Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Metabolómica cuantitativa de Saccharomyces cerevisiae mediante cromatografía líquida combinada con espectrometría de masas en tándem

Published: January 5, 2021 doi: 10.3791/62061
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Concordia University, 2Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

Summary

Presentamos un protocolo para la identificación y cuantificación de las principales clases de metabolitos solubles en agua en la levadura Saccharomyces cerevisiae. El método descrito es versátil, robusto y sensible. Permite la separación de isómeros estructurales y formas estereoisoméricas de metabolitos solubles en agua entre sí.

Abstract

La metabolómica es una metodología utilizada para la identificación y cuantificación de muchos productos intermedios de bajo peso molecular y productos del metabolismo dentro de una célula, tejido, órgano, fluido biológico u organismo. La metabolómica se centra tradicionalmente en los metabolitos solubles en agua. El metaboloma soluble en agua es el producto final de una compleja red celular que integra varios factores genómicos, epigenómicos, transcriptómicos, proteómicos y ambientales. Por lo tanto, el análisis metabolómico evalúa directamente el resultado de la acción para todos estos factores en una gran cantidad de procesos biológicos dentro de varios organismos. Uno de estos organismos es la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae,un eucariota unicelular con el genoma completamente secuenciado. Debido a que S. cerevisiae es susceptible de análisis moleculares exhaustivos, se utiliza como modelo para diseccionar los mecanismos subyacentes a muchos procesos biológicos dentro de la célula eucariota. Un método analítico versátil para la evaluación cuantitativa robusta, sensible y precisa del metaboloma soluble en agua proporcionaría la metodología esencial para diseccionar estos mecanismos. Aquí presentamos un protocolo para las condiciones optimizadas de enfriamiento de la actividad metabólica y la extracción de metabolitos solubles en agua de las células de S. cerevisiae. El protocolo también describe el uso de cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para el análisis cuantitativo de los metabolitos solubles en agua extraídos. El método LC-MS/MS de metabolómica no dirigida descrito aquí es versátil y robusto. Permite la identificación y cuantificación de más de 370 metabolitos solubles en agua con diversas propiedades estructurales, físicas y químicas, incluidos diferentes isómeros estructurales y formas estereoisoméricas de estos metabolitos. Estos metabolitos incluyen varias moléculas portadoras de energía, nucleótidos, aminoácidos, monosacáridos, intermediarios de la glucólisis e intermedios del ciclo tricarboxílico. El método LC-MS/MS de metabolómica no dirigida es sensible y permite la identificación y cuantificación de algunos metabolitos solubles en agua a concentraciones tan bajas como 0,05 pmol/μL. El método se ha utilizado con éxito para evaluar metabolomas solubles en agua de células de levadura mutantes y de tipo silvestre cultivadas en diferentes condiciones.

Introduction

Los metabolitos solubles en agua son intermedios de bajo peso molecular y productos del metabolismo que contribuyen a los procesos celulares esenciales. Estos procesos conservados evolutivamente incluyen la conversión de nutrientes en energía utilizable, síntesis de macromoléculas, crecimiento celular y señalización, control del ciclo celular, regulación de la expresión génica, respuesta al estrés, regulación post-tralacional del metabolismo, mantenimiento de la funcionalidad mitocondrial, tráfico celular vesicular, autofagia, envejecimiento celular y muerte celular regulada1,2,3.

Muchos de estos papeles esenciales de los metabolitos solubles en agua han sido descubiertos por estudios en la levadura en ciernes S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Este eucariota unicelular es un organismo modelo útil para diseccionar mecanismos a través de los cuales los metabolitos solubles en agua contribuyen a los procesos celulares debido a su capacidad para realizar análisis bioquímicos, genéticos y biológicos moleculares avanzados23,24,25,26. Aunque los métodos LC-MS/MS de metabolómica no dirigida se han utilizado para estudiar las funciones de los metabolitos solubles en agua en la levadura en ciernes3,18,22,27,este tipo de análisis requiere la mejora de su versatilidad, robustez, sensibilidad y capacidad para distinguir entre diferentes isómeros estructurales y formas estereoisoméricas de estos metabolitos.

Los últimos años están marcados por avances significativos en la aplicación de los métodos LC-MS/MS de metabolómica no dirigida al perfil de metabolitos solubles en agua in vivo. Sin embargo, muchos desafíos en el uso de esta metodología siguensiendo 2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Estos desafíos incluyen los siguientes. En primer lugar, las concentraciones intracelulares de muchos metabolitos solubles en agua están por debajo de un umbral de sensibilidad para los métodos utilizados actualmente. En segundo lugar, la eficiencia del enfriamiento de la actividad metabólica es demasiado baja, y el grado de fuga celular asociada al enfriamiento de metabolitos intracelulares es demasiado alto para los métodos actuales; por lo tanto, los métodos utilizados actualmente subestiman las concentraciones intracelulares de metabolitos solubles en agua. En tercer lugar, los métodos existentes no pueden diferenciar los isómeros estructurales (es decir, moléculas con la misma fórmula química pero diferente conectividad atómica) o estereoisómeros (es decir, moléculas con la misma fórmula química y conectividad atómica, pero con la diferente disposición atómica en el espacio) de metabolitos específicos; esto impide la correcta anotación de ciertos metabolitos por los métodos utilizados actualmente. Cuarto, las bases de datos en línea espectrales de masas existentes de iones padres (MS1) e iones secundarios (MS2) están incompletas; esto afecta a la correcta identificación y cuantificación de metabolitos específicos utilizando los datos brutos de LC-MS/MS producidos con la ayuda de los métodos actuales. En quinto lugar, los métodos existentes no pueden utilizar un solo tipo de extracción de metabolitos para recuperar todas o la mayoría de las clases de metabolitos solubles en agua. En sexto lugar, los métodos existentes no pueden utilizar un solo tipo de columna LC para separar entre sí todas o la mayoría de las clases de metabolitos solubles en agua.

Aquí, optimizamos las condiciones para apagar la actividad metabólica dentro de las células de S. cerevisiae, manteniendo la mayoría de los metabolitos solubles en agua dentro de estas células antes de la extracción y extrayendo la mayoría de las clases de metabolitos solubles en agua de las células de levadura. Desarrollamos un método versátil, robusto y sensible para la identificación y cuantificación basada en LC-MS/MS de más de 370 metabolitos solubles en agua extraídos de células de S. cerevisiae. Este método de metabolómica no dirigida permite evaluar las concentraciones intracelulares de varias moléculas portadoras de energía, nucleótidos, aminoácidos, monosacáridos, intermediarios de la glucólisis e intermedios del ciclo tricarboxílico. El método LC-MS/MS desarrollado permite la identificación y cuantificación de diferentes isómeros estructurales y formas estereoisoméricas de metabolitos solubles en agua con diversas propiedades estructurales, físicas y químicas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hacer y esterilizar un medio para el cultivo de levadura

  1. Hacer 180 ml de un extracto de levadura completo con medio de bactopeptona (YP). El medio YP completo contiene 1% (p/v) de extracto de levadura y 2% (p/v) de bactopeptona.
  2. Distribuya 180 ml del medio YP por igual en cuatro matraces Erlenmeyer de 250 ml. Cada uno de estos matraces contiene 45 ml del medio YP.
  3. Esterilizar los matraces con medio YP en autoclave a 15 psi/121 °C durante 45 min.

2. Cepa de levadura de tipo salvaje

  1. Utilice la cepa BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).

3. Cultivo de levadura en el medio YP que contiene 2% de glucosa

  1. Esterilizar una solución de glucosa al 20% (p/v) mediante autoclave a 15 psi/121 °C durante 45 min.
  2. Añadir 5 ml de la solución de glucosa al 20% (p/v) en autoclave a cada uno de los dos matraces Erlenmeyer con 45 ml del medio YP esterilizado. La concentración final de glucosa en el medio YP es del 2% (p/v).
  3. Utilice un asa microbiológica para inocular las células de levadura en cada uno de los dos matraces de Erlenmeyer con el medio YP que contiene 2% de glucosa.
  4. Cultive las células de levadura durante la noche a 30 °C en un agitador rotacional a 200 rpm.
  5. Tome una alícuota de cultivo de levadura. Determinar el número total de células de levadura por ml de cultivo. Cuente las células con un hemocitómetro.

4. Transferencia celular y crecimiento celular en el medio YP con 2% de glucosa

  1. Añadir 5 ml de la solución de glucosa esterilizada al 20% (p/v) a cada uno de los dos matraces Erlenmeyer restantes con el medio YP en autoclave. La concentración final de glucosa es del 2% (p/v).
  2. Transfiera un volumen del cultivo de levadura durante la noche en medio YP con 2% de glucosa que contenga el número total de 5.0 x 107 células en cada uno de los dos matraces Erlenmeyer con el medio YP que contenga 2% de glucosa. Use una pipeta estéril para la transferencia celular.
  3. Cultive las células de levadura durante al menos 24 h (o más, si el experimento lo requiere) a 30 °C en un agitador rotacional a 200 rpm.

5. Fabricación de reactivos, preparación de material de laboratorio y configuración de equipos para el enfriamiento celular

  1. Prepare lo siguiente: 1) una solución de enfriamiento (60% de metanol de alto grado (>99.9%) en tampón de bicarbonato de amonio (ABC) de 155 mM, pH = 8.0); 2) una solución ABC helada (pH = 8.0); 3) un termómetro digital capaz de medir hasta -20 °C; 4) botellas de centrífuga grandes de 500 ml; 5) una centrífuga de alta velocidad preenfriada con un rotor preenfriado y botellas de centrífuga de 500 ml preenfriadas para este rotor, todo a -5 °C; 6) tubos de extracción de metabolitos (tubos de centrífuga de vidrio de alta velocidad de 15 ml con tapas revestidas de politetrafluoroetileno); y 7) hielo seco.

6. Enfriamiento celular

  1. Use un hemocitómetro para determinar el número de células de levadura por ml de YP con cultivo de glucosa al 2%.
  2. Transfiera un volumen del cultivo en medio YP con 2% de glucosa que contenga el número total de 5.0 x 108 células en botellas de centrífuga preenfriadas de 500 ml.
  3. Llene rápidamente el frasco de centrífuga que contiene las células hasta el volumen de 200 ml con una solución de enfriamiento almacenada a -20 °C.
  4. Centrifugar las botellas en una centrífuga de alta velocidad a 11.325 x g durante 3 min a -5 °C.
  5. Recupere rápida y tiernamente la botella de la centrífuga; Desenrosque suavemente la tapa y retire el sobrenadante sin molestar el pellet.
  6. Resuspeda rápidamente el pellet celular en 10 ml de tampón ABC helado y transfiera la suspensión a un tubo centrífuga de vidrio de alta velocidad de 15 ml con una tapa revestida de politetrafluoroetileno para la extracción de metabolitos.
  7. Recoger células por centrifugación en una centrífuga clínica a 3.000 x g durante 3 min a 0 °C.
  8. Retire rápidamente el sobrenadante y coloque el tubo sobre hielo seco para comenzar la extracción del metabolito o guarde el tubo a -80 °C hasta la extracción.

7. Preparación de reactivos, material de laboratorio y equipos para la extracción de metabolitos

  1. Prepare lo siguiente: 1) cloroformo de grado LC-MS; 2) Metanol de grado LC-MS; 3) Agua nano-pura de grado LC; 4) Grado LC-MS (ACN); 5) perlas de vidrio (lavadas con ácido, 425-600 μm); 6) un vórtice con un kit de soporte de tubo de espuma con retenedor; 7) Tubos centrífugos de vidrio de alta velocidad de 15 ml con tapas revestidas de politetrafluoroetileno; 8) viales de EM; 9) hielo seco; y 10) tubos de 1,5 ml lavados una vez con etanol, una vez con ACN y una vez con agua nano-pura.
    NOTA: Use solo puntas y tubos de micropipetas hechos de polipropileno que sea resistente a los solventes orgánicos.

8. Extracción de metabolitos

  1. A los metabolitos mantenidos en hielo seco o almacenados a -80 °C del tubo a partir de la etapa 6.7, añádase lo siguiente: 1) 2 ml de cloroformo almacenado a -20 °C; 2) 1 ml de metanol almacenado a -20 °C; 3) 1 ml de agua nano-pura helada; y 4) 200 μL de perlas de vidrio lavadas con ácido de 425-600 μm.
  2. Cubra y cierre la boca de un tubo con papel de aluminio. Coloque los tubos en un kit de soporte de tubo de espuma con retenedor y vórtice durante 30 minutos a velocidad media (es decir, a una velocidad que se establece en 6, siendo 12 la velocidad máxima de un vórtice) a 4 ° C para facilitar la extracción de metabolitos.
  3. Incubar el tubo durante 15 minutos en hielo (¡NO hielo seco!) para promover la precipitación de proteínas y la separación de la fase orgánica superior de la inferior.
  4. Centrifugar el tubo en una centrífuga clínica a 3.000 x g durante 10 min a 4 °C. Este paso de centrifugación permite separar la fase acuosa superior (que contiene metabolitos solubles en agua) de la capa media (que contiene restos celulares y proteínas) y de la fase orgánica inferior (que contiene principalmente lípidos).
  5. Utilice una micropipeta para transferir la fase acuosa superior (400 μL) a un tubo lavado y etiquetado de 1,5 ml que contenga 800 μL de ACN que se almacenó a -20 °C.
    NOTA: Habrá precipitación de nubes blancas después de agregar la fase acuosa superior a ACN mantenida a -20 ° C.
  6. Centrifugar el tubo con la muestra en una centrífuga de mesa a 13.400 x g durante 10 min a 4 °C.
    NOTA: La precipitación de nubes blancas desaparecerá después de la centrifugación.
  7. Transfiera 800 μL de la porción superior de un líquido en el tubo a un vial de EM etiquetado. Conservar la muestra a 0 °C hasta que sea analizada por LC-MS/MS.

9. Preparación de reactivos, artículos de laboratorio y equipos para LC

  1. Prepare lo siguiente: 1) un vórtice; 2) un sonicador ultrasónico; 3) viales de vidrio MS; 4) un sistema LC equipado con una bomba binaria, desgasificador y muestreador automático; 5) una columna de cromatografía en fase zwitteriónica (polímero de 5 μm, 150 x 2,1 mm) nombrada en la Tabla de Materiales; 6) un calentador de columna; y 7) fases móviles, incluyendo la fase A (5:95 ACN:agua (v/v) con 20 mM de acetato de amonio, pH = 8,0) y la fase B (100% ACN).

10. Separación de metabolitos extraídos por LC

  1. Sometá el contenido del vial de EM a sonicación ultrasónica durante 15 min.
  2. Vórtice el vial de MS 3x durante 10 segundos a temperatura ambiente (RT).
  3. Coloque el vial de EM en la placa del pozo.
  4. Durante el cromatógrafo, mantenga la columna a 45 °C y un caudal de 0,250 ml/min. Mantenga la muestra en la placa del pozo a 0 °C. Consulte la Tabla 1 para conocer los gradientes lc que deben utilizarse durante la cromatografía.
    NOTA: En la Figura 1se muestra un cromatograma iónico total representativo de metabolitos solubles en agua que se extrajeron de células de la cepa de tipo salvaje BY4742. Los metabolitos separados por LC se identificaron y cuantificaron mediante análisis espectrométrico de masas que se realizó en modo de ionización positiva [ESI (+)], como se describe para el paso 11.

11. Análisis espectrométrico de masas de metabolitos separados por LC

  1. Utilice un espectrómetro de masas equipado con ionización por electrospray calentada (HESI) para la identificación y cuantificación de metabolitos solubles en agua que fueron separados por LC. Utilice el analizador del espectrómetro de masas para los iones MS1 y el detector del espectrómetro de masas para los iones MS2. Utilice la configuración proporcionada en la Tabla 2 y la Tabla 3 para la adquisición dependiente de datos de iones MS1 y MS2, respectivamente.
  2. Utilice un volumen de muestra de 10 μL para la inyección en los modos ESI (+) y ESI (-).

12. Identificación y cuantificación de diferentes metabolitos mediante el tratamiento de datos brutos de LC-MS/MS

  1. Utilice el software nombrado en la Tabla de materiales para llevar a cabo la identificación y cuantificación de diferentes metabolitos solubles en agua a partir de archivos LC-MS/MS sin procesar. Este software utiliza MS1 para la cuantificación de metabolitos y MS2 para la identificación de metabolitos. El software explota la biblioteca de fragmentación espectral de masas más ampliamente seleccionada para anotar los metabolitos utilizando los datos brutos LC-MS / MS haciendo coincidir los espectros MS. Este software también utiliza la masa exacta de MS1 y la coincidencia de patrones de isótopos para anotar metabolitos utilizando bases de datos en línea. Consulte la Figura 2 para obtener más información.
  2. Utilice la biblioteca de bases de datos y espectros, que está disponible gratuitamente en línea (https://www.mzcloud.org), para buscar espectros MS2 de los datos sin procesar.

13. Ensayo de integridad de membrana mediante tinción de yoduro de propidio (PI) y microscopía de fluorescencia

  1. Después de que el enfriamiento de celdas se realice como se describe para el paso 6, lave bien las celdas apagadas con 15 ml de búfer ABC para eliminar la solución de enfriamiento. Recoger las células por centrifugación a 3.000 x g durante 5 min a 0 °C.
  2. Resuspónda el pellet celular en 1 ml de tampón ABC y agregue 0,5 ml de la solución PI (0,5 mg /ml).
  3. Vórtice un tubo con la muestra 3x durante 10 s e incube durante 10 min en la oscuridad y en hielo.
  4. Centrifugar el tubo con la muestra en una centrífuga de mesa a 13.400 x g durante 10 min a 4 °C.
  5. Retire el sobrenadante y vuelva a colocar el pellet en 1 ml de tampón ABC.
  6. Centrifugar el tubo a 13.400 x g durante 10 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. Repita este paso 2 veces más para quitar el PI unido a la superficie celular.
  7. Resuspend el pellet en 300 μL de tampón ABC. Coloque 10 μL de la suspensión en la superficie de un portaobjetos de microscopio.
  8. Capture las imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC) y microscopía de fluorescencia con un microscopio de fluorescencia. Utilice un filtro configurado en las longitudes de onda de excitación y emisión de 593 nm y 636 nm (respectivamente).
  9. Utilice un software para contar el número total de células (en el modo DIC) y el número de células teñidas fluorescentemente. Además, utilice este software para determinar la intensidad de la tinción para células individuales.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Para mejorar una evaluación cuantitativa de los metabolitos solubles en agua dentro de una célula de levadura, optimizamos las condiciones de enfriamiento celular para la detección de metabolitos. El enfriamiento celular para este propósito implica una detención rápida de todas las reacciones enzimáticas dentro de una célula31,33,37,38. Tal detención de la actividad metabólica celular es un paso esencial de cualquier método para la cuantificación de metabolitos solubles en agua in vivo porque evita la subestimación de sus concentraciones intracelulares31,33,37,38. El enfriamiento celular para la evaluación de metabolitos siempre afecta la integridad de la membrana plasmática (PM) (y de la pared celular (CW), si está presente); esto causa fuga de metabolitos de la célula31,33,37,38. El método emplea condiciones de enfriamiento celular que minimizan dicho deterioro, disminuyendo así significativamente la fuga celular asociada al enfriamiento de metabolitos intracelulares. De hecho, la mayoría de los métodos actuales para el enfriamiento celular implican el uso de una cierta concentración de metanol (es decir, 40% (v/v), 60% (v/v), 80% (v/v) o 100% (v/v)) a temperatura específica (es decir, -20 °C, -40 °C o -60 °C), con o sin un tampón31,33,37,38. Se comparó la eficiencia del deterioro de PM y CW para uno de los métodos de enfriamiento celular utilizados actualmente (es decir, mediante tratamiento celular con metanol al 80% (v/v) a -40 °C en ausencia de un tampón38) con la del método de enfriamiento celular modificado (es decir, mediante tratamiento celular con metanol al 60% (v/v) a -20 °C en presencia de una solución tamponada isotónica de ABC a pH = 8,0). PI es un colorante fluorescente que es impermeable a las células intactas; sólo puede entrar en la célula si la integridad del PM (y del CW, si está presente) se ve afectada39. Además, la intensidad de la emisión de fluorescencia por PI aumenta 30 veces cuando se une al ADN o ARN39. Por lo tanto, un ensayo de tinción de PI se puede utilizar para evaluar la eficiencia de la fuga celular asociada al enfriamiento de metabolitos intracelulares porque estos metabolitos pueden filtrarse en el espacio extracelular solo si el PM y el CW de una célula de levadura están dañados39. Encontramos que el método de enfriamiento celular modificado causa un daño significativamente menor al PM y CW que el método de enfriamiento por tratamiento celular con metanol no tamponado al 80% (v/v) a -40 °C(Figura 3). De hecho, casi todas las células sometidas a enfriamiento utilizando el método exhibieron emisión de fluorescencia roja, que es característica de las células de levadura cuyo PM y CW no están dañados(Figura 3). En contraste, casi todas las células sometidas a enfriamiento utilizando el otro método, mostraron emisión de fluorescencia verde característica de las células de levadura cuyas PM y CW están significativamente dañadas (Figura 3). La fluorescencia roja más intensa se convirtió en fluorescencia verde mediante un software para diferenciar entre la fluorescencia roja fuerte y las emisiones de fluorescencia roja leve.

El método de enfriamiento celular modificado causó una fuga significativamente menor de metabolitos solubles en agua de las células de levadura que el método de enfriamiento mediante tratamiento celular con metanol no tamponado al 80% (v / v) a -40 ° C. Sometimos igual número de células de levadura a enfriamiento utilizando cualquiera de los métodos (es decir, mediante tratamiento celular con metanol al 60% (v/v) a -20 °C en presencia de una solución tamponada isotónica de ABC a pH = 8.0; Figura 4) o el otro método (es decir, mediante tratamiento celular con metanol no tamponado al 80% (v/v) a -40 °C; Figura 5). El grado de fuga celular asociada al enfriamiento en la solución extracelular se evaluó para metabolitos específicos solubles en agua con la ayuda de LC-MS / MS. Las concentraciones de diferentes clases de aminoácidos (es decir, aminoácidos ácidos grandes y pequeños, básicos, neutros-no polares y polares neutros) en la solución extracelular se midieron antes y después del enfriamiento celular. Encontramos que el método de enfriamiento celular causa una fuga significativamente menor de todas estas clases de aminoácidos en la solución extracelular (Figura 4) que el otro método (Figura 5).

El método LC-MS/MS para una evaluación cuantitativa de metabolitos solubles en agua dentro de una célula de levadura utiliza un solo tipo de columna para la separación cromatográfica de todas las clases de metabolitos solubles en agua. Esta columna es la columna de fase zwitteriónica nombrada en la Tabla de Materiales. Encontramos que esta columna proporciona una separación mucho más eficiente de diferentes clases de metabolitos solubles en agua que la columna de fase inversa nombrada en la Tabla de Materiales (Tabla Suplementaria 1). De hecho, los valores de desplazamiento del tiempo de retención (RT) de los estándares de metabolitos solubles en agua (es decir, NAD +, AMP, GMP, arginina y ácido glutámico) fueron significativamente más bajos y las formas de pico fueron sustancialmente más agudas para la columna de fase zwitteriónica, en comparación con la columna de fase inversa(Tabla suplementaria 1). Las condiciones de LC utilizadas para la separación cromatográfica de todos los metabolitos (es decir, solubles en agua e insolubles en agua) para la columna de fase inversa se proporcionan en la Tabla suplementaria 2.

Otra ventaja del método LC-MS / MS consiste en la capacidad de separación cromatográfica en la columna de fase zwitteriónica anterior para separar eficientemente entre sí diferentes metabolitos solubles en agua con diversas propiedades estructurales, físicas y químicas. Estos metabolitos solubles en agua incluyen las siguientes clases de metabolitos: 1) aminoácidos polares ácidos, básicos, polares neutros y no neutros, incluidos sus diferentes isómeros estructurales(Figura 6); 2) nucleótidos estables e inestables y sus derivados que realizan funciones vitales dentro de una célula(Figura 7); y 3) varios monosacáridos, incluyendo sus diferentes formas estereoisoméricas (Figura 8).

Es importante destacar que el método LC-MS/MS para una evaluación cuantitativa de metabolitos solubles en agua dentro de una célula de levadura fue versátil y robusto. Nos permitió identificar y cuantificar 374 metabolitos solubles en agua con diversas propiedades estructurales, físicas y químicas en células de S. cerevisiae que fueron cultivadas en el medio YP completo que inicialmente contenía 2% de glucosa(Tabla suplementaria 3). Se detectaron 240 metabolitos en el modo de ionización positiva y 134 metabolitos en el modo de ionización negativa. Las identidades de todos estos metabolitos solubles en agua se confirmaron haciendo coincidir sus fragmentos MS2 de adquisición dependiente de datos (DDA) adquiridos tanto en los modos de ionización positiva como negativa con la biblioteca espectral MS2 mzCloud. Esta biblioteca en línea incluye los espectros de los estándares de metabolitos que difieren en sus parámetros MS1 y DDA MS2. Para maximizar el grado de coincidencia de los espectros MS2 de la muestra con la biblioteca espectral en línea, utilizamos diferentes parámetros DDA MS2. Estos parámetros se proporcionan en la Tabla Suplementaria 4. Se adquirieron casi 6.000 características (metabolitos putativos) para la misma muestra con la ayuda del método de fragmentación de disociación por colisión inducida por alta energía (HCD) o disociación inducida por colisión (CID), utilizando los 5 eventos principales de MS2, 35 valores de energía de colisión y tiempos de activación de 10 ms. Después de filtrar los archivos resultantes con > 95% de coincidencia de MS2 y > 90% de criterios de coincidencia de patrones isotópicos de MS1, solo se identificaron 162 metabolitos en condición fragmentada de HCD y 142 metabolitos en condición fragmentada de CID. 81 de los 162 metabolitos eran exclusivos del método de fragmentación de HCD, mientras que 42 de 142 eran exclusivos del método de fragmentación de CID (ver una hoja llamada "T5_35E__10 ms_HCD vs CID" en la Tabla Suplementaria 4). Por lo tanto, concluimos que la anotación correcta de metabolitos solubles en agua con la ayuda del método LC-MS/MS requiere el uso de muchos parámetros diferentes de DDA MS2.

