в широком диапазоне молекулярных весов, в виде наборов или отдельных молекулярных масс для калибровки объема элюции LUV.
  12. Оберните трубки с LUV в алюминиевую фольгу, чтобы избежать отбеливания флуоресцентного красителя.
  13. Промыть колонну 20 мл HEPES буфером 2.
  14. Затем LUV можно хранить в течение недели при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку стабильность LUV может зависеть от концентрации и состава LUV, а также от ионной силы, размер LUV следует контролировать с помощью прибора динамического рассеяния света (DLS) (см. раздел 4. Характеристика размера и однородности LUV) перед каждым испытанием.

3. Количественная оценка концентрации LUV

  1. Оценка концентрации LUV с помощью набора количественной оценки фосфолипида, который позволяет оценить концентрацию холина19. Этот анализ может быть применен, когда фосфолипиды с холином, содержащим полярную головку, значительны (>50% LUV).
  2. Готовят цветной реагент, растворяя 18 мг хромогенного субстрата в 3 мл предоставленного буфера.
  3. Загрузите полистирольную кювету, 10 x 10 x 45 мм, 3 мл цветного реагента.
  4. Используйте чистый цветной реагент в качестве пустого условия (Blank). Добавьте 20 мкл образца LUV (Тест) или 20 мкл стандартного раствора известной концентрации холина (Стандарт).
  5. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 5 мин при 37 °C при всех условиях (заготовка, тест и стандарт).
  6. Измерьте поглощение (оптическую плотность, OD) ископаемого образца и стандартного раствора с помощью пустого раствора в качестве контроля на 600 нм с помощью спектрофотометра.
  7. Проверьте значения OD, которые позволяют оценить концентрацию липидов LUV, C[LUV], в холиновом эквиваленте по сравнению со стандартом известной концентрации.
  8. Выполните вычисление, используя следующее уравнение:
    C[LUV] (моль / л) = (образец OD / стандарт OD) x C [стандарт] (моль / л)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Набор для количественного определения фосфолипида содержал стандартный раствор холина хлорида (139,6 мг/л) при 54 мг/дл, соответствующий молярной концентрации C [стандарт] = 3,87 ммоль/л. Образец OD и стандарт OD представляют собой абсорбции, измеренные при 600 нм для растворов LUV и холина, соответственно.

4. Характеристика размера и однородности LUV

  1. Выполните измерение с помощью прибора DLS для определения размера LUV (в нм) и индекса полидисперсности (PdI).
  2. Запрограммировать соответствующую «стандартную процедуру работы» (СОП) путем указания вязкости растворителя/буфера и используемой кюветы.
  3. Поместите 500 мкл раствора LUV в полумикрокуэтку из полистирола.
  4. Вставьте полистирольный полумикрокуэт в инструмент DLS.
  5. При комнатной температуре измеряют распределение по размерам в терминах среднего размера (Z-среднего) распределения частиц и однородности (индекс полидисперсности, PdI).
  6. Все результаты получены из двух независимых измерений, выполненных каждое в трех повторяющихся циклах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартными значениями для LUV будет средний размер 137 ± 7 нм с PdI 0,149 ± 0,041.

5. Приготовление пептидных растворов

  1. Подготовьте запасной раствор пептида, который следует проанализировать для анализа утечки.
  2. Растворите пептидный порошок (чистотой >95%) в чистой воде (например, 1 мг пептида в чистой воде 500 мкл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется разбавлять пептиды в чистой воде и избегать солюбилизации диметилсульфоксида (ДМСО), которая может индуцировать артефакты (например, мембранная пермеабилизация20).
  3. Вихрь пептидного раствора в течение 5 с.
  4. Обжайте раствор пептида ультразвуком в водной ванне с ультразвуком в течение 5 мин, а затем центрифугу в течение 5 мин при 12 225 х г. Соберите супернатант для определения концентрации.
  5. Измерьте абсорбцию при 280 нм трех независимых пептидных разведений, а затем рассчитайте концентрацию пептида, используя коэффициент молярного вымирания ε (в зависимости от содержания триптофана и тирозина в пептидной последовательности) и правила Бира-Ламберта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если пептид содержит триптофан и тирозин, коэффициент молярного вымирания ε рассчитывается на основе ε триптофана = 5 690 М-1см-1 и тирозина ε = 1 280 М-1см-1. Если пептидная последовательность не содержит триптофана или тирозина, для измерения концентрации может быть выполнен другой колориметрический анализ (например, BCA или Bradford).
  6. Раствор пептида развести в чистой воде до конечного раствора 100 мкМ и хранить при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В чистой воде при хранении при 4 °C деградация пептидов не происходит. Тем не менее, концентрация пептидов должна измеряться каждые 2 недели, чтобы гарантировать, что не происходит испарения воды.

6. Анализ утечки флуоресценции

  1. Анализ утечки флуоресценции измеряется на спектрофлуфлюорометре при комнатной температуре. Длина волны возбуждения и излучения фиксируются при Ex = 360 нм ± 3 нм и Em = 530 нм ± 5 нм соответственно.
  2. Разбавляют LUV в 1 мл hePES буфера 2 до конечной концентрации 100 мкМ в кварцевой флуоресцентной кювете. Добавьте магнитную мешалку для гомогенизации раствора во время эксперимента.
  3. Измерьте только LUV в течение первых 100 с, между t = 0 с и t = 99 с, чтобы получить доступ к фоновой флуоресценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Только LUV также могут быть измерены в течение всего эксперимента (15 мин), чтобы получить доступ к фоновой флуоресценции и потенциальным утечкам.
  4. После этого измеряют утечку как увеличение интенсивности флуоресценции при добавлении аликвот пептидного раствора в течение следующих 900 с (15 мин). Этот протокол проводится для каждой концентрации тестируемого пептида от 0,1 мкМ до 2,5 мкМ.
  5. Наконец, 100% флуоресценция была достигнута путем солюбилизации LUV путем добавления 1 мкл тритона X-100 (0,1%, v/v), в результате чего образовался полностью неутолшенный зонд между t = 1000 с и t = 1,100 с.

7. Количественная оценка утечки

  1. Подавить значения, полученные после t = 1,090 с, чтобы сохранить одинаковое количество баллов для каждого тестируемого условия.
  2. Рассчитайте минимальную флуоресценцию, Fмин,сделав среднее значение 50 точек между t = 0 с и t = 49 с (только LUV).
  3. Рассчитайте максимальную флуоресценцию, Fmax,сделав среднее значение 50 точек между t = 1041 с и t = 1090 с (LUV с Triton X-100).
  4. Рассчитайте процент утечки (%Утечка) в каждой точке времени (t = x) в соответствии со следующим уравнением:
    %Утечка(t=x) = (F(t=x) - Fмин) / (Fмакс - Fмин) x 100
  5. Рассчитайте среднее и стандартное отклонение для значений, полученных при различном препарате LUV (n ≥ 2) для одного и того же состояния.
  6. График процента утечки, %Утечка(t=x), в функции времени (с).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Принцип анализа утечки флуоресценции показан на рисунке 1. В деталях большие одноламелляционные везикулы (LUV), инкапсулирующие флуоресцентный краситель и гаситель (без флуоресцентного сигнала), обрабатываются интересующей биомолекулой. Из-за взаимодействия пептида с липидными мембранами, что может подразумевать проницаемость мембраны, реорганизацию или даже разрыв, флуоресцентный краситель и квенчер высвобождаются из LUV. Последующие разбавления в буфере приводят к увеличению флуоресцентного сигнала.

Хотя эта схема отображает тест со свободными пептидами, преимущество системы заключается в возможности также тестировать конъюгированные пептиды, наночастицы на основе пептидов или другие биополимеры, которые, как подозревается, дестабилизируют липидные мембраны. Хотя требуется предварительная оптимизация протокола, особенно в отношении тестируемых молекул, этот анализ утечки флуоресценции может быть распространен на огромное разнообразие мембранных взаимодействующих компонентов. В настоящем протоколе показаны некоторые результаты, полученные с помощью ЦПП и их комплексных (нековалентная стратегия) или сопряженных (ковалентная стратегия) форм. Следующие примеры подразумевают только WRAP, а также наночастицы на основе WRAP, нагруженные siRNA, и два различных пептид-конъюгата (WRAP-iCAL3617 и Penetratin-iCAL36).

Что касается нековалентной стратегии, то анализ утечки флуоресценции с пептидами и с соответствующими наночастицами, нагруженными siRNA, в присутствии LUV показан на рисунке 2. Везикулы состоят из смеси DOPC/SM/Chol (4:4:2), отражающей плазматическую мембрану, как описано в Konate et al.21, и обычно используются для непосредственной оценки возможности липидного двухслойного взаимодействия и/или свойств трансдукции свободных наночастиц НА основе WRAP иWRAP7. При отсутствии пептидов утечки не наблюдается (исходный уровень в течение первых 100 с). Добавление свободного WRAP на LUV вызывает значительное увеличение флуоресценции, выявляя значительную утечку LUV и высвобождение ANTS. Через 15 мин получается утечка 67,8% ± 0,4% по сравнению с состоянием Тритона (положительный контроль) при используемой концентрации (2,5 мкМ) пептида WRAP. Здесь следует отметить, что также было протестировано несколько различных концентраций и выявлено дозозависимое увеличение флуоресценции, соответствующее дозозависимой утечке LUV7. Напротив, когда WRAP собирают в той же концентрации с siRNA с образованием наночастиц на основе пептидов, утечка в 1,5 раза слабее (40,5% ± 0,5%) по сравнению со свободнымпептидом (рисунок 2). Аналогичные значения утечки были зарегистрированы для пептида RICK (60%) или наночастиц RICK: siRNA (28%)22. Разница в значениях между свободным пептидом по сравнению с наночастицами может быть объяснена тем фактом, что при взаимодействии с наночастицами существенная часть пептида участвует в прямых взаимодействиях с siRNA, снижая доступность пептида для взаимодействия с липидами.

Что касается ковалентной стратегии, то анализы утечки флуоресценции с CPP-конъюгатами в присутствии LUV показаны на рисунке 3. С той же композицией LUV [DOPC/SM/Chol (4:4:2)] применяются два конъюгированных пептида: WRAP-iCAL36 и Penetratin-iCAL36. Как было замечено ранее, при отсутствии пептидов утечки не наблюдается. Через 15 мин после инъекции 2,5 мкМ Penetratin-iCAL36 не обнаруживается значительного увеличения флуоресценции (2,3% ± 0,7%), тогда как добавление 2,5 мкМ WRAP-iCAL36 вызывает чистую утечку, характеризующуюся очень сильным флуоресцентным сигналом (85,8% ± 11,1%)17. Эти наблюдения показывают, что для некоторых пептидов или конъюгатов утечка флуоресценции не может произойти, что свидетельствует об отсутствии пептидно-мембранных взаимодействий или отсутствии нарушения липидных бислоев. Это в соответствии с ранее опубликованными результатами, показывающими, что Пентерин, как и Тат, не смог дестабилизировать мембраны23,24,25. Следует подчеркнуть, что мембранные дестабилизирующие свойства СПП могут изменяться в зависимости от сцепленного груза26.

Кроме того, хотя WRAP-iCAL36 вызвал сильную утечку, дополнительные исследования не выявили специфической клеточной интернализации, что указывает на то, что эти конъюгаты остались внутри бислоя липидов плазматической мембраны17. В отличие от наночастицы WRAP, мы предполагаем, что конъюгат WRAP-cargo способен дестабилизировать мембрану LUV, залипая между липидными цепями или образуя поры.

Эти результаты показывают, что анализ утечки флуоресценции может выявить способность некоторых CP развивать пептидно-мембранные взаимодействия, что может привести к более или менее выраженной проницаемости мембраны. Более того, эти взаимодействия могут происходить независимо от стратегии доставки грузов (наночастицы против сопряжений). И наоборот, этот метод не различает, может ли CPP, который не вызывает утечки флуоресценции, по-прежнему взаимодействовать с двухслойной или биологической мембраной липидов. Такое поведение требует дополнительных подходов, таких как измерения дзета-потенциала, FRET между пептидом и мембраной или эксперименты по флуоресценции триптофана, и это лишь несколько примеров.

Figure 1
Рисунок 1:Принцип анализа утечки флуоресценции. LUV были загружены флуоресцентным красителем (ANTS) белого цвета и соответствующим его аквенчером (DPX) в сером. В отсутствие пептидов (красным цветом) флуоресцентный сигнал не наблюдался, поскольку флуоресценция ANTS гасялась DPX. Добавление пептидов на LUV индуцировало проницаемость мембраны и последующее высвобождение как ANTS, так и DPX, что приводило к значительному увеличению флуоресценции ANTS (желтый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Анализ утечки флуоресценции со свободными наночастицами WRAP и WRAP:siRNA. Только пептид и наночастицы, нагруженные siRNA, наносили на LUV при концентрации пептида 2,5 мкМ. Наночастицы на основе WRAP были сформулированы при молярном соотношении пептид:siRNA 20 (R20), как описано в Konate et al.7,16. Черные стрелки показывают инъекции пептида (наночастицы) и тритона X-100 соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Анализ утечки флуоресценции с конъюгатами WRAP-iCAL36 и Penetratin-iCAL36. Конъюгаты наносили на LUV в концентрации 2,5 мкМ. Черные стрелки показывают инъекции пептида и тритона X-100 соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Представленный анализ утечки флуоресценции является простым и быстрым методом устранения дестабилизации мембраны проникающим в клетки пептидом. Это также позволяет проводить косвенное сравнение между различными мембранно-взаимодействующими пептидами или другими мембранно-взаимодействующими молекулами. Что касается критических этапов протокола, поскольку этот анализ обеспечивает относительные значения между исходным уровнем (только LUV) и максимальным высвобождением флуоресценции (условие Тритона), мы обычно оцениваем концентрацию LUV с использованием набора количественной оценки фосфолипидов, который оценивает только вклад холина в LUV. Однако также возможно включить более точное измерение концентрации LUV путем определения общего содержания фосфора путем кислотного переваривания, как описано Роузером и его коллегами27 или Бартлеттом28, или колориметрическим методом с использованием комплексования фосфолипидов29ферротиоцианата аммония. В наших руках это не влияет на относительную количественную оценку утечки и на сравнение мембранно-взаимодействующих пептидов.

Что касается использования LUV, следует также отметить важность контроля состояния базового уровня LUV в одиночку, чтобы проверить, пригодны ли они для использования и показывают ли они уже утечки (характеризующиеся непрерывным увеличением флуоресценции). Точно так же важно измерять максимальное высвобождение флуоресценции после каждой инкубации пептида, чтобы гарантировать, что не было зарегистрировано ложноотрицательных результатов из-за нежелательного процесса закалки (например, закалки пептида / красителя).

В целом, согласно характеристике DLS, LUV довольно стабильны в течение 1 недели и не должны отображать слишком высокий фон флуоресценции. В этом контексте очистка липосом, нагруженных ANTS/DPX, гелевой фильтрацией также является ключевым моментом, поскольку позволяет формировать LUV без остаточной флуоресценции, которая может способствовать фону или вызывать переоценку флуоресценции. Кроме того, настоятельно рекомендуется откалибровать протокол, включив конкретный положительный контроль, который всегда может дать одинаковый процент утечки. Это представляет собой внутренний контроль посредством различных измерений, которые могут усилить характеристику LUV для каждого теста и увеличить статистику.

Хотя анализ утечки флуоресценции может обеспечить быстрое сравнение мембранной дестабилизации СПП, он, однако, ограничен в интерпретации пептидно-мембранных взаимодействий, поскольку некоторые пептиды способны взаимодействовать с липидным бислоем, не вызывая каких-либо мембранных нарушений или утечки. Для этих пептидов настоятельно рекомендуется использовать дополнительные эксперименты со специфическими флуоресцентными маркерами, позволяющими FRET30.

Следует также отметить, что могут использоваться и другие пары флуоресцентного красителя/гасища (например, Tb3+/DPA31). Оба метода имеют свои неудобства: тербий (III) не очень растворим в воде и не может быть использован в присутствии фосфата, тогда как закалка ANTS не является линейной функцией концентрации DPX. Кроме того, другие самозакалывающиеся материалы, такие как 70 мМ раствор кальциина32 или декстран-ПТС33, могут обрабатываться в зависимости от дефектов мембраны, спровоцированных анализируемым пептидом или соединением.

Наконец, основным преимуществом этого анализа утечки флуоресценции является возможность тестирования множества потенциальных мембранных взаимодействующих молекул, а также различных мембранных композиций, таких как эндосомальная мембрана имитирует [например, диолеоилфосфатидилхолин (DOPC)/диолеоил-фосфа-тидилэтаноламин (DOPE)/фосфатидилинозитол из сои (PI)/бис(моноолеоилглицеро) фосфата (LBPA) при молярном соотношении 5:2:1:2]34 , митохондриальная мембрана имитирует [например, 46,5% DOPC, 28,5% фосфатидилэтаноламина (PE), 9% фосфатидилинозитола (PI), 9% фосфатидилсерина (PS) и 7% кардиолипина (CL)35 или любой другой желаемой липидной двухслойной композиции. Однако сначала необходимо обеспечить стабильность везикул (отсутствие слияния, агрегации или осаждения LUV, отсутствие выпадения липидов из суспензии, отсутствие отрицательной кривизны мембраны и т. Д.), Имеющих постоянный средний размер, близкий к 100 нм во время эксперимента и хранения.

Кроме того, преимуществом данного метода по сравнению с экстрагируемыми мембранами (эритроцитами, митохондриями и др.) является использование очищенных хорошо охарактеризованных липидов при отсутствии белков. Контроль липидного двухслойного состава (плазменная, эндосомальная или митохондриальная мембрана) также позволяет вставлять специфические мембранные белки (протонный насос). Кроме того, возможность контролировать как внутреннюю, так и внешнюю среду LUV позволяет четко интерпретировать возмущение /утечку мембраны. По сравнению с экспериментами36с черно-липидной мембраной, которые также могут визуализировать события мембранной пермеабилизации, этот протокол утечки обеспечивает более простой метод скрининга мембранно-активных пептидов.

В заключение, этот простой метод способствует быстрой идентификации сильных пептидных / мембранных взаимодействий, приводящих к дестабилизации мембраны. Он может быть применен для исследования механизма интернализации CPP и в более общем подходе «мембранно-активных пептидов», таких как фузиогенные или антимикробные пептиды.

В целом, характеристика основного пути, используемого CP для достижения цитоплазмы, очень сложна и требует нескольких различных подходов, от биофизики до клеточной биологии. Например, исследование интернализации WRAP выявило баланс между различными механизмами проникновения в клетки (эндоцитоз против прямой транслокации), а анализ утечки флуоресценции, связанный с другими методами, способствовал поддержке процесса прямого проникновения7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Эмили Жосс за критический обзор рукописи. Эта работа была поддержана фондом «La Ligue contre le Cancer», «Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer» и «Centre National de la Recherche Scientifique» (CNRS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25 mL glass round-bottom flask Pyrex
8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS) Invitrogen A350 Protect from light 
Chloroform  Sigma-Aldrich 288306
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
DOPC (dioleoylphosphatidylcholine) Avanti Polar 850375P Protect from air
Extruder Avanti Polar 610000
Fluorimeter PTI Serlabo
50 µL glass syringe Hamilton 705N
HEPES Sigma-Aldrich H3375
LabAssay Phospholipid  WAKO  296-63801
liquid chromatography column Sigma-Aldrich
Methanol Carlo Erba 414902
Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter) Whatman 800309
polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm Grener Bio-One 614101
polystyrene semi-micro cuvette, DLS Fisher Scientific FB55924
p-xylene-bispyridinium bromide (DPX) Invitrogen X1525 Protect from light 
quartz fluorescence cuvette Hellma 109.004F-QS
rotavapor system  Heidolph Z334898
Sephadex G-50 resin Amersham 17-0042-01
Sodium azide (NaN3) Sigma-Aldrich S2002
Sodium chlorid (NaCl) Sigma-Aldrich S5886
Sonicator bath USC300T VWR 142-6001
Sphingomyelin Avanti Polar 860062P Protect from air
Triton X-100  Eromedex 2000-B
Zetaziser NanoZS  Malvern ZEN3500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langel, U. Handbook of Cell-Penetrating Peptides. , CRC Press. (2006).
  2. Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 (16), 1839-1849 (2005).
  3. Richard, J., et al. Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. The Journal of Biological Chemistry. , (2003).
  4. Jones, A., Sayers, E. Cell entry of cell penetrating peptides: tales of tails wagging dogs. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. , (2012).
  5. Tünnemann, G., et al. Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines. Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).
  6. Jiao, C. -Y., et al. Translocation and endocytosis for cell-penetrating peptide internalization. Journal of Biological Chemistry. 284 (49), 33957-33965 (2009).
  7. Deshayes, S., et al. Deciphering the internalization mechanism of WRAP:siRNA nanoparticles. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1862 (6), 183252 (2020).
  8. Konate, K., et al. Optimisation of vectorisation property: A comparative study for a secondary amphipathic peptide. International Journal of Pharmaceutics. 509 (1-2), 71-84 (2016).
  9. Lehto, T., et al. Cellular trafficking determines the exon skipping activity of Pip6a-PMO in mdx skeletal and cardiac muscle cells. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3207-3217 (2014).
  10. Hoyer, J., Neundorf, I. Peptide vectors for the nonviral delivery of nucleic acids. Accounts of Chemical Research. 45 (7), 1048-1056 (2012).
  11. Milletti, F. Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).
  12. Mueller, J., Kretzschmar, I., Volkmer, R., Boisguerin, P. Comparison of cellular uptake using 22 CPPs in 4 different cell lines. Bioconjugate Chemistry. 19 (12), 2363-2374 (2008).
  13. Ramaker, K., Henkel, M., Krause, T., Röckendorf, N., Frey, A. Cell penetrating peptides: a comparative transport analysis for 474 sequence motifs. Drug Delivery. 25 (1), 928-937 (2018).
  14. Maget-Dana, R. The monolayer technique: a potent tool for studying the interfacial properties of antimicrobial and membrane-lytic peptides and their interactions with lipid membranes. Biochimica Et Biophysica Acta. 1462 (1-2), 109-140 (1999).
  15. Alves, A. C., Ribeiro, D., Nunes, C., Reis, S. Biophysics in cancer: The relevance of drug-membrane interaction studies. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1858 (9), 2231-2244 (2016).
  16. Konate, K., et al. Peptide-based nanoparticles to rapidly and efficiently "Wrap 'n Roll" siRNA into cells. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 592-603 (2019).
  17. Seisel, Q., Pelletier, F., Deshayes, S., Boisguerin, P. How to evaluate the cellular uptake of CPPs with fluorescence techniques: Dissecting methodological pitfalls associated to tryptophan-rich peptides. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (9), 1533-1545 (2019).
  18. Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).
  19. Takayama, M., Itoh, S., Nagasaki, T., Tanimizu, I. A new enzymatic method for determination of serum choline-containing phospholipids. Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry. 79 (1), 93-98 (1977).
  20. Notman, R., Noro, M., O'Malley, B., Anwar, J. Molecular basis for Dimethylsulfoxide (DMSO) action on lipid membranes. Journal of the American Chemical Society. 128 (43), 13982-13983 (2006).
  21. Konate, K., et al. Insight into the cellular uptake mechanism of a secondary amphipathic cell-penetrating peptide for siRNA delivery. Biochemistry. 49 (16), 3393-3402 (2010).
  22. Vaissière, A., et al. A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 34 (2017).
  23. Eiríksdóttir, E., Konate, K., Langel, Ü, Divita, G., Deshayes, S. Secondary structure of cell-penetrating peptides controls membrane interaction and insertion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798 (6), 1119-1128 (2010).
  24. Ziegler, A., Li Blatter, X., Seelig, A., Seelig, J. Protein transduction domains of HIV-1 and SIV TAT interact with charged lipid vesicles. Binding mechanism and thermodynamic analysis. Biochemistry. 42 (30), 9185-9194 (2003).
  25. Thorén, P. E. G., Persson, D., Karlsson, M., Nordén, B. The Antennapedia peptide penetratin translocates across lipid bilayers - the first direct observation. FEBS Letters. 482 (3), 265-268 (2000).
  26. Mishra, A., et al. Translocation of HIV TAT peptide and analogues induced by multiplexed membrane and cytoskeletal interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (41), 16883-16888 (2011).
  27. Rouser, G., Fleischer, S., Yamamoto, A. Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5 (5), 494-496 (1970).
  28. Bartlett, G. R. Phosphorus assay in column chromatography. Journal of Biological Chemistry. 234 (3), 466-468 (1959).
  29. Stewart, J. C. M. Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate. Analytical Biochemistry. 104 (1), 10-14 (1980).
  30. Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571 (2012).
  31. Wimley, W. C. Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity. Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).
  32. Bárány-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gräslund, A. Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo. FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).
  33. van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. Membrane permeabilization by oligomeric α-Synuclein: in search of the mechanism. PloS One. 5 (12), 14292 (2010).
  34. Hassane, F. S., et al. Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).
  35. Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291 (2012).
  36. Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. Electrophysiological characterization of membrane transport proteins. Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).

Tags

Биохимия выпуск 166 проникающие в клетки пептиды мембрана фосфолипиды взаимодействие флуоресценция утечка
Анализ флуоресцентных утечек для исследования дестабилизации мембраны проникающим в клетки пептидом
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Konate, K., Seisel, Q., Vivès,… More

Konate, K., Seisel, Q., Vivès, E., Boisguérin, P., Deshayes, S. Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide. J. Vis. Exp. (166), e62028, doi:10.3791/62028 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter