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Biochemistry

सैकरोमाइसेस सेरेविसिया के मात्रात्मक मेटाबोलोमिक्स ने मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग किया

Published: January 5, 2021 doi: 10.3791/62061
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Concordia University, 2Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

Summary

हम खमीर सैकरोमाइसेस सेर्विसियामें पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स के प्रमुख वर्गों की पहचान और मात्रा के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। वर्णित विधि बहुमुखी, मजबूत और संवेदनशील है। यह एक दूसरे से पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स के संरचनात्मक आइसोमर्स और स्टीरियोसोमिक रूपों को अलग करने की अनुमति देता है।

Abstract

मेटाबोलोमिक्स एक कोशिका, ऊतक, अंग, जैविक तरल पदार्थ, या जीव के भीतर कई कम आणविक वजन वाले मध्यवर्ती और मेटाबोलिज्म के उत्पादों की पहचान और मात्राकरण के लिए उपयोग की जाने वाली एक पद्धति है। मेटाबोलोमिक्स पारंपरिक रूप से पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स पर केंद्रित है। पानी में घुलनशील मेटाबोलोम एक जटिल सेलुलर नेटवर्क का अंतिम उत्पाद है जो विभिन्न जीनोमिक, एपिजेनोमिक, ट्रांसक्रिप्टोमिक, प्रोटेओमिक और पर्यावरणीय कारकों को एकीकृत करता है। इसलिए, मेटाबोलॉमिक विश्लेषण सीधे विभिन्न जीवों के भीतर जैविक प्रक्रियाओं की अधिकता में इन सभी कारकों के लिए कार्रवाई के परिणाम का आकलन करता है। इन जीवों में से एक नवोदित खमीर सैकरोमाइसेस सेरेविसिया,पूरी तरह से अनुक्रमित जीनोम के साथ एक एकीय यूकेरियोट है। क्योंकि एस सेरेविसी व्यापक आणविक विश्लेषण के लिए उत्तरदायी है, इसका उपयोग यूकेरियोटिक सेल के भीतर कई जैविक प्रक्रियाओं में अंतर्निहित तंत्र को विच्छेदन करने के लिए एक मॉडल के रूप में किया जाता है। पानी में घुलनशील मेटाबोलोम के मजबूत, संवेदनशील और सटीक मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए एक बहुमुखी विश्लेषणात्मक विधि इन तंत्रों को विच्छेदन के लिए आवश्यक पद्धति प्रदान करेगी। यहां हम एस सेर्विसिया कोशिकाओं से मेटाबोलिक गतिविधि शमन और पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट निष्कर्षण की अनुकूलित स्थितियों के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल में निकाले गए पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस/एमएस) के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी के उपयोग का भी वर्णन किया गया है । यहां वर्णित गैर-लक्षित मेटाबोलोमिक्स की एलसी-एमएस/एमएस विधि बहुमुखी और मजबूत है । यह विभिन्न संरचनात्मक आइसोमर्स और इन मेटाबोलाइट्स के स्टीरियोसोमिक रूपों सहित विविध संरचनात्मक, भौतिक और रासायनिक गुणों के साथ 370 से अधिक पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स की पहचान और मात्राकरण को सक्षम बनाता है। इन मेटाबोलाइट्स में विभिन्न ऊर्जा वाहक अणु, न्यूक्लियोटाइड, अमीनो एसिड, मोनोसैकराइड्स, ग्लाइसोलिसिस के मध्यवर्ती और ट्राइकार्बोक्सिलिक चक्र मध्यवर्ती शामिल हैं। गैर-लक्षित मेटाबोलोमिक्स की एलसी-एमएस/एमएस विधि संवेदनशील है और सांद्रता पर कुछ पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स की पहचान और मात्रा को ०.०५ pmol/μL के रूप में कम करने की अनुमति देता है । इस विधि का सफलतापूर्वक उपयोग विभिन्न परिस्थितियों में सुसंस्कृत जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती खमीर कोशिकाओं के पानी में घुलनशील चयापचय का आकलन करने के लिए किया गया है ।

Introduction

पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स कम आणविक वजन वाले मध्यवर्ती और मेटाबॉलिज्म के उत्पाद हैं जो आवश्यक सेलुलर प्रक्रियाओं में योगदान देते हैं। इन विकासवादी संरक्षित प्रक्रियाओं में पोषक तत्वों को उपयोग करने योग्य ऊर्जा में परिवर्तित करना, मैक्रोमॉलिक्यूल्स का संश्लेषण, सेलुलर विकास और सिग्नलिंग, सेल चक्र नियंत्रण, जीन अभिव्यक्ति का विनियमन, तनाव प्रतिक्रिया, मेटाबॉलिज्म के पोस्ट-ट्रांसलेशनल रेगुलेशन, माइटोकॉन्ड्रियल कार्यक्षमता का रखरखाव, वेसिकुलर सेलुलर ट्रैफिकिंग, ऑटोफैगी, सेलुलर एजिंग, और विनियमित सेल डेथ1,2,3शामिल हैं ।

पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स की इन आवश्यक भूमिकाओं में से कई नवोदित खमीर एस सेरेविसिया1 ,3,4,7,9,14,15, 16, 17,18,19,20,21,22,22में अध्ययन द्वारा खोजे गए हैं। यह एककोशिकीय यूकेरियोट तंत्र को विच्छेदन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल जीव है जिसके माध्यम से पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स उन्नत जैव रासायनिक, आनुवंशिक और आणविक जैविक विश्लेषण23, 24,25, 26के लिए अपनी योग्यता के कारण सेलुलर प्रक्रियाओं में योगदानदेतेहैं। यद्यपिनवोदित खमीर3,18,22, 27में पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स की भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए गैर-लक्षित मेटाबोलोमिक्स के एलसी-एमएस/एमएस तरीकों का उपयोग किया गया है, लेकिन इस प्रकार के विश्लेषण में इसकी बहुमुखी प्रतिभा, मजबूती, संवेदनशीलता और विभिन्न संरचनात्मक आइसोमर्स और इन मेटाबोलाइट्स के स्टीरियोसोमिक रूपों के बीच अंतर करने की क्षमता में सुधार की आवश्यकता है।

हाल के वर्षों में वीवो में पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स की प्रोफाइलिंग के लिए गैर-लक्षित मेटाबोलोमिक्स के एलसी-एमएस/एमएस तरीकों को लागू करने में महत्वपूर्ण प्रगति के रूप में चिह्नित किया गया है । हालांकि , इस पद्धति का उपयोग करने में अनकंस चुनौतियां 2,28,29,30,32,32,33,34,35,36तक बनी हुई हैं . इन चुनौतियों में निम्नलिखित शामिल हैं। सबसे पहले, कई पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स की इंट्रासेलुलर सांद्रता वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले तरीकों के लिए संवेदनशीलता की दहलीज से नीचे हैं। दूसरा, मेटाबोलिक गतिविधि शमन की दक्षता बहुत कम है, और वर्तमान तरीकों के लिए इंट्रासेलुलर मेटाबोलाइट्स के शमन से जुड़े सेल रिसाव की सीमा बहुत अधिक है; इसलिए, वर्तमान में उपयोग की जाने वाली विधियां पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स की इंट्रासेलुलर सांद्रता का अनुमान लगा रही हैं। तीसरा, मौजूदा तरीके संरचनात्मक आइसोमर्स (यानी, एक ही रासायनिक सूत्र लेकिन विभिन्न परमाणु कनेक्टिविटी के साथ अणुओं) या स्टीरियोसोमर (यानी, एक ही रासायनिक सूत्र और परमाणु कनेक्टिविटी के साथ अणुओं) में अंतर नहीं कर सकते हैं, लेकिन अंतरिक्ष में विभिन्न परमाणु व्यवस्था के साथ) विशिष्ट मेटाबोलाइट्स; यह वर्तमान में उपयोग किए गए तरीकों से कुछ मेटाबोलाइट्स के सही एनोटेशन को रोकता है। चौथा, माता-पिता आयनों (एमएस 1) और माध्यमिक आयनों (एमएस 2) के मौजूदा बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रल ऑनलाइन डेटाबेस अधूरे हैं; यह वर्तमान तरीकों की सहायता से उत्पादित कच्चे एलसी-एमएस/एमएस डेटा का उपयोग करके विशिष्ट मेटाबोलाइट्स की सही पहचान और मात्रा को प्रभावित करता है । पांचवां, मौजूदा तरीके पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स के सभी या अधिकांश वर्गों को ठीक करने के लिए एक ही प्रकार के मेटाबोलाइट निष्कर्षण का उपयोग नहीं कर सकते हैं। छठा, मौजूदा तरीके एक-दूसरे से अलग करने के लिए एक ही प्रकार के एलसी कॉलम का उपयोग नहीं कर सकते हैं, जो पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स के सभी या अधिकांश वर्गों से अलग होता है।