El método LC-MS/MS también es altamente sensible. Permite identificar y cuantificar algunos metabolitos solubles en agua a concentraciones tan bajas como 0,05 pmol/μL (ver datos para fenilalanina en la Tabla 4). Este límite de cuantificación varía dentro de un amplio rango de concentraciones para diferentes clases de metabolitos (Tabla 4).

El sistema MS utilizado aquí tiene un amplio (al menos dos órdenes de magnitud) rango dinámico lineal para medir las concentraciones de varios metabolitos(Tabla suplementaria 5).

Figure 1
Figura 1: Cromatograma iónico total (TIC) a partir de datos de cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC-MS) de metabolitos solubles en agua que se extrajeron de células de la cepa de tipo salvaje BY4742. Los metabolitos fueron separados por LC en la columna de cromatografía en fase zwitteriónica nombrada en la Tabla de Materiales. Los metabolitos fueron detectados por MS de iones padres (MS1) que se crearon utilizando el modo de ionización electrospray positiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Un flujo de trabajo utilizado para el análisis de metabolitos solubles en agua con la ayuda del software nombrado en la Tabla de Materiales. Todos los parámetros fueron autocorregidos por el software basado en los datos brutos de MS, excepto los siguientes: 1) pestaña "Detectar compuestos": establecer min, intensidad máxima 10,000; y 2) pestaña "Search ChemSpider": se seleccionaron 4 bases de datos en línea para la identificación de metabolitos, incluyendo BioCyc, Human Metabolome Database, KEGG y Yeast Metabolome Database. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3:Imágenes microscópicas de contraste de interferencia diferencial (DIC; fila superior) y fluorescencia (fila inferior) de células de levadura apagadas con tampón de bicarbonato de amonio (ABC) (pH = 8.0; control) o con una solución de enfriamiento diferente. Después del enfriamiento celular, se incubó un número igual de células con la solución PI durante 10 minutos en la oscuridad y en hielo. La fluorescencia roja más intensa se convirtió en fluorescencia verde mediante software para diferenciar entre la fluorescencia roja fuerte y las emisiones de fluorescencia roja leve. Se comparó la eficiencia del daño al PM y al CW para el método de enfriamiento celular (es decir, mediante tratamiento celular con metanol al 60% (v/v) a -20 °C en presencia de una solución tamponada isotónica de ABC a pH = 8,0) y uno de los métodos utilizados actualmente (es decir, mediante tratamiento celular con metanol al 80% (v/v) a -40 °C en ausencia de un tampón). Se muestra una barra de escala. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: El porcentaje de fuga de diferentes clases de aminoácidos para el método de enfriamiento celular. 5.0 x 108 de las células de levadura fueron sometidas a enfriamiento por el tratamiento con 60% (v/v) de metanol a -20 °C en presencia de una solución tamponada isotónica de ABC a pH = 8.0. El porcentaje de fugas de diferentes clases de aminoácidos se evaluó utilizando LC-MS/MS para medir sus concentraciones en la solución extracelular antes y después del enfriamiento. Se muestran los valores medios ± SD y los puntos de datos individuales (n = 3). * p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: El porcentaje de fuga de diferentes clases de aminoácidos para uno de los métodos de enfriamiento celular utilizados actualmente. 5,0 x 108 de las células de levadura fueron sometidas a enfriamiento por el tratamiento con 80% (v/v) de metanol a -40 °C en ausencia de un tampón. El porcentaje de fugas de diferentes clases de aminoácidos se evaluó utilizando LC-MS/MS para medir sus concentraciones en la solución extracelular antes y después del enfriamiento. Se muestran los valores medios ± SD y los puntos de datos individuales (n = 3). * p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Separación cromatográfica eficiente de las clases de aminoácidos polares ácidos, básicos, polares neutros y no neutros, incluidos dos isómeros estructurales (es decir, leucina e isoleucina), en la columna de fase zwitteriónica nombrada en la Tabla de Materiales. Todos estos aminoácidos fueron detectados por MS/MS en el modo de ionización positiva [ESI (+)]. Las condiciones para la LC en la columna de cromatografía en fase zwitteriónica se describen en la Tabla 1. Las condiciones para la EM/EM se describen en la Tabla 2 y en la Tabla 3. Todos los estándares de aminoácidos se compran comercialmente (por ejemplo, Sigma). Los cambios de tiempo de retención entre 3 tiradas de cromatografía independientes son inferiores a ± 10 segundos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Separación cromatográfica eficiente de diferentes clases de nucleótidos, incluidos nucleótidos energéticamente inestables (monofosfatos de nucleósidos, difosfatos de nucleósidos y trifosfatos de nucleósidos) y moléculas transportadoras de electrones (NADH y NAD +), en la columna de fase zwitteriónicanombrada en la Tabla de Materiales. Todos estos nucleótidos fueron detectados por MS/MS en el modo de ionización positiva [ESI (+)]. Las condiciones para la LC en la columna de cromatografía en fase zwitteriónica se describen en la Tabla 1. Las condiciones para la EM/EM se describen en la Tabla 2 y en la Tabla 3. Todos los estándares de nucleótidos se compran comercialmente (por ejemplo, Sigma). Los cambios de tiempo de retención entre 3 tiradas de cromatografía independientes son inferiores a ± 10 segundos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Separación cromatográfica eficiente de diferentes clases de monosacáridos, incluidos isómeros estructurales y formas estereoisoméricas de aldo- y cetohexosas (fructosa, manosa y galactosa) y aldopentosis (ribosa y arabinosa), en la columna de fase zwitteriónicanombrada en la Tabla de Materiales. Todos estos monosacáridos fueron detectados por MS/MS en el modo de ionización positiva [ESI (+)]. Las condiciones para la LC en la columna de cromatografía en fase zwitteriónica se describen en la Tabla 1. Las condiciones para la EM/EM se describen en la Tabla 2 y en la Tabla 3. Todos los estándares de monosacáridos se compran comercialmente (por ejemplo, Sigma). Los cambios de tiempo de retención entre 3 tiradas de cromatografía independientes son inferiores a ± 10 segundos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tipo de columna Polímero SeQuant ZIC-pHILIC 5μm 150 x 2,1 mm
Disolvente A LC-MS grado H2O: ACN (95:5, v/v) 20 mM Acetato de amonio
Disolvente B Acetonitrilo de grado LC-MS (ACN)
Límite de presión Máximo = 300 bar Mínimo = 0
Programa de gradiente HPLC
Tiempo (minutos) Caudal (0,25 ml/min) Composiciones
A% B%
0.5 0.25 5 95
26 0.25 40 60
30 0.25 70 30
31 0.25 70 30
31.1 0.4 5 95
43.9 0.4 5 95
44 0.25 5 95
45 0.25 5 95

Tabla 1: Condición LC utilizada para la separación de metabolitos solubles en agua con la ayuda de la columna de fase zwitteriónicanombrada en la Tabla deMateriales. Estas condiciones se utilizaron en todos los experimentos descritos aquí.

Rango de masa de escaneo completo (Dalton) 70-900
Resolución de escaneo completa FTMS (orbitrap analyzer) 6,0 x 104
Resolución HCD FTMS (Orbitrap analyzer) 7500
Objetivo AGC de escaneo completo de FTMS 1,0 x 106
Objetivo FTMS MSn AGC 5,0 x 104
Objetivo de captura de iones (LTQ) MSn AGC 1,0 x 104
Tipo de fuente de iones Ionización por electrospray calentada
Temperatura capilar (°C) 275
Temperatura del calentador de la fuente (°C) 250
Flujo de gas de la hera 10
Flujo de gas auxiliar 5

Tabla 2: La configuración del espectrómetro de masas utilizada para analizar los metabolitos que fueron separados por LC. Estas condiciones se utilizaron para el análisis de metabolitos en todos los experimentos descritos aquí. Abreviaturas: FTMS = transformada de Fourier (FTMS); HCD = alta energía inducida por colisión-disociación; LTQ = cuadrupolo de trampa lineal; AGC = control automático de ganancia, un valor de población iónica para MS y MS/MS.

Polaridad del instrumento Positivo/Negativo
Tipo de activación CID/HCD
Señal mínima requerida 5000
Ancho de aislamiento 2
Energías de colisión normalizadas para CID 35, 60
Energías de colisión normalizadas para HCD 35, 45, 55
Estado de carga predeterminado 1
Tiempo de activación para CID (ms) 10, 30
Tiempo de activación para HCD (ms) 10
Número de eventos de EM/EM en CID Top 3, Top 5, Top 10
Número de eventos de EM/EM en HCD Top 5
Número de microescanas utilizadas tanto en HCD como en CID 1

Tabla 3: La configuración del espectrómetro de masas utilizada para detectar iones secundarios (MS2). Abreviaturas: HCD = alta energía inducida por colisión-disociación; CID = disociación inducida por colisión; ms = milisegundos.

Metabolitos std M.W. (g/mol) [M+H]+1 [M-H]-1 Modo de detección Concentración más baja detectada (pmol/μL)
glicina 75.03203 76.03931 74.02475 P 7.43E+00
triptófano 204.08988 205.09716 203.0826 P 5.56E-02
fenilalanina 165.07898 166.08626 164.0717 P 5.14E-02
arginina 174.11168 175.11896 173.1044 P 7.14E-02
treonina* 119.05824 120.06552 118.05096 P
serina 105.04259 106.04987 104.03531 P 4.66E+00
glutamato 147.05316 148.06044 146.04588 P 4.20E-01
metionina 149.05105 150.05833 148.04377 P 1.96E+00
aspartato 133.03751 134.04479 132.03023 P 3.75E+00
valina 117.07898 118.08626 116.0717 P 1.49E+00
isoleucina 131.09463 132.10191 130.08735 P 1.84E+00
leucina 131.09463 132.10191 130.08735 P 2.26E+00
histidina 155.06948 156.07676 154.0622 P 2.53E+00
tirosina 181.07389 182.08117 180.06661 P 8.72E-02
lisina 146.10553 147.11281 145.09825 P 1.43E-01
alanina 89.04768 90.05496 88.0404 P 1.12E+00
prolina 115.06333 116.07061 114.05605 P 1.05E+00
cisteína 121.01975 122.02703 120.01247 P 8.22E-01
asparagina 132.05349 133.06077 131.04621 P 1.08E+00
glutamina 146.06914 147.07642 145.06186 P 1.92E+00
guanina 151.04941 152.05669 150.04213 P 5.47E+00
guanosina 283.09167 284.09895 282.08439 P 3.67E-01
GMP 363.058 364.06528 362.05072 P 7.17E-01
PIB 443.02434 444.03162 442.01706 P 2.57E+00
GTP 522.99067 523.99795 521.98339 P 2.27E+00
AMPERIO 347.06309 348.07037 346.05581 P 5.25E-01
ADP 427.02942 428.0367 426.02214 P 1.32E+00
ATP 506.99575 508.00303 505.98847 P 1.77E+00
NADH 665.12478 666.13206 664.1175 P 1.47E+00
NAD+ 663.10912 664.1164 662.10184 P 3.03E+00
glucosa** 180.06339 181.07067 179.05611
fructosa*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 5.67E-01
manosa*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 1.05E+00
galactosa*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 9.00E-01
ribosa*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1.10E+00
arabinosa*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1.23E+00
fructosa-6-fosfato*** 260.02972 261.037 259.02244 N 6.60E+00
glucosa-6-fosfato*** 260.02972 261.037 259.02244 N 4.27E+00
ácido cítrico 192,12 g 193.034279 191.019726 N 9.33E-01
ácido málico 134.09 135.0288 133.014247 N 1.23E+00
ácido pirúvico 88.06 89.02332 87.008768 N 2.77E+00

Tabla 4:Las concentraciones más bajas de diferentes estándares de metabolitos solubles en agua que el método LC-MS/MS puede identificar y cuantificar. El área de pico MS1 de cada estándar de metabolito se utilizó para estimar la concentración cuantificable más baja para este metabolito. Se muestran los valores medios de dos experimentos independientes. Se realizaron tres réplicas técnicas para cada uno de los dos experimentos independientes. NOTA: La treonina* se puede detectar pero no se puede cuantificar debido a su co-elución con la homoserina, un isómero químico de la treonina. La glucosa** no se puede identificar porque crea múltiples picos de cromatografía. Las normas de metabolitos*** sólo pueden identificarse y cuantificarse en muestras individuales, pero no en una mezcla de normas de metabolitos o una mezcla biológica de metabolitos.

Tabla suplementaria 1: Valores de desplazamiento de tiempo de retención (RT) del mismo conjunto de metabolitos para las columnas de fase zwitteriónica y fase inversa (ver Tabla de materiales) después del equilibrio de columnas. La tabla compara la reproducibilidad de retención de las columnas de fase zwitteriónica y fase inversa para un conjunto distinto de metabolitos que difieren entre sí en su hidrofilia e hidrofobicidad. Estos metabolitos se identificaron con la ayuda de LC-MS / MS. Tenga en cuenta que los valores de desplazamiento rt de los metabolitos hidrófilos (es decir, NAD +, AMP, GMP, arginina y ácido glutámico) son significativamente más bajos y las formas de pico son sustancialmente más agudas para la columna de fase zwitteriónica, en comparación con la columna de fase inversa. En contraste, los valores de desplazamiento de RT de los metabolitos hidrófobos (es decir, ácido esteárico, ácido láurico y ácido decanoico) son significativamente más bajos y las formas de pico son sustancialmente más agudas para la columna de fase inversa, en comparación con la columna de fase zwitteriónica. Las condiciones para la separación cromatográfica de metabolitos con la ayuda de las columnas de fase zwitteriónica y fase inversa se detallan en la Tabla 1 y la Tabla suplementaria 2,respectivamente. Los valores de desplazamiento de RT informados aquí se basan en la medición de 20 muestras diferentes tomadas de diferentes viales. Las muestras se analizaron después del equilibrio de la columna. Los metabolitos en cada muestra se extrajeron de 5,0 × 108 células de levadura. Los valores de desplazamiento RT son las medias de 20 muestras diferentes (n = 20). Los valores de p derivados de la prueba t no apareada se utilizaron para comparar las dos columnas con la varianza igual entre ambos tipos de muestra. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla suplementaria 2: Condiciones de LC para la columna de fase inversa 8 nombrada en la Tabla de Materiales y utilizada para separar diferentes metabolitos en este estudio. Las propiedades de la columna fueron las siguientes: 150 x 2,1 mm, polímero de 5 μm. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla suplementaria 3: Una lista de los 374 metabolitos solubles en agua recuperados y anotados utilizando el método LC-MS/MS. Todos los metabolitos se recuperaron de la misma ejecución de gradiente LC, se sometieron a un algoritmo de fragmentación de adquisición dependiente de datos (DDA) descrito en la Tabla suplementaria 4y se anotaron utilizando el software nombrado en la Tabla de materiales. Las formas de pico MS1 de 211 metabolitos (cuyo estado en la tabla se indica como un espacio en blanco) eran apropiadas para ser utilizadas para la cuantificación, y sus respectivos espectros MS2 tenían coincidencias completas con la biblioteca espectral mzCloud. Los espectros MS2 de 38 metabolitos (cuyo estado en la tabla se indica como una d) tenían coincidencias completas con la biblioteca espectral en línea. Aún así, sus formas de pico MS1 no eran apropiadas para ser utilizadas para la cuantificación. Los espectros MS2 de 125 metabolitos (cuyo estado en la tabla se indica como n) no tenían coincidencias completas con la biblioteca espectral en línea. Estos metabolitos se anotaron de la siguiente manera: 1) utilizando el "nodo Predecir composición" (que anota metabolitos basados en la coincidencia exacta de los valores de MS1, el número de isótopos emparejados y perdidos, y la intensidad del porcentaje de isótopos coincidentes con la de los estándares de referencia teóricos); 2) utilizando el "nodo ChemSpider" (que anota metabolitos basados en la coincidencia exacta de los valores de MS1 y la puntuación de coincidencia de similitud de los espectros MS2 con la biblioteca espectral en línea); y 3) utilizando los valores de desplazamiento del tiempo de retención (RT) de los metabolitos (estos valores dependen de la estructura física y las propiedades químicas de los metabolitos). Los metabolitos enumerados en la tabla se encontraron en las 3 réplicas biológicas realizadas, con los valores de desplazamiento RT de < 0,2 min. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla suplementaria 4: Un algoritmo de fragmentación de adquisición dependiente de datos (DDA) que se utilizó aquí para la anotación de metabolitos solubles en agua con la ayuda del software nombrado en la Tabla de materiales. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla suplementaria 5: Un rango dinámico lineal típico que observamos cuando medimos las concentraciones de diferentes aminoácidos con la ayuda del sistema MS nombrado en la Tabla de Materiales. El sistema MS utilizado aquí tiene un amplio (al menos dos órdenes de magnitud) rango dinámico lineal para medir las concentraciones de varios metabolitos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Para utilizar con éxito el protocolo descrito aquí, siga las medidas preventivas que se describen a continuación. El cloroformo y el metanol extraen diversas sustancias de los artículos de plástico de laboratorio. Por lo tanto, manejarlos con precaución. Evite el uso de plásticos en pasos que impliquen contacto con cualquiera de estos dos disolventes orgánicos. Use pipetas de vidrio de borosilicato para estos pasos. Levante estas pipetas con cloroformo y metanol antes de su uso. Use solo puntas de micropipeta y tubos hechos de polipropileno que sea resistente a los solventes orgánicos. Durante la preparación de la muestra para LC-MS/MS, elimine todas las burbujas de aire en los viales de vidrio antes de insertarlas en una placa de pozo.

La columna de fase zwitteriónica utilizada aquí requiere un extenso reacondicionamiento después de cada carrera para minimizar el cambio rt. Para el reacondicionamiento de columnas, recomendamos usar un volumen de la solución de reacondicionamiento que sea de aproximadamente 20 volúmenes de la columna. La columna debe volver a acondicionarse con la fase móvil inicial durante 15 minutos a un caudal aumentado de 0,4 ml/min. Para evitar cualquier daño a la columna durante su reacondicionamiento, mantenga la presión de la columna por debajo del límite superior de presión recomendado por el fabricante.

Cabe destacar que algunas columnas de cromatografía de separación mixta que operan en el modo de fase inversa permiten la resolución de metabolitos cargados40,41. Estas columnas de separación mixta se basan en la columna de fase inversa utilizada aquí (ver Tabla de Materiales)y contienen grupos polares incrustados que pueden separar metabolitos basados en la carga40,41.

Aquí, describimos un método basado en LC-MS / MS de metabolómica no dirigida para el análisis cuantitativo de muchos metabolitos solubles en agua extraídos de células de levadura. El método proporciona varias ventajas sobre los métodos LC-MS / MS de metabolómica no dirigida que se utilizan actualmente para este propósito. Estas ventajas incluyen las siguientes. En primer lugar, el método es sensible y permite la identificación y cuantificación de algunos metabolitos solubles en agua a concentraciones tan bajas como 0,05 pmol/μL. La sensibilidad reportada de los métodos LC-MS/MS existentes es menor3,22,27,42. En segundo lugar, el método utiliza un procedimiento de enfriamiento celular que provoca una fuga significativamente menor de metabolitos intracelulares de la célula que la reportada para los procedimientos utilizados actualmente31,33,38. Por lo tanto, el procedimiento que desarrollamos para el enfriamiento celular reduce la medida en que los procedimientos utilizados actualmente subestiman las concentraciones intracelulares de metabolitos solubles en agua. En tercer lugar, a diferencia de los métodos LC-MS/MS existentes2,31,33,el método distingue entre diferentes isómeros estructurales y formas estereoisomóricas de muchos metabolitos. Estos metabolitos incluyen varias moléculas portadoras de energía, nucleótidos, aminoácidos, monosacáridos, intermediarios de la glucólisis e intermedios del ciclo tricarboxílico. En cuarto lugar, utilizamos el método para crear una extensa base de datos espectral de masas de MS1 y MS2 para la correcta identificación y cuantificación de una amplia gama de metabolitos específicos utilizando los datos lc-MS/MS en bruto. En contraste, las bases de datos en línea espectrales de masas existentes de MS1 y MS2 están incompletas43,44,45. En quinto lugar, el método utiliza un solo tipo de extracción de metabolitos para recuperar metabolitos solubles en agua con diversas propiedades estructurales, físicas y químicas. La diversidad de estos metabolitos excede significativamente la de los métodos alternativos para una extracción de un solo paso de metabolitos solubles en agua de células de levadura3,22,27,46. Seis, a diferencia de los métodos EXISTENTES LC-MS/MS3,22,47,48, el método utiliza un solo tipo de columna LC para separar entre sí varias clases estructurales y funcionales de metabolitos solubles en agua. Siete, el método permite la identificación y cuantificación de más de 370 metabolitos solubles en agua extraídos de células de levadura. Este número de metabolitos identificables y cuantificables excede el número de metabolitos reportados para otros métodos de metabolómica no dirigida en levaduras3,22,27,49,50.

El método tiene varias limitaciones. Estas limitaciones son las siguientes. La columna de fase zwitteriónica utilizada para la separación de metabolitos por LC requiere un amplio reacondicionamiento después de cada carrera. Además, el método es eficiente solo para la metabolómica no dirigida de metabolitos hidrofílicos solubles en agua. Además, las diferentes formas isoméricas de carbohidratos (incluidos los isómeros de fructosa, glucosa y galactosa) no se pueden cuantificar con la ayuda del método. Esto se debe a que la columna de fase zwitteriónica utilizada en el método no puede separar estos isómeros de carbohidratos entre sí cuando están presentes en una mezcla con otros metabolitos. Además, el método no se puede explotar para identificar la glucosa porque este carbohidrato crea múltiples picos durante la cromatografía en la columna de fase zwitteriónica utilizada en el método. Finalmente, la treonina no se puede cuantificar con la ayuda del método debido a la co-elución de este aminoácido con su isómero homoserina durante la separación de metabolitos por cromatografía.

Utilizamos este método LC-MS/MS para estudiar los cambios asociados al envejecimiento en el metaboloma soluble en agua de la levadura en ciernes S. cerevisiae. También empleamos este método para investigar cuántas intervenciones genéticas, dietéticas y farmacológicas que retrasan el envejecimiento afectan el metaboloma soluble en agua de las células de levadura durante su envejecimiento cronológico. Debido a su versatilidad, robustez y sensibilidad, el método LC-MS/MS se puede utilizar con éxito para la evaluación cuantitativa de los metabolomas solubles en agua en organismos eucariotas evolutivamente distantes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgments

Agradecemos a los miembros actuales y anteriores del laboratorio Titorenko por las discusiones. Reconocemos al Centro de Aplicaciones Biológicas de espectrometría de masas, al Centro de Genómica Estructural y Funcional y al Centro de Microscopía e Imágenes Celulares (todos en la Universidad de Concordia) por sus excelentes servicios. Este estudio fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería (NSERC) de Canadá (RGPIN 2014-04482 y CRDPJ 515900 - 17). K.M. fue apoyado por la Beca Armand C. Archambault de la Universidad de Concordia y el Premio a la Excelencia del Decano de Artes y Ciencias de la Universidad de Concordia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acetonitrile Fisher Scientific A9554
Ammonium acetate Fisher Scientific A11450
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Bactopeptone Fisher Scientific BP1420-2
Chloroform Fisher Scientific C297-4
Glucose Fisher Scientific D16-10
L-histidine Sigma H8125
L-leucine Sigma L8912
L-lysine Sigma L5501
Methanol Fisher Scientific A4564
Methanol Fisher Scientific A4564
Propidium iodide Thermo Scientific R37108
Uracil Sigma U0750
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottles Beckman 355664
Agilent 1100 series LC system Agilent Technologies G1312A
Beckman Coulter Centrifuge Beckman 6254249
Beckman Coulter Centrifuge Rotor Beckman JA-10
Centra CL2 clinical centrifuge Thermo Scientific 004260F
Digital thermometer Omega HH509
Foam Tube Holder Kit with Retainer Thermo Scientific 02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) Sigma Milipore 150460
Thermo Orbitrap Velos MS Fisher Scientific ETD-10600
Ultrasonic sonicator Fisher Scientific 15337416
Vortex Fisher Scientific 2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm Agilent Technologies 883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps Fisher Scientific 60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) Sigma-Aldrich G8772
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps PYREX 05-550
Software
Compound Discoverer 3.1 Fisher Scientific V3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742 Dharmacon YSC1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786 (2016).
  2. Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
  3. Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
  4. López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
  5. Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
  6. Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
  7. Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
  8. Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
  9. Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive 'hunger factor' linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
  10. Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
  11. Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
  12. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
  13. Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973 (2020).
  14. Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
  15. Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
  16. Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
  17. Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
  18. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  19. Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
  20. Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  21. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020 (2018).
  22. Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046 (2019).
  23. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
  24. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  25. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  26. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
  27. Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  28. Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588 (2015).
  29. Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
  30. Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
  31. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  32. Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148 (2017).
  33. Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
  34. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  35. Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308 (2019).
  36. Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301 (2019).
  37. Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
  38. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
  39. Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
  40. Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
  41. Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122 (2018).
  42. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
  43. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  44. Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3 (2018).
  45. Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251 (2019).
  46. Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
  47. Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
  48. Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
  49. Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
  50. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).

Tags

Bioquímica Número 167 metabolitos solubles en agua perfiles metabolómicos enfriamiento de la actividad metabólica tinción de yoduro de propidio microscopía de fluorescencia extracción de metabolitos moléculas transportadoras de energía nucleótidos aminoácidos monosacáridos cromatografía líquida espectrometría de masas
Metabolómica cuantitativa de <em>Saccharomyces cerevisiae</em> mediante cromatografía líquida combinada con espectrometría de masas en tándem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko,… More

Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko, V. I. Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (167), e62061, doi:10.3791/62061 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter