Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kvantitativ metabolomik av sackaromyces Cerevisiae med flytande kromatografi i kombination med tandemmasspektrometri

Published: January 5, 2021 doi: 10.3791/62061
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Concordia University, 2Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

Summary

Vi presenterar ett protokoll för identifiering och kvantifiering av stora klasser av vattenlösliga metaboliter i jästen Saccharomyces cerevisiae. Den beskrivna metoden är mångsidig, robust och känslig. Det möjliggör separation av strukturella isomerer och stereoisomeriska former av vattenlösliga metaboliter från varandra.

Abstract

Metabolomik är en metod som används för identifiering och kvantifiering av många lågmolekylära intermediärer och metabolismprodukter inom cell, vävnad, organ, biologisk vätska eller organism. Metabolomik fokuserar traditionellt på vattenlösliga metaboliter. Den vattenlösliga metabolomen är slutprodukten av ett komplext mobilnät som integrerar olika genomiska, epigenomiska, transkriptomiska, proteomiska och miljömässiga faktorer. Därför bedömer den metabolomiska analysen direkt resultatet av åtgärden för alla dessa faktorer i en mängd biologiska processer inom olika organismer. En av dessa organismer är den spirande jästen Saccharomyces cerevisiae, en encellig eukaryote med det helt sekvenserade genomet. Eftersom S. cerevisiae är mottaglig för omfattande molekylära analyser, används det som en modell för dissekeringsmekanismer som ligger till grund för många biologiska processer inom eukaryota cellen. En mångsidig analysmetod för en robust, känslig och korrekt kvantitativ bedömning av den vattenlösliga metabolomen skulle ge den viktigaste metoden för att dissekera dessa mekanismer. Här presenterar vi ett protokoll för optimerade villkor för metabolisk aktivitetssläckning i och vattenlöslig metabolit extraktion från S. cerevisiae celler. Protokollet beskriver också användningen av flytande kromatografi i kombination med tandem masspektrometri (LC-MS/MS) för kvantitativ analys av extraherade vattenlösliga metaboliter. LC-MS/MS-metoden för icke-riktad metabolomik som beskrivs här är mångsidig och robust. Det möjliggör identifiering och kvantifiering av mer än 370 vattenlösliga metaboliter med olika strukturella, fysiska och kemiska egenskaper, inklusive olika strukturella isomerer och stereoisomeriska former av dessa metaboliter. Dessa metaboliter inkluderar olika energibärarmolekyler, nukleotider, aminosyror, monosackarider, intermediärer av glykolys och trikarboxylcykel intermediärer. LC-MS/MS-metoden för icke-riktad metabolomik är känslig och gör det möjligt att identifiera och kvantifiera vissa vattenlösliga metaboliter vid koncentrationer så låga som 0,05 pmol/μL. Metoden har framgångsrikt använts för att bedöma vattenlösliga metabolomer av vilda och mutanta jästceller odlade under olika förhållanden.

Introduction

Vattenlösliga metaboliter är lågmolekylära intermediärer och produkter av metabolism som bidrar till väsentliga cellulära processer. Dessa evolutionärt bevarade processer inkluderar omvandling av näringsämnen till användbar energi, syntes av makromolekyler, cellulär tillväxt och signalering, cellcykelkontroll, reglering av genuttryck, stressrespons, postöversättningsreglering av metabolism, underhåll av mitokondriell funktionalitet, fordonscellshandel, autofagi, cellulärt åldrande och reglerad celldöd1,2,3.

Många av dessa väsentliga roller av vattenlösliga metaboliter har upptäckts genom studier i den spirande jästen S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Denna encelliga eukaryote är en användbar modellorganism för dissekeringsmekanismer genom vilka vattenlösliga metaboliter bidrar till cellulära processer på grund av dess mottaglighet för avancerade biokemiska, genetiska och molekylärbiologiska analyser23,24,25,26. Även om LC-MS/MS-metoderna för icke-riktad metabolomik har använts för att studera rollerna för vattenlösliga metaboliter i spirande jäst3,18,22,27, kräver denna typ av analys förbättring av dess mångsidighet, robusthet, känslighet och förmåga att skilja mellan olika strukturella isomererer och stereoisomeriska former av dessa metaboliter.

De senaste åren kännetecknas av betydande framsteg vid tillämpning av LC-MS/MS-metoderna för icke-riktad metabolomik vid profilering av vattenlösliga metaboliter in vivo. Många utmaningar med att använda denna metod är dockfortfarande 2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Dessa utmaningar inkluderar följande. För det första ligger de intracellulära koncentrationerna av många vattenlösliga metaboliter under ett tröskelvärde för känslighet för de nuvarande metoderna. För det andra är effektiviteten av metabolisk aktivitetssläckning för låg, och omfattningen av släckningsrelaterade cellläckage av intracellulära metaboliter är för hög för nuvarande metoder; De metoder som för närvarande används underskattar därför de intracellulära koncentrationerna av vattenlösliga metaboliter. För det tredje kan de befintliga metoderna inte skilja mellan de strukturella isomererna (dvs. molekyler med samma kemiska formel men olika atomanslutning) eller stereoisomerer (dvs. molekyler med samma kemiska formel och atomanslutning, men med de olika atomarrangemangen i rymden) hos specifika metaboliter. Detta förhindrar korrekt anteckning av vissa metaboliter med de nuvarande metoderna. För det fjärde är de befintliga masspektrala onlinedatabaserna för föräldrajoner (MS1) och sekundärjoner (MS2) ofullständiga. Detta påverkar korrekt identifiering och kvantifiering av specifika metaboliter med hjälp av de råa LC-MS/MS-data som produceras med hjälp av de nuvarande metoderna. För det femte kan de befintliga metoderna inte använda en enda typ av metabolitextraktion för att återställa alla eller de flesta klasser av vattenlösliga metaboliter. För det sjätte kan de befintliga metoderna inte använda en enda typ av LC-kolumnen för att skilja alla eller de flesta klasser av vattenlösliga metaboliter från varandra.