यहां, हमने एस सेरेविसिया कोशिकाओं के भीतर मेटाबोलिक गतिविधि को बुझाने के लिए शर्तों को अनुकूलित किया, निष्कर्षण से पहले इन कोशिकाओं के भीतर अधिकांश पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स को बनाए रखा, और खमीर कोशिकाओं से पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स के अधिकांश वर्गों को निकालने। हमने एस सेरेविसिया कोशिकाओं से निकाले गए 370 से अधिक पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स की एलसी-एमएस/एमएस आधारित पहचान और मात्राकरण के लिए एक बहुमुखी, मजबूत और संवेदनशील विधि विकसित की। गैर-लक्षित मेटाबोलोमिक्स की यह विधि विभिन्न ऊर्जा वाहक अणुओं, न्यूक्लियोटाइड्स, अमीनो एसिड, मोनोसैकराइड्स, ग्लाइकोलिस के मध्यवर्ती और ट्राइकार्बोक्सिलिक चक्र मध्यवर्ती के इंट्रासेलुलर सांद्रता का आकलन करने में सक्षम बनाती है। विकसित एलसी-एमएस/एमएस विधि विविध संरचनात्मक, भौतिक और रासायनिक गुणों के साथ पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स के विभिन्न संरचनात्मक आइसोमर्स और स्टीरियोसोमिक रूपों की पहचान और मात्रा की अनुमति देती है ।

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Protocol

1. खमीर उगाने और बंध्याकरण करने के लिए एक माध्यम बनाना और बंध्याकरण करना

  1. बैक्टोपेटोन (वाईपी) माध्यम के साथ एक पूर्ण खमीर निकालने का 180 एमएल बनाएं। पूर्ण वाईपी माध्यम में 1% (w/v) खमीर निकालने और 2% (w/v) बैक्टोपेटोन शामिल हैं ।
  2. वाईपी माध्यम के 180 एमएल को समान रूप से चार 250 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में वितरित करें। इनमें से प्रत्येक फ्लास्क में वाईपी माध्यम का 45 एमएल होता है।
  3. 45 मिनट के लिए 15 साई/121 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेविंग द्वारा वाईपी माध्यम के साथ फ्लास्क को स्टरलाइज करें।

2. जंगली प्रकार खमीर तनाव

  1. BY4742(MATα his3Ο1 leu2Ο0 lys2Ο0 ura3Ο0)तनाव का प्रयोग करें।

3. 2% ग्लूकोज युक्त वाईपी माध्यम में खमीर बढ़ रहा है

  1. ग्लूकोज के 20% (w/v) स्टॉक समाधान को 45 मिनट के लिए 15 साई/121 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेविंग करके स्टरलाइज करें।
  2. निष्फल वाईपी माध्यम के 45 एमएल के साथ दो एर्लेनमेयर फ्लास्क में से प्रत्येक में ग्लूकोज के 5 एमएल (w/v) स्टॉक समाधान जोड़ें। वाईपी माध्यम में अंतिम एकाग्रता ग्लूकोज 2% (w/v) है।
  3. 2% ग्लूकोज युक्त वाईपी माध्यम के साथ दो एर्लेनमेयर फ्लास्क में से प्रत्येक में खमीर कोशिकाओं को टीका लगाने के लिए एक माइक्रोबायोलॉजिकल लूप का उपयोग करें।
  4. 200 आरपीएम पर सेट एक घूर्णन शेखर में 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर खमीर कोशिकाओं को बढ़ाएं।
  5. खमीर संस्कृति का एक aliquot ले लो। संस्कृति के एमसीएल प्रति खमीर कोशिकाओं की कुल संख्या निर्धारित करें। हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।

4. सेल हस्तांतरण करने के लिए और सेल 2% ग्लूकोज के साथ वाईपी माध्यम में बढ़ता है

  1. ऑटोक्लेव वाईपी माध्यम के साथ शेष दो एर्लेनमेयर फ्लास्क में से प्रत्येक में ग्लूकोज के निष्फल 20% (w/v) स्टॉक समाधान का 5 एमएल जोड़ें। ग्लूकोज की अंतिम एकाग्रता 2% (w/v) है ।
  2. 2% ग्लूकोज के साथ वाईपी माध्यम में रातोंरात खमीर संस्कृति की मात्रा स्थानांतरित करें जिसमें 2% ग्लूकोज युक्त वाईपी माध्यम के साथ दो एर्लेनमेयर फ्लास्क में से प्रत्येक में 5.0 x 107 कोशिकाओं की कुल संख्या शामिल है। सेल ट्रांसफर के लिए बाँझ पिपेट का उपयोग करें।
  3. 200 आरपीएम पर सेट एक घूर्णन शेखर में 30 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 24 घंटे (या अधिक, यदि प्रयोग की आवश्यकता होती है) के लिए खमीर कोशिकाओं को बढ़ाएं।

5. रिएजेंट बनाना, लैबवेयर तैयार करना, और सेल शमन के लिए उपकरण स्थापित करना

  1. निम्नलिखित तैयार करें: 1) 155 एमएल अमोनियम बाइकार्बोनेट (एबीसी) बफर, पीएच = 8.0 में एक शमन समाधान (60% उच्च ग्रेड (>99.9%) मेथनॉल); 2) एक बर्फ ठंडा एबीसी समाधान (पीएच = 8.0); 3) एक डिजिटल थर्मामीटर -20 डिग्री सेल्सियस तक मापने में सक्षम; 4) 500 एमएल बड़ी सेंट्रलाइज बोतलें; 5) इस रोटर के लिए प्री-कूल्ड रोटर और प्री-कूल्ड 500 एमएल सेंट्रलाइज बोतलों के साथ एक प्री-कूल्ड हाई-स्पीड सेंट्रलाइज, सभी -5 डिग्री सेल्सियस पर; 6) मेटाबोलाइट निष्कर्षण ट्यूब (पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन लाइन वाली टोपियां के साथ 15 एमएल हाई-स्पीड ग्लास सेंट्रलाइज ट्यूब); और 7) सूखी बर्फ।

6. सेल शमन

  1. 2% ग्लूकोज संस्कृति के साथ वाईपी के एमसीएल प्रति खमीर कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करें।
  2. 2% ग्लूकोज के साथ वाईपी माध्यम में संस्कृति की मात्रा स्थानांतरित करें जिसमें 5.0 x 108 कोशिकाओं की कुल संख्या पूर्व-कूल्ड 500 एमएल सेंट्रलाइज बोतलों में होती है।
  3. -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत शमन समाधान के साथ 200 एमएल की मात्रा तक कोशिकाओं वाली अपकेंद्रित्र बोतल को जल्दी से भरें।
  4. अपकेंद्रित्र -5 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 11,325 x ग्राम पर एक उच्च गति अपकेंद्रित्र में बोतलों को अपकेंद्रित्र।
  5. जल्दी और कोमलता से अपकेंद्रित्र से बोतल ठीक; धीरे-धीरे ढक्कन को खोलें और गोली को परेशान किए बिना सुपरनेट को हटा दें।
  6. बर्फ-ठंडे एबीसी बफर के 10 एमएल में सेल पेलेट को जल्दी से फिर से खर्च करें और निलंबन को मेटाबोलाइट निष्कर्षण के लिए पॉलीटट्राफ्लोरोएथिलीन-लाइन वाली टोपी के साथ 15 एमएल हाई-स्पीड ग्लास सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  7. 0 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर एक नैदानिक अपकेंद्रित्र में अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को ले लीजिए।
  8. जल्दी से सुपरनेट निकालें और मेटाबोलाइट निष्कर्षण शुरू करने के लिए सूखी बर्फ पर ट्यूब रखें या निष्कर्षण तक ट्यूब को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. मेटाबोलाइट निष्कर्षण के लिए रिएजेंट्स, लैबवेयर और उपकरण तैयार करना

  1. निम्नलिखित तैयार करें: 1) एलसी-एमएस ग्रेड क्लोरोफॉर्म; 2) एलसी-एमएस ग्रेड मेथनॉल; 3) एलसी ग्रेड नैनो शुद्ध पानी; 4) एलसी-एमएस ग्रेड (एसीएन); 5) कांच के मोती (एसिड-धोया, 425-600 माइक्रोन); 6) रिटेनर के साथ फोम ट्यूब होल्डर किट के साथ एक भंवर; 7) पॉलीटीट्राफ्लोरोएथिलीन-लाइन वाली टोपियां के साथ 15 एमएल हाई-स्पीड ग्लास सेंट्रलफ्यूज ट्यूब; 8) एमएस शीशियां; 9) सूखी बर्फ; और 10) 1.5 एमएल ट्यूब इथेनॉल के साथ एक बार धोया, एक बार एसीएन के साथ और एक बार नैनो-शुद्ध पानी के साथ।
    नोट: केवल माइक्रोपिपेट युक्तियों और पॉलीप्रोपाइलीन से बने ट्यूब का उपयोग करें जो कार्बनिक सॉल्वैंट्स के लिए प्रतिरोधी हैं।

8. मेटाबोलाइट निष्कर्षण

  1. सूखी बर्फ पर रखे गए मेटाबोलाइट्स के लिए या चरण 6.7 से -80 डिग्री सेल्सियस ट्यूब पर संग्रहीत, निम्नलिखित जोड़ें: 1) क्लोरोफॉर्म का 2 एमएल -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत; 2) -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत मेथनॉल का 1 एमसीएल; 3) बर्फ के 1 एमएल ठंडे नैनो-शुद्ध पानी; और 4) 425-600 माइक्रोन एसिड से धुले कांच के मोतियों के 200 माइक्रोन।
  2. कवर और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ एक ट्यूब के मुंह बंद करो। रिटेनर के साथ एक फोम ट्यूब धारक किट में ट्यूब रखें और उन्हें मध्यम गति पर 30 मिनट के लिए भंवर (यानी, 6 पर सेट की गई गति पर, 12 भंवर की अधिकतम गति के साथ) 4 डिग्री सेल्सियस पर मेटाबोलाइट निष्कर्षण की सुविधा के लिए।
  3. प्रोटीन वर्षा को बढ़ावा देने और निचले कार्बनिक चरण से ऊपरी जलीय के पृथक्करण को बढ़ावा देने के लिए बर्फ (सूखी बर्फ नहीं!) पर 15 मिनट के लिए ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर एक नैदानिक अपकेंद्रित्र में ट्यूब अपकेंद्रित्र। यह अपकेंद्रित्र चरण ऊपरी जलीय चरण (जिसमें पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स होते हैं) को मध्य परत से अलग करने की अनुमति देता है (जिसमें सेल मलबे और प्रोटीन होते हैं) और निचले कार्बनिक चरण (जिसमें ज्यादातर लिपिड होते हैं)।
  5. ऊपरी जलीय चरण (400 माइक्रोल) को धोए गए और लेबल 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए माइक्रोपिपेट का उपयोग करें जिसमें ACN के 800 माइक्रोन होते हैं जो -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था।
    नोट: -20 डिग्री सेल्सियस पर रखे गए एसीएन में ऊपरी जलीय चरण को जोड़ने के बाद सफेद बादल वर्षा होगी।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 13,400 x ग्राम पर एक टेबलटॉप सेंट्रलाइज में नमूने के साथ ट्यूब अपकेंद्रित्र।
    नोट: सफेद बादल वर्षा अपकेंद्रित्र के बाद गायब हो जाएगा ।
  7. ट्यूब में एक तरल के ऊपरी हिस्से से 800 माइक्रोन को लेबल किए गए एमएस शीशी में स्थानांतरित करें। नमूना को 0 डिग्री सेल्सियस पर तब तक स्टोर करें जब तक कि इसका विश्लेषण एलसी-एमएस/एमएस द्वारा न किया जाए ।

9. एलसी के लिए रिएजेंट्स, लैबवेयर और उपकरणों की तैयारी

  1. निम्नलिखित तैयार करें: 1) एक भंवर; 2) एक अल्ट्रासोनिक सोनिकेटर; 3) एमएस ग्लास शीशियां; 4) बाइनरी पंप, डेगासर और ऑटोसंप्लर से लैस एक एलसी सिस्टम; 5) सामग्रीकी तालिका में नाम एक zwitterionic चरण क्रोमेटोग्राफी कॉलम (5 माइक्रोन बहुलक, 150 x 2.1 मिमी) 6) एक कॉलम हीटर; और 7) चरण ए (5:95 एसीएन: पानी (v/v) 20 mm अमोनियम एसीटेट, पीएच = ८.०) और चरण बी (१००% ACN) के साथ सहित मोबाइल चरणों, ।

10. एलसी द्वारा निकाले गए मेटाबोलाइट्स का पृथक्करण

  1. 15 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक सोनीशन के लिए एमएस शीशी की सामग्री विषय।
  2. भंवर कमरे के तापमान (आर टी) पर 10 सेकंड के लिए एमएस शीशी 3x ।
  3. एमएस शीशी को अच्छी तरह से प्लेट में रखें।
  4. क्रोमेग्राफ के दौरान कॉलम को 45 डिग्री सेल्सियस और 0250 एमएल/मिनट की फ्लो रेट में बनाए रखें । सैंपल को वेल प्लेट में 0 डिग्री सेल्सियस पर रखें। क्रोमेटोग्राफी के दौरान उपयोग किए जाने वाले एलसी ग्रेडिएंट्स के लिए तालिका 1 को देखें।
    नोट: जंगली प्रकार के तनाव BY4742 की कोशिकाओं से निकाले गए पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स का एक प्रतिनिधि कुल आयन क्रोमोग्राम चित्र 1में दिखाया गया है । एलसी द्वारा अलग किए गए मेटाबोलाइट्स की पहचान की गई और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा मात्रा निर्धारित की गई थी जो सकारात्मक आयनीकरण [ईएसआई (+)] मोड में किया गया था, जैसा कि चरण 11 के लिए वर्णित है।

11. एलसी द्वारा अलग मेटाबोलाइट्स के बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण

  1. एलसी द्वारा अलग किए गए पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स की पहचान और मात्रा के लिए गर्म इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (एचईएसआई) से लैस एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करें। MS1 आयनों के लिए मास स्पेक्ट्रोमीटर के एनालाइजर और MS2 आयनों के लिए मास स्पेक्ट्रोमीटर के डिटेक्टर का उपयोग करें। क्रमशः MS1 और MS2 आयनों के डेटा-निर्भर अधिग्रहण के लिए तालिका 2 और तालिका 3 में प्रदान की गई सेटिंग्स का उपयोग करें।
  2. ईएसआई (+) और ईएसआई (-) दोनों मोड में इंजेक्शन के लिए 10 माइक्रोन के एक नमूना मात्रा का उपयोग करें।

12. एलसी-एमएस/एमएस से कच्चे डेटा के प्रसंस्करण के द्वारा विभिन्न मेटाबोलाइट्स की पहचान और मात्रा

  1. कच्चे एलसी-एमएस/एमएस फाइलों से विभिन्न जल-घुलनशील मेटाबोलाइट्स की पहचान और मात्रा का संचालन करने के लिए सामग्री की तालिका में नामित सॉफ्टवेयर का उपयोग करें । यह सॉफ्टवेयर मेटाबोलाइट क्वांटिटेशन के लिए एमएस1 और मेटाबोलाइट आइडेंटिफिकेशन के लिए एमएस 2 का इस्तेमाल करता है। सॉफ्टवेयर एमएस स्पेक्ट्रा मिलान द्वारा एलसी-एमएस/एमएस कच्चे डेटा का उपयोग कर मेटाबोलाइट्स को एनोटेट करने के लिए सबसे बड़े पैमाने पर क्यूरेटेड मास स्पेक्ट्रल विखंडन पुस्तकालय का शोषण करता है । यह सॉफ्टवेयर ऑनलाइन डेटाबेस का उपयोग करके मेटाबोलाइट्स को एनोटेट करने के लिए MS1 और आइसोटोप पैटर्न मैच के सटीक द्रव्यमान का भी उपयोग करता है। विवरण के लिए चित्रा 2 देखें।
  2. डेटाबेस और स्पेक्ट्रा की लाइब्रेरी का उपयोग करें, जो कच्चे डेटा के MS2 स्पेक्ट्रा की खोज करने के लिए ऑनलाइन (https://www.mzcloud.org) स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है।

13. प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) धुंधला और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा झिल्ली अखंडता परख

  1. चरण 6 के लिए वर्णित सेल शमन के बाद, शमन समाधान को हटाने के लिए एबीसी बफर के 15 एमएल के साथ शमन कोशिकाओं को अच्छी तरह से धोएं। 0 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को ले लीजिए।
  2. एबीसी बफर के 1 एमएल में सेल पेलेट को फिर से रीसुपेंड करें और पीआई सॉल्यूशन (0.5 मिलीग्राम/एमएल) का 0.5 एमएल जोड़ें।
  3. भंवर 10 एस के लिए नमूना 3x के साथ एक ट्यूब और अंधेरे में और बर्फ पर 10 मिनट के लिए यह इनक्यूबेट ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 13,400 x ग्राम पर एक टेबलटॉप सेंट्रलाइज में नमूने के साथ ट्यूब अपकेंद्रित्र।
  5. सुपरनेट निकालें और एबीसी बफर के 1 एमएल में गोली को फिर से खर्च करें।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 13,400 x ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र करें और सुपरनैंट को हटा दें। सेल की सतह से बंधे पीआई को हटाने के लिए इस चरण को 2 बार और दोहराएं।
  7. एबीसी बफर के 300 माइक्रोल में गोली को फिर से रीसुस्ल करें। एक माइक्रोस्कोप स्लाइड की सतह पर निलंबन के 10 μL रखें।
  8. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियों को कैप्चर करें। 593 एनएम और 636 एनएम (क्रमशः) की उत्तेजन और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य पर सेट किए गए फ़िल्टर का उपयोग करें।
  9. कुल सेल नंबर (डीआईसी मोड में) और फ्लोरोसेंटली दाग कोशिकाओं की संख्या को गिनने के लिए एक सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। इसके अलावा, व्यक्तिगत कोशिकाओं के लिए धुंधला की तीव्रता निर्धारित करने के लिए इस सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।

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Representative Results

एक खमीर कोशिका के भीतर पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स के मात्रात्मक आकलन में सुधार करने के लिए, हमने मेटाबोलाइट डिटेक्शन के लिए सेल शमन की शर्तों को अनुकूलित किया। इस उद्देश्य के लिए सेल शमन में एक कक्ष 31 ,33,37,38के भीतर सभी एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं की तेजी से गिरफ्तारी शामिल है । सेलुलर मेटाबोलिक गतिविधि की ऐसी गिरफ्तारी वीवो में पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स के मात्रा के लिए किसी भी विधि का एक अनिवार्य कदम है क्योंकि यह उनके इंट्रासेलुलर सांद्रता31 , 33,37,38के कम अनुमान को रोकता है। मेटाबोलाइट मूल्यांकन के लिए सेल शमन हमेशा प्लाज्मा झिल्ली (पीएम) (और सेल वॉल (CW) की अखंडता को ख़राब करता है, यदि वर्तमान है; इस सेल 31 ,33 , 37,38से मेटाबोलाइट रिसाव का कारण बनता है . विधि कोशिका शमन स्थितियों को नियोजित करती है जो ऐसी हानि को कम करती है, जिससे इंट्रासेलुलर मेटाबोलाइट्स के शमन-संबद्ध सेल रिसाव में काफी कमी आई है। दरअसल, सेल शमन के लिए अधिकांश वर्तमान तरीकों में मेथनॉल की एक निश्चित एकाग्रता का उपयोग शामिल है (यानी, विशिष्ट तापमान (यानी,-20 डिग्री सेल्सियस, -40 डिग्री सेल्सियस, या -60 डिग्री सेल्सियस) पर 40% (v/v),60% (v/v),80%(v/v), या 100% (v/v)) हमने वर्तमान में उपयोग की जाने वाली सेल शमन विधि (यानी, एक बफर38की अनुपस्थिति में -40 डिग्री सेल्सियस पर 80% (v/v) मेथनॉल के साथ सेल उपचार द्वारा संशोधित सेल शमन विधि (यानी, पीएच = 8.0 पर एबीसी के एक आइसोटोनिक बफर समाधान की उपस्थिति में -20 डिग्री सेल्सियस पर 60% (v/v) मेथनॉल के साथ सेल उपचार द्वारा) । पीआई एक फ्लोरोसेंट डाई है जो बरकरार कोशिकाओं के लिए अभेद्य है; यह सेल में प्रवेश कर सकते हैं तभी पीएम की अखंडता (और सीडब्ल्यू की, अगर वर्तमान)बिगड़ाहुआ है . इसके अलावा, पीजीआइ द्वारा फ्लोरेसेंस उत्सर्जन की तीव्रता डीएनए या आरएनए 39 से बंधे होने पर30गुना बढ़ जाती है। इस प्रकार, इंट्रासेलुलर मेटाबोलाइट्स के शमन-संबद्ध सेल रिसाव की दक्षता का आकलन करने के लिए पीआई धुंधला परख का उपयोग किया जा सकता है क्योंकि ये मेटाबोलाइट्स तभी बाह्य अंतरिक्ष में रिसाव कर सकते हैं जब खमीर कोशिका के पीएम और सीडब्ल्यू39क्षतिग्रस्त हो जाएं। हमने पाया कि संशोधित सेल शमन विधि -40 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 3)पर गैर-बफर 80% (v/v) मेथनॉल के साथ सेल उपचार द्वारा शमन विधि की तुलना में पीएम और सीडब्ल्यू को काफी कम नुकसान पहुंचाती है। दरअसल, लगभग सभी कोशिकाओं को लाल फ्लोरेसेंस उत्सर्जन प्रदर्शित विधि का उपयोग करके शमन के अधीन किया गया है, जो खमीर कोशिकाओं की विशेषता है जिनके प्रधानमंत्री और सीडब्ल्यू क्षतिग्रस्त नहीं हैं(चित्र 3)। इसके विपरीत, लगभग सभी कोशिकाओं को अन्य विधि का उपयोग करके शमन के अधीन, खमीर कोशिकाओं की हरी फ्लोरेसेंस उत्सर्जन विशेषता प्रदर्शित की गई, जिनके प्रधानमंत्री और सीडब्ल्यू काफी क्षतिग्रस्त हैं(चित्र 3)। सबसे तीव्र लाल फ्लोरेसेंस को मजबूत लाल फ्लोरेसेंस और हल्के लाल फ्लोरेसेंस उत्सर्जन के बीच अंतर करने के लिए एक सॉफ्टवेयर द्वारा हरे रंग की फ्लोरेसेंस में परिवर्तित किया गया था।

संशोधित सेल शमन विधि के कारण-40 डिग्री सेल्सियस पर गैर-बफर 80% (v/v) मेथनॉल के साथ सेल उपचार द्वारा सेल उपचार द्वारा शमन विधि की तुलना में खमीर कोशिकाओं से पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स का रिसाव काफी कम हो गया। हमने पीएच = 8.0 पर एबीसी के आइसोटोनिक बफर समाधान की उपस्थिति में -20 डिग्री सेल्सियस पर 60% (v/v) मेथनॉल के साथ सेल उपचार द्वारा (यानी, सेल उपचार द्वारा- 8.0) का उपयोग करके शमन करने के लिए खमीर कोशिकाओं की समान संख्या का अधीन किया; अंक 4) या दूसरी विधि (यानी, सेल ट्रीटमेंट द्वारा गैर-बफर 80% (v/v) मेथनॉल के साथ -40 डिग्री सेल्सियस पर; चित्रा 5)। एलसी-एमएस/एमएस की सहायता से विशिष्ट जल-घुलनशील मेटाबोलाइट्स के लिए बाह्य-संबद्ध कोशिका रिसाव की सीमा का आकलन किया गया था । एक्सट्रासेलुलर समाधान में विभिन्न अमीनो एसिड कक्षाओं (यानी, बड़े और छोटे अम्लीय, बुनियादी, तटस्थ-गैर-ध्रुवीय और तटस्थ ध्रुवीय अमीनो एसिड) की सांद्रता को सेल शमन से पहले और बाद में मापा गया था। हमने पाया कि सेल शमन विधि इन सभी अमीनो एसिड वर्गों के अन्य विधि (चित्रा5)की तुलना में बाहुलीय समाधान(चित्रा 4)में काफी कम रिसाव का कारण बनती है।

एक खमीर कोशिका के भीतर पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए एलसी-एमएस/एमएस विधि सभी पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट कक्षाओं के क्रोमेग्राफिक जुदाई के लिए कॉलम के एक प्रकार का उपयोग करता है । यह कॉलम सामग्री की तालिका में नामित zwitterionic-चरण स्तंभ है। हमने पाया कि यह कॉलम टेबल ऑफ मैटेरियल्स (पूरक तालिका 1)में नामित रिवर्स-चरण कॉलम की तुलना में पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स के विभिन्न वर्गों का अधिक कुशल पृथक्करण प्रदान करता है। दरअसल, पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट मानकों (यानी, एनएडी +, एएमपी, जीएमपी, आर्जिनिन और ग्लूटामिक एसिड) के अवधारण समय (आरटी) शिफ्ट मूल्य काफी कम थे और रिवर्स-चरण कॉलम(पूरक तालिका 1)की तुलना में zwitterionic-चरण कॉलम के लिए चोटी के आकार काफी तेज थे। रिवर्स-फेज कॉलम के लिए सभी मेटाबोलाइट्स (यानी, पानी में घुलनशील और पानी-अघुलनशील) के क्रोमेग्राफिक पृथक्करण के लिए उपयोग की जाने वाली एलसी स्थितियां पूरक तालिका 2में प्रदान की जाती हैं।

एलसी-एमएस/एमएस विधि का एक और लाभ उपरोक्त zwitterionic-चरण कॉलम पर क्रोमेट्रोग्राफिक अलगाव की क्षमता में होते हैं ताकि विविध संरचनात्मक, भौतिक और रासायनिक गुणों के साथ एक-दूसरे के अलग-अलग पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स से कुशलतापूर्वक अलग हो सके। इन पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स में निम्नलिखित मेटाबोलाइट कक्षाएं शामिल हैं: 1) अम्लीय, बुनियादी, तटस्थ ध्रुवीय, और गैर-तटस्थ ध्रुवीय अमीनो एसिड, जिसमें उनके विभिन्न संरचनात्मक आइसोमर(चित्रा 6); 2) स्थिर और अस्थिर न्यूक्लियोटाइड और उनके व्युत्पन्न जो एक कोशिका के भीतर महत्वपूर्ण कार्यकरते हैं (चित्र 7); और 3) विभिन्न मोनोसैकराइड्स, जिनमें उनके विभिन्न स्टीरियोसोमिक रूप(चित्र 8) शामिल हैं।

महत्वपूर्ण बात यह है कि खमीर कोशिका के भीतर पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स के मात्रात्मक आकलन के लिए एलसी-एमएस/एमएस विधि बहुमुखी और मजबूत थी । इसने हमें एस सेरेविसिया कोशिकाओं में विविध संरचनात्मक, भौतिक और रासायनिक गुणों के साथ 374 पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स की पहचान करने और निर्धारित करने की अनुमति दी जो शुरू में 2% ग्लूकोज(पूरक तालिका 3)वाले पूर्ण वाईपी माध्यम में सुसंस्कृत थे। पॉजिटिव आयनाइजेशन मोड में 240 मेटाबॉलिज् म पाए गए और निगेटिव आयनाइजेशन मोड में 134 मेटाबॉलिज् म पाए गए। इन सभी पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स की पहचान की पुष्टि उनके डेटा-निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) MS2 टुकड़ों को एमएस 2 एमजेडक्लाउड स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी में सकारात्मक और नकारात्मक आयनीकरण मोड में प्राप्त करके की गई थी। इस ऑनलाइन लाइब्रेरी में मेटाबोलाइट मानकों का स्पेक्ट्रा शामिल है जो उनके एमएस1 और डीडीए एमएस 2 मापदंडों में भिन्न है। ऑनलाइन स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी के साथ नमूने के MS2 स्पेक्ट्रा के मिलान की सीमा को अधिकतम करने के लिए, हमने डीडीए के विभिन्न पैरामीटरों का उपयोग किया। ये पैरामीटर पूरक तालिका 4में प्रदान किए जाते हैं। एक ही नमूने के लिए लगभग 6,000 विशेषताएं (ख्यात मेटाबोलाइट्स) उच्च ऊर्जा-प्रेरित-टकराव-विघटन (एचसीडी) या टकराव-प्रेरित वियोजन (सीआईडी) विखंडन विधि की मदद से प्राप्त की गई थीं, जिसमें शीर्ष 5 एमएस2 घटनाओं, 35 टकराव ऊर्जा मूल्यों और 10 एमएस सक्रियण समय का उपयोग किया गया था। > 95% MS2 मिलान और > 90% MS1 आइसोटोपिक पैटर्न मिलान मानदंडों के साथ परिणामी फ़ाइलों को फ़िल्टर करने के बाद, एचसीडी खंडित स्थिति के तहत केवल 162 मेटाबोलाइट्स और सीआईडी खंडित स्थिति के तहत 142 मेटाबोलाइट्स की पहचान की गई थी। 162 मेटाबोलाइट्स में से 81 एचसीडी विखंडन विधि के लिए अद्वितीय थे, जबकि 142 में से 42 सीआईडी विखंडन विधि के लिए अद्वितीय थे (पूरक तालिका 4में "T5_35E__10 ms_HCD बनाम सीआईडी" नाम की एक शीट देखें)। इसलिए, हमने निष्कर्ष निकाला कि एलसी-एमएस/एमएस विधि की सहायता से पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स के सही एनोटेशन के लिए कई अलग-अलग डीडीए एमएस2 मापदंडों के उपयोग की आवश्यकता है।

एलसी-एमएस/एमएस विधि भी अत्यधिक संवेदनशील है। यह 0.05 पीएमओएल/μL के रूप में कम सांद्रता पर कुछ पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स की पहचान और मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है (तालिका 4में फेनिलैनिन के लिए डेटा देखें)। क्वांटिटेशन की यह सीमा विभिन्न मेटाबोलाइट वर्गों(तालिका 4)के लिए सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला के भीतर भिन्न होती है।

यहां उपयोग की जाने वाली एमएस प्रणाली में विभिन्न मेटाबोलाइट्स(पूरक तालिका 5)की सांद्रता को मापने के लिए एक विस्तृत (परिमाण के कम से कम दो आदेश) रैखिक गतिशील रेंज है।

Figure 1
चित्र 1:तरल क्रोमेटोग्राफी/मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) से कुल आयन क्रोमेटोग्राम (एलसी-एमएस) पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स के डेटा जो जंगली प्रकार के तनाव BY4742 की कोशिकाओं से निकाले गए थे । मेटाबोलाइट्स को एलसी द्वारा सामग्री की तालिका में नामित zwitterionic-चरण क्रोमेटोग्राफी कॉलम पर अलग किया गया था। मेटाबोलाइट्स का पता एमएस ऑफ पैरेंट आयनों (एमएस1) द्वारा लगाया गया था जो सकारात्मक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मोड का उपयोग करके बनाए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:सामग्री की तालिका में नामित सॉफ्टवेयर की मदद से पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स के विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाने वाला एक कार्यप्रवाह। सभी मापदंडों को निम्नलिखित को छोड़कर एमएस कच्चे डेटा के आधार पर सॉफ्टवेयर द्वारा स्वचालित किया गया था: 1) "यौगिकों का पता लगाएं" टैब: सेट मिन, पीक तीव्रता 10,000; और 2) "खोज केमस्पिडर" टैब: बायोसाइक, ह्यूमन मेटाबोलोम डेटाबेस, केजीजी और यीस्ट मेटाबोलोम डेटाबेस सहित मेटाबोलाइट्स की पहचान के लिए 4 ऑनलाइन डेटाबेस का चयन किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी; शीर्ष पंक्ति) और फ्लोरेसेंस (निचली पंक्ति) खमीर कोशिकाओं की सूक्ष्म छवियों या तो अमोनियम बाइकार्बोनेट (एबीसी) बफर (पीएच = ८.०; नियंत्रण) या एक अलग शमन समाधान के साथ शमन । सेल शमन के बाद, कोशिकाओं की बराबर संख्या अंधेरे में और बर्फ पर 10 मिनट के लिए PI समाधान के साथ इनक्यूबेटेड थे । सबसे तीव्र लाल फ्लोरेसेंस को मजबूत लाल फ्लोरेसेंस और हल्के लाल फ्लोरेसेंस उत्सर्जन के बीच अंतर करने के लिए सॉफ्टवेयर द्वारा हरे रंग की फ्लोरेसेंस में परिवर्तित किया गया था। पीएम और सीडब्ल्यू को नुकसान की दक्षता की तुलना सेल शमन की विधि (यानी पीएच = 8.0 पर एबीसी के आइसोटोनिक बफर समाधान की उपस्थिति में -20 डिग्री सेल्सियस पर 60% (v/v) मेथनॉल के साथ सेल उपचार द्वारा और वर्तमान में उपयोग किए गए तरीकों में से एक (यानी, बफर की अनुपस्थिति में -40 डिग्री सेल्सियस पर 80% (v/v) मेथनॉल के साथ सेल उपचार द्वारा)। एक स्केल बार दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4-सेल शमन की विधि के लिए विभिन्न अमीनो एसिड कक्षाओं का रिसाव प्रतिशत। 5.0 x 10 8 खमीर कोशिकाओं को पीएच =8.0 पर एबीसी के आइसोटोनिक बफर समाधान की उपस्थिति में -20 डिग्री सेल्सियस पर 60% (v/v) मेथनॉल के साथ उपचार द्वारा शमन के अधीन किया गया था। विभिन्न अमीनो एसिड कक्षाओं के रिसाव प्रतिशत का आकलन एलसी-एमएस/एमएस का उपयोग करके शमन से पहले और बाद में बाहृशिक समाधान में उनकी सांद्रता को मापने के लिए किया गया था । एसडी और व्यक्तिगत डेटा बिंदुओं ± मतलब मान दिखाए जाते हैं (n = 3)। * पी < 0.05. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5-वर्तमान में उपयोग की जाने वाली कोशिका शमन विधियों में से एक के लिए विभिन्न अमीनो एसिड कक्षाओं का रिसाव प्रतिशत। 5.0 x 108 खमीर कोशिकाओं को बफर के अभाव में -40 डिग्री सेल्सियस पर 80% (v/v) मेथनॉल के साथ उपचार द्वारा शमन के अधीन किया गया था। विभिन्न अमीनो एसिड कक्षाओं के रिसाव प्रतिशत का आकलन एलसी-एमएस/एमएस का उपयोग करके शमन से पहले और बाद में बाहृशिक समाधान में उनकी सांद्रता को मापने के लिए किया गया था । एसडी और व्यक्तिगत डेटा बिंदुओं ± मतलब मान दिखाए जाते हैं (n = 3)। * पी < 0.05. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6:सामग्री की तालिका में नामित zwitterionic-चरण कॉलम पर अम्लीय, बुनियादी, तटस्थ ध्रुवीय और गैर-तटस्थ ध्रुवीय अमीनो एसिड कक्षाओं के कुशल क्रोमेग्राफिक जुदाई, जिसमें दो संरचनात्मक आइसोमर्स (यानी, ल्यूसिन और आइसोल्यूसिन) शामिल हैं। इन सभी अमीनो एसिड का पता एमएस/एमएस द्वारा पॉजिटिव आयनाइजेशन [ईएसआई (+)] मोड में लगाया गया था । जविटेरियन-चरण क्रोमेटोग्राफी कॉलम पर एलसी के लिए शर्तों को तालिका 1में वर्णित किया गया है। एमएस/एमएस के लिए शर्तों का वर्णन तालिका 2 और तालिका 3में किया गया है । सभी अमीनो एसिड मानकों को व्यावसायिक रूप से खरीदा जाता है (उदाहरण के लिए, सिग्मा)। 3 स्वतंत्र क्रोमेटोग्राफी रन के बीच प्रतिधारण समय बदलाव ± 10 सेकंड से भी कम हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7:न्यूक्लियोटाइड के विभिन्न वर्गों के कुशल क्रोमेटोग्राफिक पृथक्करण, जिनमें ऊर्जावान रूप से अस्थिर न्यूक्लियोटिड्स (न्यूक्लियोसाइड मोनोफोस्फेट, न्यूक्लियोसाइड डिफोस्फेट, और न्यूक्लियोसाइड ट्राइफोस्फेट) और इलेक्ट्रॉन कैरियर अणु (एनएचएच और एनएडी +),सामग्री की तालिका में नामित zwitterionic-phase कॉलम शामिलहैं। इन सभी न्यूक्लियोटाइड्स का पता एमएस/एमएस द्वारा सकारात्मक आयनीकरण [ईएसआई (+)] मोड में लगाया गया था । जविटेरियन-चरण क्रोमेटोग्राफी कॉलम पर एलसी के लिए शर्तों को तालिका 1में वर्णित किया गया है। एमएस/एमएस के लिए शर्तों का वर्णन तालिका 2 और तालिका 3में किया गया है । सभी न्यूक्लियोटाइड मानकों को व्यावसायिक रूप से खरीदा जाता है (उदाहरण के लिए, सिग्मा)। 3 स्वतंत्र क्रोमेटोग्राफी रन के बीच प्रतिधारण समय बदलाव ± 10 सेकंड से भी कम हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्र 8:सामग्री की तालिका में नामितzwitterionic चरण कॉलम पर, एल्डो-और केटोटेक्सोस (फ्रक्टोज, मैनोज, और गैलेक्टोज) के संरचनात्मक आइसोमर्स और स्टीरियोसोमिक रूपों सहित मोनोसैकराइड्स के विभिन्न वर्गों का कुशल गुणोग्राफिक पृथक्करण। इन सभी मोनोसैकराइड्स का पता एमएस/एमएस द्वारा पॉजिटिव आयनाइजेशन [ईएसआई (+)] मोड में लगाया गया था । जविटेरियन-चरण क्रोमेटोग्राफी कॉलम पर एलसी के लिए शर्तों को तालिका 1में वर्णित किया गया है। एमएस/एमएस के लिए शर्तों का वर्णन तालिका 2 और तालिका 3में किया गया है । सभी मोनोसैकराइड मानकों को व्यावसायिक रूप से खरीदा जाता है (उदाहरण के लिए, सिग्मा)। 3 स्वतंत्र क्रोमेटोग्राफी रन के बीच प्रतिधारण समय बदलाव ± 10 सेकंड से भी कम हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

कॉलम प्रकार सेक्विंट जेडआईसी-फाइलिक 5μm बहुलक 150 x 2.1 मिमी
सॉल्वेंट ए एलसी-एमएस ग्रेड H2O: ACN (95:5, v/v) 20 mm अमोनियम एसीटेट
सॉल्वेंट बी एलसी-एमएस ग्रेड एसीटोनिट्रिल (एसीएन)
दबाव सीमा अधिकतम = 300 बार न्यूनतम = 0
एचपीएलसी ढाल कार्यक्रम
समय (मिनट) प्रवाह दर (0.25 मिलीलीटर/न्यूनतम) रचनाएं
A% B%
0.5 0.25 5 95
26 0.25 40 60
30 0.25 70 30
31 0.25 70 30
31.1 0.4 5 95
43.9 0.4 5 95
44 0.25 5 95
45 0.25 5 95

तालिका 1: सामग्री की तालिका में नामित zwitterionic-चरण कॉलम की मदद से पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स के पृथक्करणके लिए उपयोग की जाने वाली एलसीस्थिति। इन स्थितियों का उपयोग यहां वर्णित सभी प्रयोगों में किया गया था।

पूर्ण स्कैन मास रेंज (डाल्टन) 70-900
FTMS (ऑर्बिटरैप एनालाइजर) पूर्ण स्कैन संकल्प 6.0 x 104
FTMS (ऑर्बिटरैप एनालाइजर) एचसीडी संकल्प 7500
FTMS पूर्ण स्कैन AGC लक्ष्य 1.0 x 106
एफटीएमएस एमएसएन एजीसी लक्ष्य 5.0 x 104
आयन ट्रैप (LTQ) एमएसएन एजीसी लक्ष्य 1.0 x 104
आयन स्रोत प्रकार गर्म इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण
केशिका तापमान (डिग्री सेल्सियस) 275
स्रोत हीटर तापमान (डिग्री सेल्सियस) 250
म्यान गैस प्रवाह 10
ऑक्स गैस प्रवाह 5

तालिका 2: बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर सेटिंग्स का उपयोग मेटाबोलाइट्स का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है जो एलसी द्वारा अलग किए गए थे। इन स्थितियों का उपयोग यहां वर्णित सभी प्रयोगों में मेटाबोलाइट्स के विश्लेषण के लिए किया गया था। संक्षिप्त रूप: FTMS = फोरियर ट्रांसफॉर्म (FTMS); एचसीडी = उच्च ऊर्जा-प्रेरित-टकराव-वियोजन; LTQ = रैखिक जाल चौगुनी; AGC = स्वचालित लाभ नियंत्रण, एमएस और एमएस के लिए एक आयन जनसंख्या मूल्य/

साधन ध्रुवता सकारात्मक/नकारात्मक
सक्रियण प्रकार सीआईडी/एचसीडी
न्यूनतम संकेत आवश्यक 5000
अलगाव की चौड़ाई 2
सीआईडी के लिए सामान्यीकृत टकराव ऊर्जा 35, 60
एचसीडी के लिए सामान्यीकृत टकराव ऊर्जा 35, 45, 55
डिफॉल्ट चार्ज स्टेट 1
सीआईडी के लिए सक्रियण समय (एमएस) 10, 30
एचसीडी (एमएस) के लिए सक्रियण समय 10
सीआईडी में एमएस/एमएस घटनाओं की संख्या टॉप 3, टॉप 5, टॉप 10
एचसीडी में एमएस/एमएस घटनाओं की संख्या टॉप 5
एचसीडी और सीआईडी दोनों में उपयोग किए जाने वाले माइक्रो स्कैन की संख्या 1

तालिका 3: माध्यमिक आयनों (एमएस 2) का पता लगाने के लिए उपयोग की जाने वाली द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर सेटिंग्स। संक्षिप्त: एचसीडी = उच्च ऊर्जा-प्रेरित-टकराव-वियोजन; सीआईडी = टक्कर प्रेरित वियोजन; एमएस = मिलीसेकंड।

एसटीडी मेटाबोलाइट्स एमडब्ल्यू (जी/तिल) [एम+एच]+1 [एम-एच]-1 डिटेक्शन मोड सबसे कम एकाग्रता का पता चला (pmol/μL)
ग्लाइसिन 75.03203 76.03931 74.02475 P 7.43E+00
त्रिप्टोफान 204.08988 205.09716 203.0826 P 5.56E-02
फेनिलानाइन 165.07898 166.08626 164.0717 P 5.14E-02
आर्जिनिन 174.11168 175.11896 173.1044 P 7.14E-02
थ्रेओनिन * 119.05824 120.06552 118.05096 P
सेरीन 105.04259 106.04987 104.03531 P 4.66E+00
ग्लूटामेट 147.05316 148.06044 146.04588 P 4.20E-01
मेथियोनिन 149.05105 150.05833 148.04377 P 1.96E+00
एस्पार्टेट 133.03751 134.04479 132.03023 P 3.75E+00
वलिन 117.07898 118.08626 116.0717 P 1.49E+00
आइसोल्यूसिन 131.09463 132.10191 130.08735 P 1.84E+00
ल्यूसिन 131.09463 132.10191 130.08735 P 2.26E+00
हिस्टिडीन 155.06948 156.07676 154.0622 P 2.53E+00
टायरोसिन 181.07389 182.08117 180.06661 P 8.72E-02
lysine 146.10553 147.11281 145.09825 P 1.43E-01
ऐलेनिन 89.04768 90.05496 88.0404 P 1.12E+00
प्रोलाइन 115.06333 116.07061 114.05605 P 1.05E+00
सिस्टीन 121.01975 122.02703 120.01247 P 8.22E-01
शतावरी 132.05349 133.06077 131.04621 P 1.08E+00
ग्लूटामीन 146.06914 147.07642 145.06186 P 1.92E+00
ग्वानाइन 151.04941 152.05669 150.04213 P 5.47E+00
ग्वानोसाइन 283.09167 284.09895 282.08439 P 3.67E-01
जीएमपी 363.058 364.06528 362.05072 P 7.17E-01
सकल घरेलू उत्पाद 443.02434 444.03162 442.01706 P 2.57E+00
जीटीपी 522.99067 523.99795 521.98339 P 2.27E+00
एएमपी 347.06309 348.07037 346.05581 P 5.25E-01
एडीपी 427.02942 428.0367 426.02214 P 1.32E+00
एटीपी 506.99575 508.00303 505.98847 P 1.77E+00
नाध 665.12478 666.13206 664.1175 P 1.47E+00
एनएडी + 663.10912 664.1164 662.10184 P 3.03E+00
ग्लूकोज ** 180.06339 181.07067 179.05611
फ्रक्टोज *** 180.06339 181.07067 179.05611 N 5.67E-01
मैनोस *** 180.06339 181.07067 179.05611 N 1.05E+00
गैलेक्टोज *** 180.06339 181.07067 179.05611 N 9.00E-01
रिबोस *** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1.10E+00
अरबिनोज़ *** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1.23E+00
फ्रक्टोज-6-फॉस्फेट *** 260.02972 261.037 259.02244 N 6.60E+00
ग्लूकोज-6-फॉस्फेट *** 260.02972 261.037 259.02244 N 4.27E+00
साइट्रिक एसिड 192.12 ग्राम 193.034279 191.019726 N 9.33E-01
मैलिक एसिड 134.09 135.0288 133.014247 N 1.23E+00
पायरुविक एसिड 88.06 89.02332 87.008768 N 2.77E+00

तालिका 4:विभिन्न पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट मानकों की सबसे कम सांद्रता है कि एलसी-एमएस/एमएस विधि की पहचान और मात्रा निर्धारित कर सकते हैं । प्रत्येक मेटाबोलाइट मानक के एमएस1 पीक क्षेत्र का उपयोग इस मेटाबोलाइट के लिए सबसे कम मात्रात्मक एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए किया गया था। दो स्वतंत्र प्रयोगों के औसत मूल्य दिखाए जाते हैं। दो स्वतंत्र प्रयोगों में से प्रत्येक के लिए तीन तकनीकी प्रतिकृति प्रदर्शन किए गए थे। नोट: थ्रेनिन * का पता लगाया जा सकता है, लेकिन होमोसेरीन के साथ अपने सह-एल्यूशन के कारण मात्रा निर्धारित नहीं की जा सकती है, जो थ्रेओनिन का एक रासायनिक आइसोमर है। ग्लूकोज ** की पहचान नहीं की जा सकती क्योंकि यह कई क्रोमेटोग्राफी चोटियों बनाता है। मेटाबोलाइट मानकों *** की पहचान की जा सकती है और केवल व्यक्तिगत नमूनों में क्वांटिट किया जा सकता है, लेकिन मेटाबोलाइट मानकों या मेटाबोलाइट्स के जैविक मिश्रण के मिश्रण में नहीं।

पूरक तालिका 1: कॉलम संतुलन के बाद ज़विटेरियन-चरण और रिवर्स-फेज कॉलम (सामग्री की तालिका देखें) के लिए मेटाबोलाइट्स के एक ही सेट के प्रतिधारण समय (आरटी) शिफ्ट मूल्य। तालिका मेटाबोलाइट्स के एक अलग सेट के लिए zwitterionic-चरण और रिवर्स चरण स्तंभों की अवधारण प्रजनन क्षमता की तुलना करती है जो उनकी हाइड्रोफिलिटी और हाइड्रोफोबिटी में एक दूसरे से अलग होती है। इन मेटाबॉलिज् मों की पहचान एलसी-एमएस/एमएस की मदद से की गई थी ध्यान दें कि हाइड्रोफिलिक मेटाबोलाइट्स (यानी एनएडी+, एएमपी, जीएमपी, आर्जिनिन और ग्लूटामिक एसिड) के आरटी शिफ्ट मान काफी कम हैं और रिवर्स फेज कॉलम की तुलना में जैविटेरियन-फेज कॉलम के लिए चोटी के आकार काफी तेज हैं । इसके विपरीत, हाइड्रोफोबिक मेटाबोलाइट्स (यानी, स्टीरिक एसिड, लॉरिक एसिड और डिकानोइक एसिड) के आरटी शिफ्ट मूल्य काफी कम हैं और ज़विटेरियन-चरण कॉलम की तुलना में रिवर्स-चरण कॉलम के लिए चोटी की आकृतियां काफी तेज हैं। ज़विटेरियन-चरण और रिवर्स-फेज कॉलम की मदद से मेटाबोलाइट्स के क्रोमेट्रोग्राफिक पृथक्करण के लिए शर्तें क्रमशः तालिका 1 और पूरक तालिका 2में विस्तृत हैं। यहां रिपोर्ट आरटी शिफ्ट मान अलग शीशियों से लिए गए 20 विभिन्न नमूनों की माप पर आधारित हैं । नमूनों का विश्लेषण कॉलम संतुलन के बाद किया गया । प्रत्येक नमूने में मेटाबोलाइट्स 5.0 × 108 खमीर कोशिकाओं से निकाले गए थे। आरटी शिफ्ट मान 20 विभिन्न नमूनों (एन = 20) के साधन हैं। अकर्षित टी परीक्षण से प्राप्त पी मानों का उपयोग दोनों नमूना प्रकारों के बीच समान भिन्नता के साथ दो स्तंभों की तुलना करने के लिए किया गया था। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका 2: सामग्री की तालिका में नामित रिवर्स-चरण 8 कॉलम के लिए एलसी शर्तें और इस अध्ययन में विभिन्न मेटाबोलाइट्स को अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है। कॉलम गुण इस प्रकार थे: 150 x 2.1 मिमी, 5 माइक्रोन बहुलक। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका 3: एलसी-एमएस/एमएस विधि का उपयोग करके बरामद और एनोटेटेड सभी 374 पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स की एक सूची। सभी मेटाबोलाइट्स एक ही एलसी ढाल रन से बरामद किए गए थे, जो पूरक तालिका 4में वर्णित डेटा-निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) विखंडन एल्गोरिदम के अधीन थे, और सामग्री की तालिकामें नामित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एनोटेट किया गया था। 211 मेटाबोलाइट्स के एमएस 1 चोटी के आकार (जिनकी तालिका में स्थिति को खाली के रूप में इंगित किया गया है) मात्राकरण के लिए उपयोग किया जाना उचित था, और उनके संबंधित एमएस 2 स्पेक्ट्रा में mzCloud स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी के साथ पूरा मैच था। 38 मेटाबोलाइट्स (जिनकी तालिका में स्थिति डी के रूप में इंगित की गई है) का एमएस2 स्पेक्ट्रा ऑनलाइन स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी के साथ पूरा मैच था। फिर भी, उनके MS1 चोटी के आकार मात्राकरण के लिए इस्तेमाल किया जाना उचित नहीं थे । 125 मेटाबोलाइट्स (जिनकी तालिका में स्थिति एन के रूप में इंगित की गई है) का एमएस2 स्पेक्ट्रा ऑनलाइन स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी के साथ पूरा मैच नहीं था। इन मेटाबोलाइट्स को इस प्रकार एनोटेट किया गया था: 1) "भविष्यवाणी संरचना नोड" (जो एमएस 1 मूल्यों के सटीक मिलान, मिलान और चूक गए आइसोटोप की संख्या, और सैद्धांतिक संदर्भ मानकों के साथ मिलान करने वाले आइसोटोप% तीव्रता के आधार पर मेटाबोलाइट्स को एनोटेट करता है); 2) "केमस्पिडर नोड" का उपयोग करके (जो ऑनलाइन स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी के साथ एमएस 1 मूल्यों और एमएस 2 स्पेक्ट्रा के समानता मैच स्कोर के सटीक मैच के आधार पर मेटाबोलाइट्स को एनोटेट करता है); और 3) मेटाबोलाइट्स के प्रतिधारण समय (आरटी) बदलाव मूल्यों का उपयोग करना (ये मूल्य मेटाबोलाइट्स की भौतिक संरचना और रासायनिक गुणों पर निर्भर करते हैं)। तालिका में सूचीबद्ध मेटाबोलाइट्स सभी 3 जैविक प्रतिकृति में पाए गए, जिसमें < ०.२ मिनट के आरटी शिफ्ट मूल्य थे । कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक तालिका 4: एक डेटा-निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) विखंडन एल्गोरिदम जिसका उपयोग यहां सामग्री की तालिका में नामित सॉफ्टवेयर की मदद से पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स के एनोटेशन के लिए किया गया था । कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक तालिका 5: एक विशिष्ट रैखिक गतिशील रेंज जिसे हमने देखा जब हमने सामग्री की तालिका में नामित एमएस सिस्टम की मदद से विभिन्न अमीनो एसिड की सांद्रता को मापा। यहां उपयोग की जाने वाली एमएस प्रणाली में विभिन्न मेटाबोलाइट्स की सांद्रता को मापने के लिए एक विस्तृत (परिमाण के कम से कम दो आदेश) रैखिक गतिशील रेंज है। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग करने के लिए, नीचे वर्णित निवारक उपायों का पालन करें। क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल प्रयोगशाला प्लास्टिकवेयर से विभिन्न पदार्थ निकालते हैं। इसलिए इन्हें सावधानी से संभालें। इन दो कार्बनिक सॉल्वैंट्स में से किसी के साथ संपर्क शामिल है कि कदम में प्लास्टिक के उपयोग से बचें। इन चरणों के लिए बोरोसिलिकेट ग्लास पिपेट का उपयोग करें। उपयोग से पहले क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल के साथ इन पिपेट को उठें। केवल माइक्रोपिपेट टिप्स और पॉलीप्रोपाइलीन से बने ट्यूब का उपयोग करें जो कार्बनिक सॉल्वैंट्स के लिए प्रतिरोधी हैं। एलसी-एमएस/एमएस के लिए नमूना तैयारी के दौरान, उन्हें एक वेलप्लेट में डालने से पहले कांच की शीशियों में सभी हवा के बुलबुले को खत्म करें।

यहां उपयोग किए जाने वाले zwitterionic-चरण कॉलम को आरटी शिफ्ट को कम करने के लिए प्रत्येक रन के बाद व्यापक पुनः कंडीशनिंग की आवश्यकता होती है। कॉलम री-कंडीशनिंग के लिए, हम री-कंडीशनिंग समाधान की मात्रा का उपयोग करने की सलाह देते हैं जो कॉलम के लगभग 20 वॉल्यूम है। कॉलम को 0.4 एमएल/मिनट की बढ़ी हुई प्रवाह दर पर 15 मिनट के लिए प्रारंभिक मोबाइल चरण के साथ फिर से वातानुकूलित करने की आवश्यकता है । इसके री-कंडीशनिंग के दौरान कॉलम को किसी भी तरह की क्षति से बचने के लिए, निर्माता द्वारा अनुशंसित दबाव की ऊपरी सीमा से नीचे कॉलम दबाव रखें।

ध्यान दें, रिवर्स-फेज मोड में काम करने वाले कुछ मिश्रित-पृथक्करण क्रोमेटोग्राफी कॉलम चार्ज मेटाबोलाइट्स40, 41के समाधान की अनुमतिदेतेहैं। ये मिश्रित-पृथक्करण कॉलम यहां उपयोग किए जाने वाले रिवर्स-चरण कॉलम (सामग्रियों की तालिकादेखें) पर आधारित हैं और इसमें ध्रुवीय एम्बेडेड समूह होते हैं जो चार्ज40,41के आधार पर मेटाबोलाइट्स को अलग कर सकते हैं।

यहां, हमने खमीर कोशिकाओं से निकाले गए कई पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए गैर-लक्षित मेटाबोलोमिक्स की एलसी-एमएस/एमएस आधारित विधि का वर्णन किया । यह विधि वर्तमान में इस उद्देश्य के लिए उपयोग किए जाने वाले गैर-लक्षित मेटाबोलोमिक्स के एलसी-एमएस/एमएस तरीकों पर कई फायदे प्रदान करती है। इन फायदों में निम्नलिखित शामिल हैं। सबसे पहले, विधि संवेदनशील है और 0.05 pmol/μL के रूप में कम के रूप में सांद्रता पर कुछ पानी में घुलनशील चयापचय की पहचान और मात्रा की अनुमति देता है। मौजूदा एलसी-एमएस/एमएस विधियों की सूचित संवेदनशीलता3,22,27,42है . दूसरा , विधि एक कोशिका शमन प्रक्रिया का उपयोग करती है जो वर्तमान में उपयोग की जाने वाली प्रक्रियाओं31 , 33,38की तुलना में कोशिका से इंट्रासेलुलर मेटाबोलाइट्स का काफी कम रिसाव प्राप्त करती है। इस प्रकार, सेल शमन के लिए हमने जो प्रक्रिया विकसित की है, वह उस सीमा को कम करती है जिससे वर्तमान में उपयोग की जाने वाली प्रक्रियाएं पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स की इंट्रासेलुलर सांद्रता का अनुमान लगा रही हैं। तीसरा, मौजूदा एलसी-एमएस/एमएस विधियों2,31,33केविपरीत, विधि विभिन्न संरचनात्मक आइसोमर्स और कई मेटाबोलाइट्स के स्टीरियोसोमिक रूपों के बीच अलग करती है। इन मेटाबोलाइट्स में विभिन्न ऊर्जा वाहक अणु, न्यूक्लियोटाइड, अमीनो एसिड, मोनोसैकराइड्स, ग्लाइसोलिसिस के मध्यवर्ती और ट्राइकार्बोक्सिलिक चक्र मध्यवर्ती शामिल हैं। चौथा, हमने कच्चे एलसी-एमएस/एमएस डेटा का उपयोग करके विशिष्ट मेटाबोलाइट्स की एक विस्तृत श्रृंखला की सही पहचान और मात्रा के लिए MS1 और MS2 का एक व्यापक द्रव्यमान स्पेक्ट्रल डेटाबेस बनाने की विधि का उपयोग किया। इसके विपरीत, एमएस1 और एमएस 2 के मौजूदा द्रव्यमान स्पेक्ट्रल ऑनलाइन डेटाबेस अधूरे43,44,45हैं। पांचवां, विधि विविध संरचनात्मक, भौतिक और रासायनिक गुणों के साथ पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स को ठीक करने के लिए एक ही प्रकार के मेटाबोलाइट निष्कर्षण का उपयोग करती है। ये मेटाबोलाइट्स की विविधता खमीर कोशिकाओं 3 , 22 ,27,46से पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स की एक कदम निकासी के लिए वैकल्पिक तरीकों से काफी अधिक है। छह, मौजूदा एलसी-एमएस/एमएस विधियों3,22,47, 48के विपरीत, विधि पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स के विभिन्न संरचनात्मक और कार्यात्मक वर्गों से अलग करने के लिए एक ही प्रकार के एलसी कॉलम का उपयोग करती है। सात, विधि खमीर कोशिकाओं से निकाले गए ३७० से अधिक पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स की पहचान और मात्रा को सक्षम बनाती है । पहचाने जाने योग्य और मात्रात्मक मेटाबोलाइट्स की यह संख्या खमीर 3 , 22 ,27,49,50में गैर-लक्षित मेटाबोलोमिक्स के अन्य तरीकों के लिए सूचित मेटाबोलाइट्स की संख्या से अधिक है।

विधि की कई सीमाएं हैं। ये सीमाएं इस प्रकार हैं। एलसी द्वारा मेटाबोलाइट पृथक्करण के लिए उपयोग किए जाने वाले zwitterionic-चरण कॉलम में प्रत्येक रन के बाद व्यापक पुनः कंडीशनिंग की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, विधि केवल पानी में घुलनशील, हाइड्रोफिलिक मेटाबोलाइट्स के गैर-लक्षित मेटाबोलोमिक्स के लिए कुशल है। इसके अलावा, कार्बोहाइड्रेट के विभिन्न आइसोमेट्रिक रूपों (फ्रक्टोज, ग्लूकोज और गैलेक्टोज के आइसोमर सहित) विधि की मदद से मात्रा निर्धारित नहीं की जा सकती है। इसका कारण यह है कि विधि में उपयोग किया जाने वाला zwitterionic-phase कॉलम अन्य मेटाबोलाइट्स के साथ मिश्रण में मौजूद होने पर इन कार्बोहाइड्रेट आइसोमर्स को एक दूसरे से अलग नहीं कर सकता है। इसके अलावा, ग्लूकोज की पहचान करने के लिए विधि का शोषण नहीं किया जा सकता है क्योंकि यह कार्बोहाइड्रेट विधि में उपयोग किए जाने वाले zwitterionic-चरण कॉलम पर क्रोमेटोग्राफी के दौरान कई चोटियों को बनाता है। अंत में, थ्रेओनिन को क्रोमेटोग्राफी द्वारा मेटाबोलाइट सेपरेशन के दौरान अपने आइसोमर होमोसेरिन के साथ इस अमीनो एसिड के सह-एल्यूशन के कारण विधि की मदद से मात्रा निर्धारित नहीं की जा सकती है।

हम नवोदित खमीर एस सेरेविसियाके पानी में घुलनशील मेटाबोलोम में उम्र बढ़ने से जुड़े परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए इस एलसी-एमएस/एमएस विधि का उपयोग करते हैं । हम इस विधि को यह जांचने के लिए भी नियोजित करते हैं कि कितने उम्र बढ़ने-विलंबण, आहार और औषधीय हस्तक्षेप उनके कालक्रम की उम्र बढ़ने के दौरान खमीर कोशिकाओं के पानी में घुलनशील मेटाबोलोम को प्रभावित करते हैं। इसकी बहुमुखी प्रतिभा, मजबूती और संवेदनशीलता के कारण, एलसी-एमएस/एमएस विधि का विकासवादी दूर यूकेरियोटिक जीवों में पानी में घुलनशील मेटाबोलोम के मात्रात्मक आकलन के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम चर्चा के लिए Titorenko प्रयोगशाला के वर्तमान और पूर्व सदस्यों के आभारी हैं । हम उत्कृष्ट सेवाओं के लिए सेंटर फॉर बायोलॉजिकल एप्लीकेशंस ऑफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री, सेंटर फॉर स्ट्रक्चरल एंड फंक्शनल जीनोमिक्स और सेंटर फॉर माइक्रोस्कोपी एंड सेल्युलर इमेजिंग (सभी कॉनकोर्डिया यूनिवर्सिटी) को स्वीकार करते हैं । इस अध्ययन को कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एनएसईआरसी) (आरजीपिन 2014-04482 और सीआरडीपीजे 515900 - 17) के अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था। के.M को कॉनकोर्डिया विश्वविद्यालय आर्मंड सी आर्चबाल्ट फैलोशिप और कॉनकोर्डिया विश्वविद्यालय डीन ऑफ आर्ट्स एंड साइंसेज अवार्ड ऑफ एक्सीलेंस द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acetonitrile Fisher Scientific A9554
Ammonium acetate Fisher Scientific A11450
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Bactopeptone Fisher Scientific BP1420-2
Chloroform Fisher Scientific C297-4
Glucose Fisher Scientific D16-10
L-histidine Sigma H8125
L-leucine Sigma L8912
L-lysine Sigma L5501
Methanol Fisher Scientific A4564
Methanol Fisher Scientific A4564
Propidium iodide Thermo Scientific R37108
Uracil Sigma U0750
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottles Beckman 355664
Agilent 1100 series LC system Agilent Technologies G1312A
Beckman Coulter Centrifuge Beckman 6254249
Beckman Coulter Centrifuge Rotor Beckman JA-10
Centra CL2 clinical centrifuge Thermo Scientific 004260F
Digital thermometer Omega HH509
Foam Tube Holder Kit with Retainer Thermo Scientific 02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) Sigma Milipore 150460
Thermo Orbitrap Velos MS Fisher Scientific ETD-10600
Ultrasonic sonicator Fisher Scientific 15337416
Vortex Fisher Scientific 2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm Agilent Technologies 883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps Fisher Scientific 60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) Sigma-Aldrich G8772
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps PYREX 05-550
Software
Compound Discoverer 3.1 Fisher Scientific V3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742 Dharmacon YSC1049

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बायोकेमिस्ट्री अंक 167 पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स मेटाबोलिक्स प्रोफाइलिंग मेटाबोलिक गतिविधि की शमन प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला फ्लोरोरेसेंस माइक्रोस्कोपी मेटाबोलाइट्स का निष्कर्षण ऊर्जा वाहक अणु न्यूक्लियोक्लियोटिड अमीनो एसिड मोनोसैक्चराइड्स तरल क्रोमेटोग्राफी स्कस्ट्रोमेट्री
<em>सैकरोमाइसेस सेरेविसिया</em> के मात्रात्मक मेटाबोलोमिक्स ने मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग किया
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Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko,… More

Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko, V. I. Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (167), e62061, doi:10.3791/62061 (2021).

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