Här optimerade vi villkoren för släckning av metabolisk aktivitet inom S. cerevisiae celler, upprätthålla de flesta av de vattenlösliga metaboliter inom dessa celler före extraktion, och extrahera de flesta klasser av vattenlösliga metaboliter från jästceller. Vi utvecklade en mångsidig, robust och känslig metod för LC-MS/MS-baserad identifiering och kvantifiering av mer än 370 vattenlösliga metaboliter extraherade från S. cerevisiae celler. Denna metod för icke-målinriktad metabolomik gör det möjligt att bedöma intracellulära koncentrationer av olika energibärarmolekyler, nukleotider, aminosyror, monosackarider, intermediärer av glykolys och trikarboxylic cykel intermediärer. Den utvecklade LC-MS/MS-metoden gör det möjligt att identifiera och kvantifiera olika strukturella isomererer och stereoisomeriska former av vattenlösliga metaboliter med olika strukturella, fysiska och kemiska egenskaper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Göra och sterilisera ett medium för odling av jäst

  1. Gör 180 ml av ett komplett jästextrakt med bactopepton (YP) medium. Det kompletta YP-mediet innehåller 1% (w/v) jästextrakt och 2% (w/v) bactopepton.
  2. Fördela 180 ml YP-medium lika i fyra 250 ml Erlenmeyerkolvar. Var och en av dessa flaskor innehåller 45 ml YP-medium.
  3. Sterilisera kolvarna med YP-medium genom automatisk automatisk enklavning vid 15 psi/121 °C i 45 min.

2. Jäststam av vild typ

  1. Använd stammen BY4742(MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).

3. Växande jäst i YP-mediet som innehåller 2% glukos

  1. Sterilisera en 20% (w/v) stamlösning av glukos genom autoklavering vid 15 psi/121 °C i 45 min.
  2. Tillsätt 5 ml av den autoklaverade 20% (w/v) stamlösningen glukos till var och en av de två Erlenmeyerkolverna med 45 ml av det steriliserade YP-mediet. Den slutliga koncentrationsglukosen i YP-mediet är 2% (w/v).
  3. Använd en mikrobiologisk slinga för att inokulera jästceller i var och en av de två Erlenmeyer-kolvarna med YP-mediet som innehåller 2% glukos.
  4. Odla jästcellerna över natten vid 30 °C i en rotationsskakapparat inställd på 200 varv/min.
  5. Ta en alikvot jästkultur. Bestäm det totala antalet jästceller per ml kultur. Räkna celler med hjälp av en hemocytometer.

4. Cellöverföring till och cell växer i YP-mediet med 2% glukos

  1. Tillsätt 5 ml av den steriliserade 20% (w/v) lagerlösningen glukos till var och en av de återstående två Erlenmeyer-flaskorna med det autoklaverade YP-mediet. Den slutliga koncentrationen av glukos är 2% (w/v).
  2. Överför en volym av jästkulturen över natten i YP-medium med 2% glukos som innehåller det totala antalet 5,0 x 107 celler till var och en av de två Erlenmeyer-flaskorna med YP-mediet som innehåller 2% glukos. Använd en steril pipett för cellöverföring.
  3. Odla jästcellerna i minst 24 timmar (eller mer, om experimentet kräver) vid 30 °C i en rotationsskakapparat inställd på 200 varv/min.

5. Göra reagenser, förbereda labware och ställa in utrustning för cellsläckage

  1. Bered följande: 1) en släckningslösning (60% höggradig (>99,9%) metanol i 155 mM ammoniumbikarbonatbuffert (ABC), pH = 8,0); 2) en iskall ABC-lösning (pH = 8,0); 3) En digital termometer som kan mäta upp till -20 °C. 4) 500 ml stora centrifugeringsflaskor; 5) En förkyld höghastighetscentrifug med en förkyld rotor och förkylda 500 ml centrifugeringsflaskor för denna rotor, alla vid -5 °C. 6) metabolitextraktionsrör (15 ml höghastighetsglascentrifugrör med polytetrafluoretylenfodrade lock); och 7) torr is.

6. Cellsläckande

  1. Använd en hemocytometer för att bestämma antalet jästceller per ml YP med 2% glukoskultur.
  2. Överför en volym av kulturen i YP-medium med 2% glukos som innehåller det totala antalet 5,0 x 108 celler till förkylda 500 mL centrifugeflaskor.
  3. Fyll snabbt centrifugflaskan som innehåller cellerna upp till volymen 200 ml med en släckningslösning lagrad vid -20 °C.
  4. Centrifug flaskorna i en höghastighetscentrifug vid 11,325 x g i 3 min vid -5 °C.
  5. Snabbt och ömt återvinna flaskan från centrifugen; skruva försiktigt av locket och ta bort supernaten utan att störa pelleten.
  6. Återanvänd snabbt cellpelleten i 10 ml iskall ABC-buffert och överför suspensionen till ett 15 ml höghastighetsglascentrifugrör med ett polytetrafluoretylenfodrat lock för metabolitextraktion.
  7. Samla celler genom centrifugering i en klinisk centrifugering vid 3 000 x g i 3 min vid 0 °C.
  8. Ta snabbt bort supernatanten och placera röret på torr is för att påbörja metabolitextraktion eller förvara röret vid -80 °C tills det extraheras.

7. Beredning av reagenser, labware och utrustning för metabolitextraktion

  1. Bered följande: 1) kloroform av LC-MS-klass; 2) Metanol av LC-MS-klass. 3) Nano rent vatten av LC-klass. 4) LC-MS-klass (ACN); 5) glaspärlor (syratvättade, 425-600 μm); 6) en virvel med en skumrörshållare med hållare; 7) 15 ml höghastighetsglascentrifugrör med polytetrafluoretylenfodrade lock; 8) MS injektionsflaska. 9) torris; och 10) 1,5 ml rör tvättas en gång med etanol, en gång med ACN och en gång med nano rent vatten.
    OBS: Använd endast mikropipettespetsar och rör av polypropylen som är resistenta mot organiska lösningsmedel.

8. Metabolitextraktion

  1. Tillsätt följande: 1) 2 ml kloroform lagrad vid -20 °C till de metaboliter som hålls på torris eller lagras vid -80 °C-rör från steg 6.7. 2) 1 ml metanol lagrad vid -20 °C, 3) 1 ml iskallt nanopurtvatten; och 4) 200 μL 425-600 μm syratvättade glaspärlor.
  2. Täck och stäng munnen på ett rör med aluminiumfolie. Placera rören i ett skumrörshållarkit med hållare och virvel dem i 30 min med medelhög hastighet (dvs. vid en hastighet som är inställd på 6, med 12 som högsta hastighet för en virvel) vid 4 °C för att underlätta metabolitextraktion.
  3. Inkubera röret i 15 minuter på is (INTE torris!) för att främja proteinutfällning och separation av övre vatten från den nedre organiska fasen.
  4. Centrifuga röret i en klinisk centrifugering vid 3 000 x g i 10 min vid 4 °C. Detta centrifugationssteg gör det möjligt att separera den övre vattenfasen (som innehåller vattenlösliga metaboliter) från mellanskiktet (som innehåller cellskräp och proteiner) och från den nedre organiska fasen (som mestadels innehåller lipider).
  5. Använd en mikropipett för att överföra den övre vattenfasen (400 μL) till ett tvättat och märkt 1,5 ml-rör som innehåller 800 μL ACN som lagrades vid -20 °C.
    OBS: Det kommer att finnas vit moln nederbörd efter att ha lagt till den övre vattenfasen till ACN hålls vid -20 °C.
  6. Centrifugera röret med provet i en centrifugeskiva vid bordsskivan vid 13 400 x g i 10 minuter vid 4 °C.
    OBS: Den vita molnutfällningen försvinner efter centrifugation.
  7. Överför 800 μL från den övre delen av en vätska i röret till en märkt MS-injektionsflaska. Förvara provet vid 0 °C tills det analyseras av LC-MS/MS.

9. Förberedelse av reagenser, labware och utrustning för LC

  1. Förbered följande: 1) en virvel; 2) en ultraljud ultraljudsbehandling; 3) MS glasflaskor; 4) ett LC-system utrustat med en binär pump, avgasare och autosampler; 5) En zwitterionic-phase kromatografikolonn (5 μm polymer, 150 x 2,1 mm) som nämns i materialförteckningen. 6) En pelarvärmare. och 7) mobila faser, inklusive fas A (5:95 ACN:water (v/v) med 20 mM ammoniumacetat, pH = 8,0) och fas B (100% ACN).

10. Separation av extraherade metaboliter med LC

  1. Subjekt innehållet i MS injektionsflaskan till ultraljud ultraljudsbehandling i 15 min.
  2. Virvel MS injektionsflaska 3x för 10 sek vid rumstemperatur (RT).
  3. Placera MS-injektionsflaskan i brunnsplattan.
  4. Under kromatografen ska kolonnen vara 45 °C och ett flöde på 0,250 ml/min. Förvara provet i brunnsplattan vid 0 °C. Se tabell 1 för de LC-gradienter som behöver användas vid kromatografi.
    OBS: Ett representativt totalt jonkromatogram av vattenlösliga metaboliter som extraherades från celler av vildtypsstammen BY4742 visas i figur 1. De metaboliter som separerades av LC identifierades och kvantifierades genom masspektrometrisk analys som utfördes i positivt joniseringsläge [ESI (+)] enligt beskrivningen för steg 11.

11. Masspektrometrisk analys av metaboliter åtskilda av LC

  1. Använd en masspektrometer utrustad med uppvärmd elektrosprayjonisering (HESI) för identifiering och kvantifiering av vattenlösliga metaboliter som separerades av LC. Använd masspektrometerns analysator för MS1-joner och masspektrometerns detektor för MS2-joner. Använd inställningarna i tabell 2 respektive tabell 3 för databeroende förvärv av MS1- respektive MS2-joner.
  2. Använd en provvolym på 10 μL för injektionen i både ESI-lägena (+) och ESI (-).

12. Identifiering och kvantifiering av olika metaboliter genom behandling av rådata från LC-MS/MS

  1. Använd programvaran som nämns i Table of Materials för att utföra identifiering och kvantifiering av olika vattenlösliga metaboliter från råa LC-MS/MS-filer. Denna programvara använder MS1 för metabolit kvantifiering och MS2 för metabolit identifiering. Programvaran utnyttjar det mest omfattande kuraterade masspektrala fragmenteringsbiblioteket för att kommentera metaboliterna med hjälp av LC-MS/ MS-rådata genom att matcha MS-spektra. Denna programvara använder också den exakta massan av MS1 och isotopmönster matchning för att kommentera metaboliter med hjälp av onlinedatabaser. Se figur 2 för mer information.
  2. Använd biblioteket med databaser och spektra, som är fritt tillgängligt online (https://www.mzcloud.org), för att söka efter MS2-spektra av rådata.

13. Membranintegritetsanalys genom propidium Iodide (PI) färgning och fluorescensmikroskopi

  1. Efter cellsläckning utförd enligt beskrivningen för steg 6, tvätta de släckta cellerna noggrant med 15 ml ABC-buffert för att ta bort släckningslösningen. Samla celler genom centrifugering vid 3 000 x g i 5 min vid 0 °C.
  2. Återanvänd cellpelleten i 1 ml ABC-buffert och tillsätt 0,5 ml PI-lösningen (0,5 mg/ml).
  3. Virvel ett rör med provet 3x för 10 s och inkubera det i 10 minuter i mörkret och på is.
  4. Centrifugera röret med provet i en centrifugeskiva vid bordsskivan vid 13 400 x g i 10 minuter vid 4 °C.
  5. Ta bort supernatanten och återanvänd pelleten i 1 ml ABC-buffert.
  6. Centrifugera röret vid 13 400 x g i 10 min vid 4 °C och ta bort supernaten. Upprepa det här steget ytterligare 2 gånger för att ta bort pi-bunden till cellytan.
  7. Återanvänd pelleten i 300 μL ABC-buffert. Placera 10 μL av fjädringen på ytan av en mikroskopbild.
  8. Fånga differential interferens kontrasten (DIC) och fluorescens mikroskopi bilder med ett fluorescens mikroskop. Använd ett filter som ställts in vid excitations- och emissionsvåglängderna på 593 nm respektive 636 nm.Use a filter set up at the excitation and emission wavelengths of 593 nm and 636 nm (respektive).
  9. Använd en programvara för att räkna det totala cellnumret (i DIC-läget) och antalet fluorescerande färgade celler. Använd också denna programvara för att bestämma färgningsintensiteten för enskilda celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att förbättra en kvantitativ bedömning av vattenlösliga metaboliter i en jästcell optimerade vi villkoren för cellsläckning för metabolitdetektering. Cellsläckning för detta ändamål innebär ett snabbt gripande av alla enzymatiska reaktioner i en cell31,33,37,38. Ett sådant gripande av cellulär metabolisk aktivitet är ett viktigt steg i alla metoder för kvantifiering av vattenlösliga metaboliter in vivo eftersom det förhindrar underskattning av deras intracellulärakoncentrationer 31,33,37,38. Cellsläckning för metabolitbedömning försämrar alltid plasmamembranets (PM) (och cellväggens (CW) integritet, om sådan finns). detta orsakar metabolitläckage fråncellen 31,33,37,38. Metoden använder cellsläckande tillstånd som minimerar sådan försämring, vilket avsevärt minskar det släckningsrelaterade cellläckaget hos intracellulära metaboliter. De flesta nuvarande metoder för cellsläckning innebär i själva året att en viss koncentration av metanol används (dvs. 40% (v/v), 60% (v/v), 80% (v/v) eller 100% (v/v)) vid specifik temperatur (dvs. -20 °C, -40 °C eller -60 °C), med eller utanbuffert 31,33,37,38. Vi jämförde effektiviteten av PM- och CW-nedskrivningen för en av de nuvarande cellsläckningsmetoden (dvs. genom cellbehandling med 80% (v/v) metanol vid -40 °C i avsaknad av enbuffert 38) till den för den modifierade cellsläckningsmetoden (dvs. genom cellbehandling med 60% (v/v) metanol vid -20 °C i närvaro av en isoton buffrad lösning av ABC vid pH = 8, 0). PI är ett fluorescerande färgämne som är ogenomträngligt för intakta celler; Den kan endast komma in i cellen om pm:ets (och CW:ets integritet, om den finns) är nedsatt39. Dessutom ökar intensiteten av fluorescensutsläpp från PI med 30 gånger när det är bundet till DNA eller RNA39. Således kan en PI-färgningsanalys användas för att bedöma effektiviteten av släckning-associerade cellläckage av intracellulära metaboliter eftersom dessa metaboliter kan läcka in i det extracellulära utrymmet endast om PM och CW i en jästcell skadas39. Vi fann att den modifierade cellsläckande metoden orsakar betydligt lägre skador på PM och CW än släckningsmetoden genom cellbehandling med icke-buffrad 80% (v/v) metanol vid -40 °C (figur 3). Nästan alla celler som utsattes för släckning med hjälp av metoden uppvisade faktiskt utsläpp av röda fluorescenser, vilket är karakteristiskt för de jästceller vars PM och CW inte är skadade (figur 3). Däremot uppvisade nästan alla celler som utsattes för släckning med den andra metoden grönt fluorescensutsläpp som är karakteristiskt för de jästceller vars PM och CW är kraftigt skadade (figur 3). Den mest intensiva röda fluorescensen omvandlades till grön fluorescens av en programvara för att skilja mellan de starka röda fluorescens- och milda röda fluorescensutsläppen.

Den modifierade cellsläckningsmetoden orsakade betydligt lägre läckage av vattenlösliga metaboliter från jästceller än - släckningsmetoden genom cellbehandling med icke-buffrad 80% (v/v) metanol vid -40 °C. Vi utsatte lika många jästceller för släckning med antingen metoden (dvs. genom cellbehandling med 60% (v/v) metanol vid -20 °C i närvaro av en isoton buffrad lösning av ABC vid pH = 8, 0; Figur 4) eller den andra metoden (dvs. genom cellbehandling med icke buffrad metanol på 80 % (v/v) vid -40 °C, Figur 5). Omfattningen av släckning-associerade cell läckage i den extracellulära lösningen bedömdes för specifika vattenlösliga metaboliter med hjälp av LC-MS/MS. Koncentrationerna av olika aminosyraklasser (dvs. stora och små sura, grundläggande, neutrala icke-polära och neutrala polära aminosyror) i den extracellulära lösningen mättes före och efter cellsläckning. Vi fann att cellsläckningsmetoden orsakar betydligt lägre läckage av alla dessa aminosyraklasser i den extracellulära lösningen (figur 4) än den andra metoden (figur 5).

LC-MS/MS-metoden för en kvantitativ bedömning av vattenlösliga metaboliter i en jästcell använder en enda typ av kolumn för kromatografisk separation av alla vattenlösliga metabolitklasser. Den här kolumnen är den zwitterioniska faskolumnen som heter i Materialförteckningen. Vi fann att denna kolumn ger en mycket effektivare separation av olika klasser av vattenlösliga metaboliter än den omvända faskolonnen som nämns i Materialförteckningen (kompletterande tabell 1). Retentionstidens (RT) skiftvärden för vattenlösliga metabolitstandarder (dvs. NAD+, AMP, GMP, arginin och glutaminsyra) var betydligt lägre och toppformerna var betydligt skarpare för zwitterionic-faskolonnen, jämfört med den omvända faskolonnen (kompletterande tabell 1). LC-förhållanden som används för kromatografisk separation av alla metaboliter (dvs. vattenlösliga och vattenlösliga) för den omvända faskolonnen finns i kompletterande tabell 2.

En annan fördel med LC-MS/MS-metoden består i förmågan att kromatografisk separation på ovanstående zwitterionic-faskolonn effektivt separera från varandra olika vattenlösliga metaboliter med olika strukturella, fysiska och kemiska egenskaper. Dessa vattenlösliga metaboliter omfattar följande metabolitklasser: 1) sura, grundläggande, neutrala polära och icke-neutrala polära aminosyror, inklusive deras olika strukturella isomererer (figur 6); 2) Stabila och instabila nukleotider och deras derivat som utför vitala funktioner i en cell (figur 7). och 3) olika monosackarider, inklusive deras olika stereoisomeriska former(figur 8).

Viktigt är att LC-MS/MS-metoden för en kvantitativ bedömning av vattenlösliga metaboliter i en jästcell var mångsidig och robust. Det gjorde det möjligt för oss att identifiera och kvantifiera 374 vattenlösliga metaboliter med olika strukturella, fysiska och kemiska egenskaper i S. cerevisiae celler som odlades i hela YP medium som ursprungligen innehåller 2% glukos (Kompletterande tabell 3). 240 metaboliter upptäcktes i det positiva joniseringsläget och 134 metaboliter upptäcktes i det negativa joniseringsläget. Identiteterna på alla dessa vattenlösliga metaboliter bekräftades genom att matcha deras databeroende förvärv (DDA) MS2 fragment förvärvade både i positiva och negativa joniseringslägen till MS2 mzCloud spektral bibliotek. Detta onlinebibliotek innehåller spektra av metabolitstandarder som skiljer sig åt i deras MS1- och DDA MS2-parametrar. För att maximera omfattningen av att matcha MS2-spektrat i provet med onlinespektrabiblioteket använde vi olika DDA MS2-parametrar. Dessa parametrar anges i kompletterande tabell 4. Nästan 6 000 funktioner (förmodade metaboliter) för samma prov förvärvades med hjälp av metoden högenergiinducerad kollisionsdisociation (HCD) eller kollisionsinducerad dissociation (CID) fragmenteringsmetod, med hjälp av topp 5 MS2-händelser, 35 kollisionsenergivärden och 10 ms aktiveringstider. Efter filtrering av de resulterande filerna med > 95% MS2 matchande och > 90% MS1 isotopiska mönster matchning kriterier, identifierades endast 162 metaboliter under HCD fragmenterade villkor och 142 metaboliter under CID fragmenterade villkor. 81 av 162 metaboliter var unika för HCD-fragmenteringsmetoden, medan 42 av 142 var unika för CID-fragmenteringsmetoden (se ett blad med namnet "T5_35E__10 ms_HCD vs CID" i kompletterande tabell 4). Därför drog vi slutsatsen att korrekt anteckning av vattenlösliga metaboliter med hjälp av LC-MS/MS-metoden kräver användning av många olika DDA MS2-parametrar.

LC-MS/MS-metoden är också mycket känslig. Det gör det möjligt att identifiera och kvantifiera vissa vattenlösliga metaboliter vid koncentrationer så låga som 0,05 pmol/μL (se data för fenylalanin i tabell 4). Denna kvantifieringsgräns varierar inom ett brett spektrum av koncentrationer för olika metabolitklasser (tabell 4).

Det MS-system som används här har ett brett (minst två storleksordningar) linjärt dynamiskt intervall för mätning av koncentrationerna av olika metaboliter(kompletterande tabell 5).

Figure 1
Figur 1: Det totala jonkromatogrammetogrammet (TIC) från flytande kromatografi/masspektrometri (LC-MS) data från vattenlösliga metaboliter som extraherades från celler av den vilda stammen BY4742. Metaboliterna separerades av LC på den zwitterionic-fas kromatografi kolumnen som heter i Tabell över material. Metaboliterna upptäcktes av MS av överordnade joner (MS1) som skapades med hjälp av positiva electrospray jonisering läge. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Ett arbetsflöde som används för analys av vattenlösliga metaboliter med hjälp av programvaran som heter i Materialförteckningen. Alla parametrar var autokorrigerade av programvaran baserat på MS-rådata, förutom följande: 1) fliken "Identifiera föreningar": ställ in min, toppintensitet 10 000; och 2) fliken "Search ChemSpider": 4 onlinedatabaser valdes ut för identifiering av metaboliter, inklusive BioCyc, Human Metabolome Database, KEGG och Yeast Metabolome Database. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3:Differentiell interferenskontrast (DIC; översta raden) och fluorescensbilder (nedre raden) av jästceller som släckts antingen med ammoniumbikarbonatbuffert (pH = 8,0; kontroll) eller med en annan släckningslösning. Efter cellsläckning inkuberades lika många celler med PI-lösningen i 10 minuter i mörker och på is. Den mest intensiva röda fluorescensen omvandlades till grön fluorescens genom programvara för att skilja mellan de starka röda fluorescens- och milda röda fluorescensutsläppen. Effektiviteten av skadorna på PM och CW jämfördes med metoden för cellsläckning (dvs. genom cellbehandling med 60% (v/v) metanol vid -20 °C i närvaro av en isoton buffrad lösning av ABC vid pH = 8,0) och en av de metoder som för närvarande används (dvs. genom cellbehandling med 80% (v/v) metanol vid -40 °C i avsaknad av en buffert). En skalbar visas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Läckageprocenten för olika aminosyraklasser för metoden för cellsläckning. Läckageprocenten för olika aminosyraklasser bedömdes med hjälp av LC-MS/MS för att mäta deras koncentrationer i den extracellulära lösningen före och efter släckning. Medelvärdena ± SD och enskilda datapunkter visas (n = 3). * p < 0,05. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Läckageprocenten för olika aminosyraklasser för en av de för närvarande använda cellsläckningsmetoderna. Läckageprocenten för olika aminosyraklasser bedömdes med hjälp av LC-MS/MS för att mäta deras koncentrationer i den extracellulära lösningen före och efter släckning. Medelvärdena ± SD och enskilda datapunkter visas (n = 3). * p < 0,05. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6:Effektiv kromatografisk separation av sura, grundläggande, neutrala polära och icke-neutrala polära aminosyraklasser, inklusive två strukturella isomerer (dvs. leucin och isoleucin), på zwitterionic-faskolonnen som heter i materialförteckningen. Alla dessa aminosyror upptäcktes av MS/MS i positiv jonisering [ESI (+)] läge. Villkoren för LC på kromatografikolonnen zwitterionic-phase beskrivs i tabell 1. Villkoren för MS/MS beskrivs i tabell 2 och tabell 3. Alla aminosyrastandarder köps kommersiellt (t.ex. Sigma). Retentionstiden skiftar mellan 3 oberoende kromatografikörningar är mindre än ± 10 sekunder. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7:Effektiv kromatografisk separation av olika klasser av nukleotider, inklusive energiskt instabila nukleotider (monofosfater vid nukleosid, nukleosiddiofosfater och nukleosidtrifosfater) och elektronbärarmolekyler (NADH och NAD+), på zwitterionic-faskolonnensomnämns i materialförteckningen. Alla dessa nukleotider upptäcktes av MS/MS i det positiva joniseringsläget [ESI (+)]. Villkoren för LC på kromatografikolonnen zwitterionic-phase beskrivs i tabell 1. Villkoren för MS/MS beskrivs i tabell 2 och tabell 3. Alla nukleotidstandarder köps kommersiellt (t.ex. Sigma). Retentionstiden skiftar mellan 3 oberoende kromatografikörningar är mindre än ± 10 sekunder. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 8
Figur 8:Effektiv kromatografisk separation av olika klasser av monosackarider, inklusive strukturella isomerer och stereoisomeriska former av aldo- och ketohexoser (fruktos, mannos och galaktos) och aldopentoser (ribos och arabinose), på zwitterionic-faskolonnen somheter iMaterialförteckningen. Alla dessa monosackarider upptäcktes av MS/MS i det positiva joniseringsläget [ESI (+)]. Villkoren för LC på kromatografikolonnen zwitterionic-phase beskrivs i tabell 1. Villkoren för MS/MS beskrivs i tabell 2 och tabell 3. Alla monosackaridstandarder köps kommersiellt (t.ex. Sigma). Retentionstiden skiftar mellan 3 oberoende kromatografikörningar är mindre än ± 10 sekunder. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Kolumntyp SeQuant ZIC-pHILIC 5μm polymer 150 x 2,1 mm
Lösningsmedel A LC-MS klass H2O: ACN (95:5, v/v) 20 mM Ammoniumacetat
Lösningsmedel B Acetonitrile av LC-MS-klass (ACN)
Tryckgräns Maximalt = 300 bar Minimum = 0
HPLC-övertoningsprogram
Tid (minuter) Flödeshastighet (0,25 ml/min) Kompositioner
A% B%
0.5 0.25 5 95
26 0.25 40 60
30 0.25 70 30
31 0.25 70 30
31.1 0.4 5 95
43.9 0.4 5 95
44 0.25 5 95
45 0.25 5 95

Tabell 1: LC-tillstånd som används för separation av vattenlösliga metaboliter med hjälp av den zwitterioniska faskolonnensomnämns i materialförteckningen. Dessa villkor användes i alla experiment som beskrivs här.

Full skanningsmassintervall (Dalton) 70-900
FTMS (Orbitrap-analysator) full skanningsupplösning 6,0 x 104
FTMS-upplösning (Orbitrap-analysator) 7500
FTMS full skanning AGC-mål 1,0 x 106
FTMS MSn AGC-mål 5,0 x 104
Ion trap (LTQ) MSn AGC mål 1,0 x 104
Typ av jonkälla Uppvärmd elektrosprayjonisering
Kapillärtemperatur (°C) 275
Källa värmare Temperatur (°C) 250
Gasflöde av mantylt 10
Aux Gas flöde 5

Tabell 2: De masspektrometerinställningar som används för att analysera metaboliter som separerades av LC. Dessa villkor användes för analys av metaboliter i alla experiment som beskrivs här. Förkortningar: FTMS = Fourier transform (FTMS); HCD = högenergiinducerad-kollision-dissociation; LTQ = linjär fälla fyrdubbel; AGC = automatisk förstärkningskontroll, ett jonpopulationsvärde för MS och MS/MS.

Instrumentpolaritet Positivt/negativt
Typ av aktivering CID/HCD (engelska)
Min. signal krävs 5000
Isoleringsbredd 2
Normaliserade kollisionsenergier för CID 35, 60
Normaliserade kollisionsenergier för HCD 35, 45, 55
Standardavgiftstillstånd 1
Aktiveringstid för CID (ms) 10, 30
Aktiveringstid för HCD (ms) 10
Antal MS/MS-händelser i CID Topp 3, Topp 5, Topp 10
Antal MS/MS-händelser i HCD Topp 5
Antal mikroskanningar som används i både HCD och CID 1

Tabell 3: De inställningar för masspektrometer som används för att upptäcka sekundära joner (MS2). Förkortningar: HCD = högenergiinducerad kollision-dissociation; CID = kollision inducerad dissociation; ms = millisekunder.

Std Metaboliter M.W. (g/mol) [M+H]+1 [M-H]-1 Identifieringsläge Lägsta koncentration upptäckt (pmol/μL)
glycin 75.03203 76.03931 74.02475 P 7.43E+00
tryptofan 204.08988 205.09716 203.0826 P 5.56E-02
fenylalanin 165.07898 166.08626 164.0717 P 5.14E-02
arginin 174.11168 175.11896 173.1044 P 7.14E-02
treonin* 119.05824 120.06552 118.05096 P
serin 105.04259 106.04987 104.03531 P 4.66E+00
glutamat 147.05316 148.06044 146.04588 P 4.20E-01
metionin 149.05105 150.05833 148.04377 P 1.96E+00
Aspartat 133.03751 134.04479 132.03023 P 3.75E+00
valin 117.07898 118.08626 116.0717 P 1.49E+00
isoleucin 131.09463 132.10191 130.08735 P 1.84E+00
leucin 131.09463 132.10191 130.08735 P 2.26E+00
histidin 155.06948 156.07676 154.0622 P 2.53E+00
tyrosin 181.07389 182.08117 180.06661 P 8.72E-02
lysin 146.10553 147.11281 145.09825 P 1.43E-01
alanin 89.04768 90.05496 88.0404 P 1.12E+00
prolin 115.06333 116.07061 114.05605 P 1.05E+00
cystein 121.01975 122.02703 120.01247 P 8.22E-01
sparris 132.05349 133.06077 131.04621 P 1.08E+00
glutamin 146.06914 147.07642 145.06186 P 1.92E+00
guanin 151.04941 152.05669 150.04213 P 5.47E+00
guanosin 283.09167 284.09895 282.08439 P 3.67E-01
GMP (GMP) 363.058 364.06528 362.05072 P 7.17E-01
BRUTTONATIONALPRODUKT 443.02434 444.03162 442.01706 P 2.57E+00
GTP 522.99067 523.99795 521.98339 P 2.27E+00
AMPERE 347.06309 348.07037 346.05581 P 5.25E-01
ADP 427.02942 428.0367 426.02214 P 1.32E+00
ATP 506.99575 508.00303 505.98847 P 1.77E+00
NADH 665.12478 666.13206 664.1175 P 1.47E+00
NAD+ (nad+ 663.10912 664.1164 662.10184 P 3.03E+00
glukos** 180.06339 181.07067 179.05611
fruktos*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 5.67E-01
mannos*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 1.05E+00
galaktos*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 9.00E-01
ribos*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1.10E+00
arabinose*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1.23E+00
fruktos-6-fosfat*** 260.02972 261.037 259.02244 N 6.60E+00
glukos-6-fosfat*** 260.02972 261.037 259.02244 N 4.27E+00
citronsyra 192,12 g 193.034279 191.019726 N 9.33E-01
äppelsyra 134.09 135.0288 133.014247 N 1.23E+00
pyruvic syra 88.06 89.02332 87.008768 N 2.77E+00

Tabell 4:De lägsta koncentrationerna av olika vattenlösliga metabolitstandarder som LC-MS/MS-metoden kan identifiera och kvantifiera. MS1-toppområdet för varje metabolitstandard användes för att uppskatta den lägsta kvantifierbara koncentrationen för denna metabolit. Medelvärden för två oberoende experiment visas. Tre tekniska replikat utfördes för vart och ett av de två oberoende experimenten. OBS: Treonin* kan detekteras men kan inte kvantifieras på grund av dess co-elution med homoserin, en kemisk isomer av treonin. Glukos** kan inte identifieras eftersom det skapar flera kromatografitoppar. Metabolitstandarder*** kan identifieras och kvantifieras endast i enskilda prover, men inte i en blandning av metabolitstandarder eller en biologisk blandning av metaboliter.

Kompletterande tabell 1: Rt-skiftvärden (Retention Time) för samma uppsättning metaboliter för zwitterionic-fas- och reverse-phase-kolumnerna (se Materialförteckning) efter kolumnjämvikt. Tabellen jämför retentions reproducerbarheten hos zwitterionic-fasen och omvända fas kolonner för en distinkt uppsättning metaboliter som skiljer sig från varandra i deras hydrofilicitet och hydrofobi. Dessa metaboliter identifierades med hjälp av LC-MS/MS. Observera att RT-skiftvärdena för hydrofila metaboliter (dvs. NAD+, AMP, GMP, arginin och glutaminsyra) är betydligt lägre och toppformerna är betydligt skarpare för zwitterionic-faskolonnen jämfört med den omvända faskolonnen. RT-skiftvärdena för hydrofobiska metaboliter (dvs. stearinsyra, laurinsyra och decanosyra) är däremot betydligt lägre och toppformerna är betydligt skarpare för den omvända faskolonnen jämfört med zwitterionic-faskolonnen. Villkoren för kromatografisk separation av metaboliter med hjälp av zwitterionic-fasen och omvända faskolonner beskrivs i tabell 1 respektive kompletterande tabell 2. De rapporterade RT-skiftvärdena här baseras på mätningen av 20 olika prover tagna från olika injektionsflaska. Proverna analyserades efter kolumn jämvikt. Metaboliterna i varje prov extraherades från 5,0 × 108 jästceller. RT-skiftvärden är medel för 20 olika prover (n = 20). De p-värden som härleddes från det oparerade t-testet användes för att jämföra de två kolumnerna med lika variansen mellan båda provtyperna. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Kompletterande tabell 2: LC-villkor för den omvända fas 8-kolumnen som nämns i materialförteckningen och som används för att separera olika metaboliter i denna studie. Kolonnegenskaperna var följande: 150 x 2,1 mm, 5 μm polymer. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Kompletterande tabell 3: En förteckning över alla 374 vattenlösliga metaboliter som återvunnits och kommenterats med hjälp av LC-MS/MS-metoden. Alla metaboliter återfanns från samma LC-gradientkörning, utsattes för en databeroende anskaffningsfragmenteringsalgoritm (DDA) som beskrivs i kompletterande tabell 4och kommenterades med hjälp av programvaran som heter i Materialförteckningen. MS1-toppformerna på 211 metaboliter (vars status i tabellen anges som ett tomt) var lämpliga för kvantifiering, och deras respektive MS2-spektra hade fullständiga matchningar med mzCloud-spektralbiblioteket. MS2-spektra av 38 metaboliter (vars status i tabellen anges som d) hade fullständiga matchningar med onlinespektrabiblioteket. Ändå var deras MS1-toppformer inte lämpliga för kvantifiering. MS2-spektra av 125 metaboliter (vars status i tabellen anges som ett n) hade inte fullständiga matchningar med onlinespektrabiblioteket. Dessa metaboliter kommenterades på följande sätt: 1) med hjälp av "Predict composition node" (som kommenterar metaboliter baserat på den exakta matchningen av MS1-värden, antal matchade och missade isotoper och isotopens % intensitet som matchas med de teoretiska referensstandarderna); 2) använda noden "ChemSpider" (som kommenterar metaboliter baserat på den exakta matchningen av MS1-värden och likhetsmatchningspoäng för MS2-spektra med onlinespektrabiblioteket); och 3) med hjälp av retentionstiden (RT) skiftvärden för metaboliter (dessa värden beror på metaboliternas fysiska struktur och kemiska egenskaper). De metaboliter som anges i tabellen hittades i alla 3 biologiska replikat som utfördes, med RT-skiftvärdena på < 0,2 min. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Kompletterande tabell 4: En DDA-fragmenteringsalgoritm (databeroende förvärv) som användes här för anteckning av vattenlösliga metaboliter med hjälp av programvaran som heter i Materialförteckningen.

Kompletterande tabell 5: Ett typiskt linjärt dynamiskt intervall som vi observerade när vi mätte koncentrationerna av olika aminosyror med hjälp av MS-systemet som nämns i materialförteckningen. Ms-systemet som används här har ett brett (minst två storleksordningar) linjärt dynamiskt intervall för mätning av olika metaboliters koncentrationer. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Följ de förebyggande åtgärder som beskrivs nedan för att framgångsrikt använda protokollet som beskrivs här. Kloroform och metanol extraherar olika ämnen från laboratorieplastartiklar. Hantera dem därför med försiktighet. Undvik användning av plast i steg som innebär kontakt med något av dessa två organiska lösningsmedel. Använd borosilikatglaspipetter för dessa steg. Jäs dessa pipetter med kloroform och metanol före användning. Använd endast mikropipettespetsar och rör av polypropylen som är resistenta mot organiska lösningsmedel. Under provberedningen för LC-MS/MS eliminerar du alla luftbubblor i glasflaskorna innan du sätter in dem i en brunnsplatta.

Zwitterionic-faskolonnen som används här kräver omfattande omkonditionering efter varje körning för att minimera RT-skiftet. För omkonditionering av kolumner rekommenderar vi att du använder en volym av omkonditioneringslösningen som är cirka 20 volymer av kolumnen. Kolonnen måste konditioneras om med den ursprungliga mobila fasen i 15 minuter med en ökad flödeshastighet på 0,4 ml/min. För att undvika skador på kolonnen under omkonditioneringen, håll kolonntrycket under den övre tryckgränsen som rekommenderas av tillverkaren.

Observera att vissa kromatografikolonner med blandad separation som fungerar i omvändfasläge tillåter upplösning av laddade metaboliter40,41. Dessa kolumner med blandad separation baseras på den omvända faskolonnen som används här (se Materialförteckning)och innehåller polära inbäddade grupper som kan separera metaboliter baserat på laddning40,41.

Här beskrev vi en LC-MS/MS-baserad metod av icke-riktad metabolomik för kvantitativ analys av många vattenlösliga metaboliter extraherade från jästceller. Metoden ger flera fördelar jämfört med LC-MS/MS-metoderna för icke-riktad metabolomik som för närvarande används för detta ändamål. Dessa fördelar inkluderar följande. För det första är metoden känslig och gör det möjligt att identifiera och kvantifiera vissa vattenlösliga metaboliter vid koncentrationer så låga som 0,05 pmol/μL. Den rapporterade känsligheten hos de befintliga LC-MS/MS-metoderna ärlägre 3,22,27,42. För det andra använder metoden ett cellsläckande förfarande som framkallar ett betydligt lägre läckage av intracellulära metaboliter från cellen än det som rapporterats för de för närvarande användaprocedurerna 31,33,38. Således sänker förfarandet som vi utvecklade för cellsläckning i vilken utsträckning de för närvarande använda förfarandena underskattar de intracellulära koncentrationerna av vattenlösliga metaboliter. För det tredje skiljer metoden, till skillnad från de befintliga LC-MS/MS-metoderna2,31,33, mellan olika strukturella isomerer och stereoisomeriska former av många metaboliter. Dessa metaboliter inkluderar olika energibärarmolekyler, nukleotider, aminosyror, monosackarider, intermediärer av glykolys och trikarboxylcykel intermediärer. För det fjärde använde vi metoden för att skapa en omfattande masspektrala databas över MS1 och MS2 för korrekt identifiering och kvantifiering av ett brett spektrum av specifika metaboliter med hjälp av råa LC-MS/MS-data. Däremot är de befintliga masspektrala onlinedatabaserna MS1 och MS2 ofullständiga43,44,45. För det femte använder metoden en enda typ av metabolitextraktion för att återställa vattenlösliga metaboliter med olika strukturella, fysiska och kemiska egenskaper. Dessa metaboliters mångfald överstiger avsevärt de alternativa metoderna för en enstegsextraktion av vattenlösliga metaboliter från jästceller3,22,27,46. Sex, till skillnad från de befintliga LC-MS/MS-metoderna 3,22,47,48, använder metoden en enda typ av LC-kolumnen för att skilja från varandra olika strukturella och funktionella klasser av vattenlösliga metaboliter. Sju, metoden möjliggör identifiering och kvantifiering av mer än 370 vattenlösliga metaboliter extraherade från jästceller. Detta antal identifierbara och kvantifierbara metaboliter överstiger antalet metaboliter som rapporterats för andra metoder för icke-riktad metabolomik i jäst3,22,27,49,50.

Metoden har flera begränsningar. Dessa begränsningar är följande. Zwitterionic-fas kolonnen som används för metabolit separation av LC kräver omfattande omkonditionering efter varje körning. Dessutom är metoden endast effektiv för icke-målmetabolomik av vattenlösliga, hydrofila metaboliter. Dessutom kan olika isomeriska former av kolhydrater (inklusive isomerer av fruktos, glukos och galaktos) inte kvantifieras med hjälp av metoden. Detta beror på att den zwitterionic-fas kolumnen som används i metoden inte kan skilja dessa kolhydrat isomerer från varandra när de finns i en blandning med andra metaboliter. Dessutom kan metoden inte utnyttjas för att identifiera glukos eftersom denna kolhydrat skapar flera toppar under kromatografi på den zwitterionic-faskolonnen som används i metoden. Slutligen kan treonin inte kvantifieras med hjälp av metoden på grund av att denna aminosyra samutspäds med dess isomer homoserin under metabolitseparation genom kromatografi.

Vi använder denna LC-MS/MS-metod för att studera åldrande-associerade förändringar i vattenlöslig metabolom av spirande jäst S. cerevisiae. Vi använder också denna metod för att undersöka hur många åldrande-fördröja genetiska, kost och farmakologiska interventioner påverkar vattenlösliga metabolom av jästceller under deras kronologiska åldrande. På grund av dess mångsidighet, robusthet och känslighet kan LC-MS/MS-metoden framgångsrikt användas för kvantitativ bedömning av vattenlösliga metabolomer i evolutionärt avlägsna eukaryota organismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi är tacksamma mot nuvarande och tidigare medlemmar av Titorenkolaboratoriet för diskussioner. Vi bekräftar Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Centre for Structural and Functional Genomics och Centre for Microscopy and Cellular Imaging (alla vid Concordia University) för enastående tjänster. Denna studie stöddes av bidrag från Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) i Kanada (RGPIN 2014-04482 och CRDPJ 515900 - 17). K.M. stöddes av Concordia University Armand C. Archambault Fellowship och Concordia University Dean of Arts and Sciences Award of Excellence.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acetonitrile Fisher Scientific A9554
Ammonium acetate Fisher Scientific A11450
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Bactopeptone Fisher Scientific BP1420-2
Chloroform Fisher Scientific C297-4
Glucose Fisher Scientific D16-10
L-histidine Sigma H8125
L-leucine Sigma L8912
L-lysine Sigma L5501
Methanol Fisher Scientific A4564
Methanol Fisher Scientific A4564
Propidium iodide Thermo Scientific R37108
Uracil Sigma U0750
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottles Beckman 355664
Agilent 1100 series LC system Agilent Technologies G1312A
Beckman Coulter Centrifuge Beckman 6254249
Beckman Coulter Centrifuge Rotor Beckman JA-10
Centra CL2 clinical centrifuge Thermo Scientific 004260F
Digital thermometer Omega HH509
Foam Tube Holder Kit with Retainer Thermo Scientific 02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) Sigma Milipore 150460
Thermo Orbitrap Velos MS Fisher Scientific ETD-10600
Ultrasonic sonicator Fisher Scientific 15337416
Vortex Fisher Scientific 2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm Agilent Technologies 883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps Fisher Scientific 60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) Sigma-Aldrich G8772
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps PYREX 05-550
Software
Compound Discoverer 3.1 Fisher Scientific V3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742 Dharmacon YSC1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786 (2016).
  2. Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
  3. Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
  4. López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
  5. Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
  6. Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
  7. Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
  8. Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
  9. Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive 'hunger factor' linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
  10. Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
  11. Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
  12. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
  13. Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973 (2020).
  14. Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
  15. Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
  16. Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
  17. Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
  18. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  19. Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
  20. Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  21. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020 (2018).
  22. Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046 (2019).
  23. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
  24. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  25. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  26. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
  27. Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  28. Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588 (2015).
  29. Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
  30. Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
  31. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  32. Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148 (2017).
  33. Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
  34. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  35. Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308 (2019).
  36. Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301 (2019).
  37. Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
  38. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
  39. Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
  40. Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
  41. Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122 (2018).
  42. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
  43. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  44. Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3 (2018).
  45. Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251 (2019).
  46. Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
  47. Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
  48. Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
  49. Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
  50. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).

Tags

Biokemi nummer 167 vattenlösliga metaboliter metabolomikprofilering släckning av metabolisk aktivitet propidiumjodidfärgning fluorescensmikroskopi extraktion av metaboliter energibärarmolekyler nukleotider aminosyror monosackarider flytande kromatografi masspektrometri
Kvantitativ metabolomik av <em>sackaromyces Cerevisiae</em> med flytande kromatografi i kombination med tandemmasspektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko,… More

Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko, V. I. Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (167), e62061, doi:10.3791/62061 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter