Summary
פרוטוקול זה מפרט חקירה של האינטראקציות המוקדמות בין תאי אפיתל האף נגועים ויראלית והפעלת תאים מולדים. ניתן להבחין בין תת-קבוצות בודדות של תאי מערכת החיסון בהתבסס על הפעלתם בתגובה לזיהומים ויראליים. לאחר מכן הם יכולים להיחקר עוד יותר כדי לקבוע את השפעתם על תגובות אנטי ויראליות מוקדמות.
Abstract
האינטראקציות המוקדמות בין שכבת האפיתל באף לבין תאי החיסון המולדים במהלך זיהומים ויראליים נותרות אזור שלא נחקר. המשמעות של איתות חסינות מולדת בזיהומים ויראליים גדלה באופן משמעותי כמו חולים עם זיהומים בדרכי הנשימה המציגים הפעלה גבוהה של תאי T מולד להראות תוצאה טובה יותר של המחלה. לפיכך, ניתוח אינטראקציות חיסוניות מולדות מוקדמות אלה מאפשר הבהרה של התהליכים השולטים בהם ועשוי להקל על פיתוח מטרות טיפוליות פוטנציאליות ואסטרטגיות לשיכוך או אפילו למניעת התקדמות מוקדמת של זיהומים ויראליים. פרוטוקול זה מפרט מודל רב-תכליתי שניתן להשתמש בו כדי לחקור שיחות צולבות מוקדמות, אינטראקציות והפעלה של תאי חיסון מולדים מגורמים המופרשים על ידי תאי אפיתל נגועים בדרכי הנשימה. באמצעות נגיף שפעת H3N2 (A/Aichi/2/1968) כמודל הנגיף המייצג, הפעלה מולדת של תאים מונו-גרעיניים של דם היקפי בתרבית משותפת (PBMCs) נותחה באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לחקור את תת-קבוצות התאים המופעלים על ידי הגורמים המסיסים המשתחררים מהאפיתל בתגובה לזיהום הנגיפי. התוצאות ממחישות את אסטרטגיית ההצטיידות להבחנה בין תת-קבוצות התאים וחושפות את ההבדלים הברורים בין האוכלוסיות הפעילות של PBMCs לבין השיחה הצולבת שלהם עם האפיתל הנגוע והבקרה. לאחר מכן ניתן לנתח עוד יותר את קבוצות המשנה המופעלות כדי לקבוע את תפקודן, כמו גם שינויים מולקולריים ספציפיים לתאים. ממצאים מחקירה צולבת כזו עשויים לחשוף גורמים החשובים להפעלת אוכלוסיות תאים מולדות חיוניות, המועילות לשליטה ודיכוי התקדמות הזיהום הנגיפי. יתר על כן, גורמים אלה יכולים להיות מיושמים באופן אוניברסלי על מחלות ויראליות שונות, במיוחד על וירוסים חדשים המתעוררים, כדי לדכא את ההשפעה של וירוסים כאלה כאשר הם מסתובבים לראשונה באוכלוסיות אנושיות תמימות.
Introduction
וירוסים נשימתיים הם אולי בין הפתוגנים הנפוצים ביותר הגורמים לנטל בריאותי וכלכלי חמור. מההתפרצויות הגלובליות התקופתיות של זני מגיפה מתפתחים (למשל, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) ועד לזנים העונתיים של שפעת מדי שנה, וירוסים מהווים איום מתמיד על בריאות הציבור. למרות שחיסונים מהווים את עיקר התגובה לאתגרים גלובליים אלה של בריאות הציבור, זה מפוכח לציין כי אמצעי נגד אלה הם רק מגיבים 1,2. יתר על כן, עיכוב בין הופעתו של זן זיהומי חדש לבין הפיתוח המוצלח של החיסון שלו הוא בלתי נמנע3, מה שמוביל לתקופה שבה האמצעים הזמינים לריסון התפשטות הנגיף מוגבלים מאוד.
עיכובים אלה מודגשים עוד יותר על ידי העלויות הנגרמות על החברה-כלכלית והחברתית. השפעת העונתית לבדה אחראית לכ-8 מיליארד דולר בעלויות עקיפות, 3.2 מיליארד דולר בהוצאות רפואיות ו-36.3 אלף מקרי מוות בארצות הברית מדי שנה4. זאת לפני התחשבות בעלויות המחקר הדרושות למימון פיתוח חיסון. התפרצויות מגיפה יש השפעות חמורות עוד יותר על החברה, יחד עם הקצב הגובר של הגלובליזציה מדי שנה, כפי שמעידים השיבושים הגלובליים הנגרמים על ידי הופעתה והתפשטות מהירה של תסמונת נשימה חריפה חמורה coronovirus 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.
מחקרים אחרונים הראו כי חולים נגועים שיש להם אוכלוסייה גדולה יותר של תאי T מולדים מופעלים נוטים להיות תוצאה טובה יותרשל המחלה 8,9,10. יתר על כן, אוכלוסיית תאי ה- T המולדת מסווגת לתת-קבוצות מרובות: תאי T (MAIT) הקשורים לריבית, תאי Vδ1 γδ T, תאי Vδ2 γδ T ותאי T הרוצח הטבעי (NKT). תת-קבוצות אלה של תאי T מולדים מציגות גם הטרוגניות בתוך האוכלוסיות שלהם, מה שמגביר את המורכבות של האינטראקציות בין אוכלוסיות התאים המעורבות בתגובה החיסונית המולדת11. לפיכך, המנגנון המפעיל תאי T מולדים אלה והידע של תת-קבוצות ספציפיות של תאי T מולדים עשוי לספק שדרה אחרת של מחקר כדי לצמצם את ההשפעות הזיהומיות של וירוסים אלה על הפונדקאי האנושי, במיוחד בתקופה של פיתוח החיסון.
תאי אפיתל נגועים בשפעת לייצר גורמים המפעילים תאי T מולדים במהירות 12,13,14. בהתבסס על ממצא זה, מודל תרבות משותף זה של ממשק אוויר-נוזלי (ALI) ללא מגע שואף לחקות את האינטראקציות הכימיות המוקדמות (בתיווך גורמים מסיסים שפורסמו על ידי שכבת האפיתל הנגועה) בין שכבת אפיתל האף הנגועה לבין ה- PBMCs במהלך ההדבקה המוקדמת. ההפרדה הפיזית בין שכבת האפיתל באף (בתרבית על תוספות ממברנה) לבין ה- PBMCs (בתא שמתחת) ושלמות האפיתל מונעים זיהום ישיר של ה- PBMCs על ידי הנגיף, ומאפשרים מחקר מפורט של ההשפעות של גורמי מסיסים שמקורם באפיתל על ה- PBMCs. לכן ניתן לחקור עוד יותר את הגורמים המזוהים על הפוטנציאל הטיפולי שלהם בגרימת אוכלוסיית תאי ה- T המולדת המתאימה שעשויה להגן מפני זיהום שפעת. מאמר זה פירט אפוא את השיטות של הקמת תרבות משותפת לחקר הפעלה מולדת של תאי T מגורמים מסיסים שמקורם באפיתל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: עיין בטבלה 1 לקבלת מתכונים של מדיה המשמשת בפרוטוקול זה.
הערה: hNECS גדל על טרנסוול 12-well נמצאו לגדול לתוך עובי אופטימלי יותר עבור גורמים מסיסים להגיע לתא הבסיס בקלות כאשר נגועים בנגיף שפעת. לפיכך מומלץ להשתמש בטרנסוול בגודל 12 היטב לתרבות משותפת.
1. הקמת שכבת המזין 3T3
- הקמה ממניות קפואות
- להפשיר cryovial של NIH / 3T3 פיברובלסטים ממניות קפואות. הוסף את התוכן של cryovial ל 2 מ"ל של מדיה חיונית מינימלית מלאה של Dulbecco (DMEM) ו resuspend התאים.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 × גרם וטמפרטורת החדר / לחץ (RTP), ולהסיר את supernatant. הזן מחדש את התאים ב- DMEM מלא.
- ספור את התאים באמצעות כתמים כחולים טריפאן. הוסף 10 μL של כחול טריפאן ל 10 μL של ההשעיה התא resuspended. מערבבים היטב, ומוסיפים 10 μL של ההשעיה להמוציטומטר כדי לספור את התאים.
- תאי זרעים בצפיפות של 1 × 104 תאים / ס"מ2 בצלחת תרבית מתאימה (למשל, בקבוקון T75). דגירה בקבוקון התרבות וכתוצאה מכך במשך 3 ימים ב 37 °C (5 ° F) באווירה של 5% CO2 .
- טיפול במיטומיצין C
- ב 3 ימים, להבטיח את המפגש הוא 60%-80%, להסיר את המדיום, ולשטוף את התאים עם 1x תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS).
הערה: חשוב ששכבה המזין 3T3 לא תגיע למפגש מלא; אחרת, הטיפול במיטומיצין C לא יהיה יעיל. - הוסיפו לבקבוקון את ה-DMEM המלא בתוספת mitomycin C, ודגרו ל-3.5 שעות בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה של 5% CO2 . הסר את המדיום המכיל mitomycin C, ולשטוף את התאים 2x עם 1x PBS.
- ב 3 ימים, להבטיח את המפגש הוא 60%-80%, להסיר את המדיום, ולשטוף את התאים עם 1x תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS).
- זריעת תאי 3T3 בלוחות של 6 בארות
- הוסף 3 מ"ל של 1x טריפסין-EDTA לבקבוק במשך 3-5 דקות כדי לנתק את התאים. לאסוף את התאים מנותקים בצינור 15 מ"ל טרי. צנטריפוגה צינור 15 מ"ל במשך 5 דקות ב 300 × גרם, RTP; זרוק את הסופר-נרטיב. הזן מחדש את התאים ב- DMEM מלא.
- ספור את התאים באמצעות כתמים כחולים טריפאן. זרע את התאים בצלחת 6-well ב 7.5 × 10 5-2.5 × 106 תאים / טוב. לדגור על הצלחת לילה ב 37 °C (5° פרנהייט) באטמוספירה 5% CO2.
הערה: שכבת המזין 3T3 נחשבת מוכנה אם התאים בריאים. בשלב זה, זרעו את תאי הגבעול/האבות של אפיתל האף האנושי (hNESPCs) על שכבת המזין להתרחבות. - הוסף DMEM מלא לבקבוק ודגרה ב 37°C, 5% CO2 לילה עבור 3T3 תאים להתאושש מטיפול mitomycin C.
2. הקמת תרבות אפיתל האף האנושי (hNEC)
הערה: יש להשיג דגימות קליניות מחולים ללא תסמינים של זיהום בדרכי הנשימה העליונות.
- עיבוד רקמת האף לתוך השעיה של תא יחיד
- לשטוף רקמת האף ב 1x Dulbecco של PBS (dPBS) (PBS ללא Mg2+ ו Ca2 +) המכיל 100 μL / mL של תערובת אנטיביוטית-אנטימיקוטית. חותכים את הרקמה לרסיסים קטנים, ולטפל במדגם ב 10 מ"ג / מ"ל של פרוטאז נייטרלי לילה ב 4 °C (60 °F) עם רעד.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 × גרם, ולהסיר את supernatant לאחר צנטריפוגה. לדגור על הכדור ב 1-2 מ"ל של 1x טריפסין-EDTA (37 °C (37 °C (15 °F, 15 דקות), ולהרוות על ידי הוספת נפח של סרום בקר עוברי שווה 10% מהנפח בצינור.
- באופן מכני לנתק את הרקמה המעוכלת לתוך אגרגטים של תאים בודדים על ידי צנרת, ולאחר מכן להעביר את ההשעיה וכתוצאה מכך דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. הזן מחדש את התאים ב- DMEM מלא.
הערה: לאחר שלב זה, השעיית התא היא תערובת של תאים ותאי גזע מובחנים סופניים המכונים תאי גזע אפיתל האף האנושי / תאי אב (hNESPCs). מטרת השלבים הבאים היא לבחור ולהעשיר את אוכלוסיית hNESPC מתערובת של אוכלוסיות תאים שונות.
- זריעת מתלה של תא יחיד לשכבת מזין 3T3 לבחירת hNESPCs
- צנטריפוגה ההשעיה התא משלב 2.1.3 (300 × גרם, 5 דקות, RTP), ולהסיר את supernatant. Resuspend התאים ב 3-5 מ"ל של בינוני 3.
הערה: מדיום 3 פותח כדי לקדם את הצמיחה הסלקטיבית של hNESPCs. - לספור את התאים באמצעות כתמים כחולים טריפאן. זרע 1 x 106 תאים ב 2mL של בינוני 3 לכל באר על צלחת 6-well המכילה שכבת מזין 3T3 מוכנה לאחר הסרת המדיה בצלחת 6 באר. לדגור את התרבות המשותפת המתקבלת ב 37 °C (5 ° F) באווירה של 5% CO2 .
הערה: לאחר זריעה, הקפד לא להסעיר את הצלחת כפי שהוא ישפיע על הקובץ המצורף של hNESPCs. - שנה בינוני 3 (2 מ"ל) כל 2-4 ימים על ידי הסרת המדיום הישן לחלוטין והחלפתו במדיום טרי 3.
הערה: מדיום משתנה כדי לחדש חומרים מזינים וכדי למנוע מצבים חומציים מדי להשפיע לרעה על הצמיחה של hNESPCs. המרווח בין כל שינוי בינוני תלוי עד כמה חומצי (צהוב) המדיום הופך. יש לקצר את המרווחים אם המדיום הופך חומצי במהירות. - לאחר 7-10 ימים, שים לב כי hNESPCs נמצאים במפגש מתאים להעברתם על תוספות ממברנה. ראו איור 1 למורפולוגיה מייצגת של hNESPCs בשלוש נקודות זמן שונות (יומיים, 5 ימים ו-10 ימים).
- צנטריפוגה ההשעיה התא משלב 2.1.3 (300 × גרם, 5 דקות, RTP), ולהסיר את supernatant. Resuspend התאים ב 3-5 מ"ל של בינוני 3.
- העברת hNESPCs על תוספות ממברנה
הערה: בשל טיפול mitomycin C, שכבת מזין 3T3 יהיה לאט להתפרק במהלך תקופת ההרחבה hNESPC. זה יגרום הידבקות מוחלשת על פני השטח של הבאר, המאפשר את הפריקה שלהם על ידי שטיפה עם פיפטה, משאיר מאחור רק את hNESPCs בריא.- הסר את המדיום, והוסף 500 μL של 1x dPBS לכל באר. רוקן את התאים 3x עם micropipette כדי לחלץ את תאי 3T3, ולהשליך את 1x dPBS. שים לב תחת המיקרוסקופ כי hNESPCs עגול נשארים בעוד שכבת מזין 3T3 בצורת ציר הוא מנותק.
- הוסף 500 μL של ריאגנט ניתוק תאים לבאר, ודגר ב 37 °C (5° C) באטמוספירה של 5% CO2 במשך 5-10 דקות, או עד hNESPCs התנתקו מפני השטח של הבאר.
- לאסוף את ההשעיה hNESPC, צנטריפוגה (300 × גרם, 5 דקות, RTP), ולהסיר את supernatant.
- מחדש את הכדור במדיום 3. לספור את התאים באמצעות כתמים כחולים טריפאן. זרע 3 × 104 תאים ב 150 μL של בינוני 3 לכל תוספת ממברנה (צלחת 24-well) או 1 × 105 תאים ב 300 μL של בינוני 3 לכל תוספת ממברנה (צלחת 12-well) (איור 2). לדגור על התאים ב 37 °C (5° פרנהייט) באטמוספרה של 5% CO2 .
- שנה את המדיום (בינוני 3) של התאים האפיים והבסיסיים כל יומיים. נווט בקצה פיפטה בין הזרועות התומכות של הממברנה כדי לגשת לתא הבסיס, להסיר את המדיום הישן, ולאחר מכן להציג מחדש מדיום טרי באותה שיטה. למרות התא apical נגיש בקלות, הקפד לא להפריע שכבת hNESPC גדל.
הערה: אין להפריע למדיום בתא האפי לפחות יומיים לאחר הזריעה מכיוון שהתאים זקוקים לזמן כדי להתחבר לממברנה.
- בידול של hNESPCs ל- hNECs
- כאשר hNESPCs להגיע 100% מפגש (כ 3-7 ימים מן זריעה על תוספת הממברנה), להתחיל את תרבות ALI. שנה את המדיום הבסיסי למדיום בידול, והסר את המדיום מתא האפי. הוסיפו מדיום לתא הבסיס רק מבלי להוסיף אותו לתא האפי בעת שינוי המדיום כל 2-3 ימים, כפי שצוין באיור 3 ובשלב 2.3.5.
הערה: בינוני משתנה למדיום בידול כדי לקדם את ההבחנה של hNESPCs ל- hNECs ב- ALI. hNESPCs לוקח בערך 3-4 שבועות כדי להגיע לבגרות מלאה כדי להפוך hNECs ב- ALI, בשלב זה התאים היו גדלים לתוך multilayer עם אוכלוסיות שונות של תאים בכל שכבה. Cilia צריך גם להיות נצפה בהגדלה של 400x (cilia ניתן לזהות על ידי תנועת המכות שלהם, אשר גורמים לשדה המיקרוסקופ להיראות כאילו הוא רוטט). בשלב זה, התאים מוכנים לשימוש לניסויי התרבות המשותפת. עיינו באיור 4 לחתך של שכבת hNEC מובחנת לחלוטין. - לאחר קבלת hNECs בוגרים, לשטוף את התאים בתא apical 3x עם 1x dPBS במרווחי 2-3 ימים במשך שבוע אחד לפני הניסוי לתרבות משותפת. סינרגיה שלב הכביסה עם השינויים הבינוניים הבסיסיים, ולבצע את השטיפות כדלקמן.
- הוסף 50 μL (24-well)/150 μL (12-well) של 1x dPBS לתוך התא האפילי של תוספת הממברנה, ודגר את התאים ב 37 °C (10 °F) במשך 10 דקות. הסר את dPBS לאחר 10 דקות של דגירה כדי להסיר ריר מצטבר ותאים מתים במהלך ההבחנה.
הערה: בהתאם לאופי הניסוי, פתרון סודיום ביקרבונט יכול לשמש כדי לשטוף את שכבת הריר לחלוטין. עם זאת, עבור זיהום ויראלי בניסויים בתרבות משותפת, שכבת הריר נשמרת, ורק ריר עודף מוסר עם שטיפת dPBS. שימור זה הוא לחקות את שכבת ריר פיזיולוגית נוכח על אפיתליה האף כי יהיה אינטראקציה עם זיהום ויראלי נכנס.
- הוסף 50 μL (24-well)/150 μL (12-well) של 1x dPBS לתוך התא האפילי של תוספת הממברנה, ודגר את התאים ב 37 °C (10 °F) במשך 10 דקות. הסר את dPBS לאחר 10 דקות של דגירה כדי להסיר ריר מצטבר ותאים מתים במהלך ההבחנה.
- כאשר hNESPCs להגיע 100% מפגש (כ 3-7 ימים מן זריעה על תוספת הממברנה), להתחיל את תרבות ALI. שנה את המדיום הבסיסי למדיום בידול, והסר את המדיום מתא האפי. הוסיפו מדיום לתא הבסיס רק מבלי להוסיף אותו לתא האפי בעת שינוי המדיום כל 2-3 ימים, כפי שצוין באיור 3 ובשלב 2.3.5.
3. מדידת התנגדות חשמלית טרנס-אפיתלאלית (TEER)
הערה: אישור של שלמות האפיתל חשוב כדי להבטיח כי שכבה אפיתל שלמה ובריאה מתקבלת. שכבת אפיתל שלמה נקבעת באמצעות מדידת TEER המבוצעת על 4 בארות אקראיות באמצעות וולטוהמטר.
- יש לשטוף את האלקטרודה ב-70% אתנול, ולעקר אותה באור אולטרה סגול למשך 15 דקות לפני השימוש כדי להבטיח סטריליות. יש לשטוף עם 1x dPBS לאחר עיקור.
- הוסף 100 μL (עבור 24-well) או 300 μL (עבור 12-well) של 1x dPBS לתא apical של תוספת הממברנה. לדגור על הצלחת ב 37 °C (50 °F) במשך 10 דקות; לאחר מכן, הסר את ה- dPBS.
- כדי שכל באר תימדד, הכן באר לא מנוצלת עם 1 מ"ל (עבור 24-well) או 3 מ"ל (עבור 12-well) של מדיום בידול לפני המלחמה (עד 37 °C ).? מניחים את הקרום להוסיף היטב מוכן, ולהוסיף 200 μL (עבור 24-well) או 600 μL (עבור 12-well) של מדיום בידול לפני המלחמה לתא apical. שיווי משקל ב 37 °C (בכפוף לטמפרטורת הדגירה של סוג הנגיף הוסיף, למשל, 35 °C (50 °F) עבור שפעת) במשך 15 דקות.
הערה: הכן ריק (הוספת קרום ריק) באותו אופן לחישוב TEER. - שיווי משקל צינור 15 מ"ל של מדיום בידול לפני המלחמה באותה טמפרטורה במשך 15 דקות גם כן. מניחים את האלקטרודות בצינור 15 מ"ל, ולהפעיל את voltohmmeter.
הערה: בשלב זה, הקריאה צריכה להיות 0 התנגדות, כמו האלקטרודות הן באותו מדיום. אם מתקבלת קריאה אחרת, שיווי משקל האלקטרודה בצינור 15 מ"ל עד הקריאה היא 0. - החל מהריק, מקם את האלקטרודות בכל באר כך שאלקטרודה אחת שקועה במדיום התא האפוי והשנייה במדיום תא הבסיס. הקלט את הקריאה רק כאשר מתקבלת קריאה מתמדת לתקופה של 5 דקות לפחות.
- לאחר כל מדידה, לשטוף את האלקטרודה עם PBS לפני המדידה הבאה. עבור כל נבדק היטב, לקחת מדידות עבור שלוש דגימות במיקומים שונים של הממברנה. כדי לחשב את ה- TEER נטו של כל דגימה, הפחת את עמידות הרקע, שניתנה על-ידי הוספת הממברנה הריקה, מכל מדידה.
- חשב את קריאת TEER הכוללת עבור באר באמצעות המשוואה הבאה:
שלמות אפיתל (Ωcm2) = Net TEER(ohms) × אזור הממברנה (ס"מ2)
הערה: ערכי TEER של hNECs לניסויי זיהום ויראליים צריכים להיות >1000 Ωcm2 13,15,16.
4. בידוד של מונוציטים דם היקפיים ותאי NK
הערה: יש להשיג דגימות דם ממתנדבים בריאים ולהשתמש בהן באותו יום של בידוד.
- לאסוף 30-40 מ"ל של דם שלם מכל תורם בצינורות איסוף דם 10 מ"ל.
- בודדו את מחשבי ה-PBMCs באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות, וקבלו מחשבי PBMCs ממעיל הבאפי לאחר השלבים הבאים (ראו גם טבלת החומרים).
- יש לערבב ביסודיות ~ 10 מ"ל של דם מצינור איסוף הדם ב vacutainer לפני דילול עם נפח שווה של פתרון מלח מאוזן (PBS).
- הוסף 15 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות לבסיס של צינור 50 מ"ל.
הערה: היחס בין שיפוע צפיפות בינוני לדם מדולל צריך להיות 2:3-3.5. - שכבה 35 מ"ל של דם מדולל על המדיום שיפוע הצפיפות עם אקדח פיפטה (עם הגדרת לוותר מוגדרת לנמוך ביותר האפשרי) על ידי הטיית הצינור על ידי הטיית הצינור על ידי 45 ° ומאפשר את הדם המדולל ליפול טיפה על הקיר הפנימי של הצינור, כך שכבת מדיום שיפוע צפיפות לא מופרע.
- צנטריפוגה lysate ב 500 × גרם, 18-20 °C (30 °F) במשך 30 דקות (בלם: כבוי). הסר בזהירות והשלך את שכבת הפלזמה העליונה מבלי להפריע לשכבה התחתונה.
- מעבירים את שכבת הבאפי לצינור חדש מבלי לערבב את שכבת תאי הדם האדומים, את השכבה הבינונית בצפיפות ההדרגתית או את מעיל הבאפי. לאחר שמעיל הבאפי נאסף בצינור חדש של 50 מ"ל, העלה את הנפח ל-50 מ"ל עם 1x PBS.
- צנטריפוגה lysate ב 800 × גרם, 18-20 °C (8 °F),8 דקות (בלם: כבוי), ולהסיר את supernatant עם אקדח פיפטה. Resuspend את גלולה התא עם 50 מ"ל של 1x PBS, וצנטריפוגה ב 120 × גרם, 18-20 °C (60 °F), 10 דקות כדי להסיר טסיות דם.
- להשליך את supernatant על ידי צינורות, מבלי להפריע גלולה התא.
הערה: כמו גלולה התא עשוי להיות רופף, זה לא מומלץ להשליך את supernatant על ידי שפיכה. - Resuspend גלולה התא עם מלא RPMI (מכון הזיכרון רוזוול פארק) מדיום. בצע ספירת תאים על ידי הוספת 10 μL של 3% חומצה אצטית עם מתילן כחול ל 10 μL של השעיית התא resuspended. מערבבים היטב, ומוסיפים 10 μL של התערובת להמוציטומטר כדי לספור את התאים.
- לדלל PBMCs עם מדיום RPMI מלא לצפיפות של 2 × 106/mL (עבור 24-well) או 4 × 106/mL (עבור 12-well).
5. זיהום נגיפי hNEC ומעבר ל- hNEC:PBMC תרבות משותפת
הערה: H3N2 (A/Aichi/2/1968) משמש כזן היציג של זיהום בפרוטוקול זה. ריבוי של זיהום (MOI) של 0.1 משמש MOI הייצוגי בפרוטוקול זה.
- יום 0 (זיהום של hNECs)
הערה: באר אחת מן hNECs גדל מאותו תורם משמש כדי לקבל ספירת תאים מייצגת עבור כל היטב בשימוש בניסוי.- בבאר הייצוגית, להוסיף 150 μL של 1x טריפסין-EDTA לתא apical של הכנס הממברנה ו 350 μL של 1x טריפסין-EDTA לתא הבסיס, ודגר ב 37 °C (60 °F) במשך 10 דקות, או עד התאים להתנתק מן הממברנה.
- לשטוף את התאים על הממברנה על ידי צנרת למעלה ולמטה, ולאסוף את ההשעיה בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל. הוסף 200 μL של DMEM מלא כדי להרוות פעילות טריפסין. לספור תאים באמצעות כתמים כחולים טריפאן כדי להשיג את ספירת התאים לבאר.
- חשב את ה- MOI הנדרש של הנגיף בהתבסס על ספירת התאים לבאר, ודלל את מלאי הווירוסים בהתאם עם RPMI מלא על קרח.
הערה: MOI 0.1 של 1.26 × 106 hNECs לבאר = 1.26 × 105 חלקיקים ויראליים H3N2 לבאר ב 30 μL (עבור 24-well)/100 μL (עבור 12-well) - עבור הבארות הנותרות לניסוי הזיהום, להוסיף 50 μL (עבור 24-well)/150 μL (עבור 12-well) של 1x dPBS לתוך התאים האפיים של מוסיף הממברנה, לדגור ב 37 °C (10 °C ( 10 דקות, ולהסיר את 1x dPBS.
- שנה את המדיום הבסיסי בממברנה מוסיף כדי להשלים מדיום RPMI על ידי העברת התוספות ללוח חדש עם RPMI מלא הוסיף הבארות (350 μL (עבור 24-well)/700 μL (עבור 12-well)).
הערה: כאשר hNESPCs נבדלו באופן מלא ל- hNECs, הם סובלניים/מתירניים למדיה שונה עבור עד 72 שעות, ללא שינויים במורפולוגיה או בארגון כאשר המדיום עובר ל- RPMI12. RPMI משמש לתמיכה בצמיחה ותחזוקה של אוכלוסיית PBMC. - הוסף את 30 μL מוכן (עבור 24-well)/100 μL (עבור 12-well) של הנגיף inoculum לתוך התא האפוי של תוספת הממברנה, לדגור ב 35 °C (5 ° C ) באטמוספירה 5% CO2 עבור 1 שעות, ולהסיר את אינוקולום הנגיפי מתא apical.
- שנה את המדיום הבסיסי של תוספת הממברנה למדיום RPMI מלא טרי ודגר ב 35 °C (5° C) באטמוספירה של 5% CO2 במשך 24 שעות.
- יום 1 (הקמת hNECs + תרבות משותפת של מחשבים אישיים)
- זרע את המספר הנדרש של PBMCs ב 150 μL (עבור 24-well)/300 μL (עבור 12-well) של מדיום RPMI מלא על ידי הוספת ישירות את ההשעיה PBMC לתוך התא הבסיסי של כל באר של כל באר של hNECs נגועים או נגועים מיום 0 (1.5 × 106 עבור צלחות 24-well ו 3 × 1010 6 עבור צלחות 12-well). דגירה ב 37 °C (50 °F) עבור 24/48 שעות.
הערה: הכרך הסופי בתא הבסיס לאחר הקמת התרבות המשותפת הוא 500 μL (עבור 24-well)/1000 μL (עבור 12-well).
- זרע את המספר הנדרש של PBMCs ב 150 μL (עבור 24-well)/300 μL (עבור 12-well) של מדיום RPMI מלא על ידי הוספת ישירות את ההשעיה PBMC לתוך התא הבסיסי של כל באר של כל באר של hNECs נגועים או נגועים מיום 0 (1.5 × 106 עבור צלחות 24-well ו 3 × 1010 6 עבור צלחות 12-well). דגירה ב 37 °C (50 °F) עבור 24/48 שעות.
- ימים 2-3 (קצירת PBMCs 48/72 h זיהום לאחר ויראלי)
- אוסף של supernatants apical (48/72 שעות זיהום פוסט ויראלי)
- הוסף 50 μL (עבור 24-well)/150 μL (עבור 12-well) של 1x dPBS לכל תא apical, ודגור ב 37 °C ((37 °F) במשך 10 דקות. לאסוף את 1x dPBS בצינורות 1.5 מ"ל. Aliquot 25 μL (עבור 24-well)/50 μL (עבור 12-well) של supernatant עבור פלאק לבדוק בצינור חדש 1.5 מ"ל, ומיד להקפיא הן את המלאי ואת aliquots ב -80 °C (80 °F).
- אוסף של RNA סלולרי מ hNECs (48/72 שעות זיהום פוסט ויראלי)
- מעבירים את תוספת הממברנה לבאר נקייה, מוסיפים 300 μL (עבור 24-well)/600 μL (עבור 12-well) של חיץ תמוגה RNA לתא האפי, ודגור ב RTP במשך 5 דקות. לאסוף את supernatant בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל, ולאחסן אותו ב -80 °C (80 °F) עד מיצוי RNA לניתוח מולקולרי.
- קצירת PBMCs (48/72 שעות לאחר זיהום ויראלי)
- עם בסיס רחב של קצה פיפטה סטרילי, לגרד בעדינות את פני השטח של הבאר כדי לעקור את PBMCs מופעל שעשוי להיות דבק על פני השטח באר. לאסוף את המדיום הבסיסי המכיל PBMCs בצינור צנטריפוגה 2 מ"ל.
- לשטוף את הבארות 2x עם 300 μL של 1x dPBS, ולאסוף את הכביסה באותו צינור 2 מ"ל. צנטריפוגה צינור 2 מ"ל (500 × גרם, 5 דקות, RTP), ולאסוף את supernatant בצינור 2 מ"ל טרי ללא גלולה תאים מפריעה. לאחסן את supernatant ב -80 °C (80 °F) לניתוח ציטוקינים וכימוקין; resuspend גלולה התא ב 200 μL של 1x dPBS.
- אוסף של supernatants apical (48/72 שעות זיהום פוסט ויראלי)
6. ציטומטריית זרימה
הערה: סעיף זה של הפרוטוקול ממשיך ישירות מהסעיף הקודם באמצעות השעיית התא PBMC משלב 5.3.3.2. הבטח חשיפה מינימלית לאור במהלך השלבים הבאים בסעיף זה. לוח מדגם של סמני כתמי משטח ניתן למצוא בטבלה 2.
- כתמי פני השטח
- מעבירים את גלולה התא PBMC המחודשת לצלחת באר תחתונה של 96-V. צנטריפוגה lysate ב 800 × g במשך 3 דקות, ולהסיר את supernatant.
- לדגור על כל מחשבי PBMCs (למעט "לא נגוע") עם 100 μL של כתם הכדאיות במשך 15 דקות ב RTP. למעלה עד 200 μL עם 150 μL של מאגר מיון תאים המופעלים מגנטית (MACS). צנטריפוגה lysate ב 800 × גרם במשך 3 דקות, ולהשליך את supernatant.
- הכן פאנל של נוגדנים מכתימים פני השטח של עניין עם יחסי דילול מתאימים ונפח סופי של 50 μL לכל תגובה (למעלה עם מאגר MACS כדי לקבל את הנפח הסופי). בצע כתמי משטח על ידי הוספת 50 μL של תערובת הנוגדנים המוכן לתאים באמצעות פיפטה רב ערוצית. דגירה ב 4 °C (4 °F) במשך 15 דקות בחושך.
- לשטוף על ידי הוספת 150 μL של מאגר MACS. צנטריפוגה lysate ב 800 × גרם במשך 3 דקות, ולהשליך את supernatant. אם אין צורך בהכתמה תאית, המשך ישירות לדגירה של 15 דקות בשלב 6.3.
- כתמים תאיים (במידת הצורך)
- הוסף 100 μL של פתרון קיבעון וחדירות לכל באר. דגירה ב 4 °C (65 °F) במשך 20 דקות בחושך. מלא את הבארות עם 100 μL של מאגר MACS 1x.
- צנטריפוגה (800 × גרם, 3 דקות, 25 מעלות צלזיוס), ולהסיר את supernatant. חזור על הכביסה על ידי הוספת 200 μL של 1x מאגר לשטוף פרמביליזציה. צנטריפוגה (500 × גרם, 3 דקות, 25 מעלות צלזיוס), ולהסיר את supernatant.
- הכן את הדילולים עבור לוח הנוגדנים של עניין כדי להשיג נפח סופי של 50 μL באמצעות 1x מאגר שטיפת Permeabilization. דגירה על קרח במשך 30 דקות בחושך. הוסף 200 μL של 1x מאגר שטיפת פרמביליזציה.
- צנטריפוגה התאים (800 × גרם, 3 דקות, 4 °C (50 °F), ולהסיר את supernatant. resuspened התאים ב 100 μL של מאגר מיון תאים המופעלים פלואורסצנטיות.
- פיפטה 200 μL של פתרון lysing לתוך כל באר. דגירה במשך 15 דקות ב RTP. צנטריפוגה lysate ב 800 × g במשך 3 דקות ולהשליך את supernatant.
- resuspend את כדורי התא ב 200 μL של מאגר MACS. בצע ציטומטריית זרימה בהתאם להגדרות שתוארו קודם לכן13, או לאחסן ב 4 °C (60 °F) בחושך.
7. קביעת רמות ציטוקינים וכימוקין
- תהליך 25 μL של supernatant תא הבסיס באמצעות בדיקת מולטיפלקס אימונולוגיה על פי פרוטוקולהיצרן 18.
- חשב את הריכוז של כל ניתוח באמצעות תוכנת מנהל מולטיפלקס המשתמשת באלגוריתם התאמת עקומה (5 פרמטרים) עבור העקומה הסטנדרטית.
8. הערכה של זיהום ויראלי
- לחלץ RNA ויראלי באמצעות ערכת חילוץ על 4 סטים של פתרונות: פתרון H3N2 המלאי, דילול MOI 0.1 לזיהום, דילול סדרתי 10x של MOI 0.1, ואת המדיום הבסיסי מן הדגימות (הן 48 ו 72 שעות זיהום פוסט ויראלי)12.
- בחר גן לא מבני (NS1) ומטריצה (M1) כיעדים לתגובת שרשרת פולימראז (PCR) (עיין בטבלת החומרים עבור פריימרים המשמשים בניסוי הייצוגי).
- בצע הפוך תמלול-PCR (RT-PCR) (42 °C, 60 דקות) כדי להמיר את ה- RNA הנגיפי ל- cDNA לפני ביצוע PCR כמותי (qPCR) כדי למדוד את רמות NS1 ו- M1 כבאקסי לנוכחות ויראלית, ולהתאים את הרמות לעקומה הסטנדרטית המתקבלת מה- RT-qPCR המבוצעת על דילול סדרתי 10x של MOI 0.1 aliquot. עיין בטבלה 3 להרכב תערובות התגובה, והשתמש בתנאים הבאים: קדם-דגירה בטמפרטורה של 95 °C (10 °F) למשך 10 דקות, ואחריו הגברה של 3 שלבים עבור 40 מחזורים: 95 °C (95 °F) עבור 10 s, 60 °C (60 °F) עבור 10 s, 72 °C (72 °F) עבור 30 s; עקומת התכה: 95 °C (10 °F) עבור 10 s, 65°C עבור 60 s, ו 97 °C עבור 1 s.
9. בדיקת פלאק
- יום 0: זריעת MDCK (כליה כלב מאדין דארבי) בצלחות 24-well
- הסר את המדיום מבקבוק T75 של תאי MDCK זורמים. לשטוף 2x עם 1x PBS כדי להסיר את כל שאריות של סרום. טריפסין תאי MDCK על ידי הוספת 10 מ"ל של טריפסין ודירה ב 37 °C (5° C) באטמוספרה 5% CO2 במשך 20-30 דקות עד התאים להתנתק.
הערה: אל תקישו על הבקבוקון מכיוון שהדבר עלול לגרום לגושים. - פיפטה השעיית התא לתוך צינור 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל של מדיום חיוני מינימלי מלא של נשר (EMEM). צנטריפוגה (300 × גרם, 5 דקות, RTP), ולהסיר את supernatant.
- התקן מחדש את התאים ב-6 מ"ל של EMEM מלא. ספור את התאים לפי כתמים כחולים טרייפן.
- לדלל את ההשעיה התא MDCK לריכוז של 1 × 105 תאים / מ"ל, וזרע 1 מ"ל של ההשעיה מדוללת בכל באר של צלחת סטרילית 24-well. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% CO2 למשך 24 שעות כדי להשיג מונולייר משולב של תאי MDCK בכל באר.
- הסר את המדיום מבקבוק T75 של תאי MDCK זורמים. לשטוף 2x עם 1x PBS כדי להסיר את כל שאריות של סרום. טריפסין תאי MDCK על ידי הוספת 10 מ"ל של טריפסין ודירה ב 37 °C (5° C) באטמוספרה 5% CO2 במשך 20-30 דקות עד התאים להתנתק.
- יום 1: זיהום של תאי MDCK
- הכן את מדיום הזיהום. הסר את המדיום מן monolayer MDCK בצלחת 24-well, ולשטוף 2x עם 1x dPBS. לכביסה השנייה, להשאיר את PBS בבארות תוך הכנת דילול סדרתי של הנגיף.
- להפשיר את דגימות הנגיף על קרח, ולדלל אותם באופן סדרתי בלוח 24-well כדי להשיג דילול סדרתי מ 10-1 ל 10-6.
הערה: כדוגמה, מלא כל באר בצלחת של 24 בארות עם 270 μL של מדיום זיהום. - הוסף 30 μL של דגימת הווירוס לבאר הראשונה בשורה. עם טיפ פיפטה חדש, לערבב היטב ולהעביר לבאר הבאה בשורה כדי לדלל את המדגם על ידי 10x. המשך עד 10-6 דילול הושג; בצע שלבים 9.2.1-9.2.3 עבור כל דגימות הווירוסים.
- הסר PBS מצלחת MDCK, ולהדביק כפול עם 100 μL של דילול ויראלי מוכן. עבור בארות שליטה, להוסיף 100 μL של מדיום הזיהום (ללא המדגם הנגיפי). דגירה בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% CO2 למשך שעה אחת, מנענעת את הצלחת כדי למנוע כתמים יבשים כל 15 דקות.
- הסר את inoculum הנגיפי, ולהוסיף 1 מ"ל של כיסוי נוזלי עבור כל באר. דגירה בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% CO2 למשך 72 שעות.
- יום 4 (72 שעות לאחר ההדבקה): הדמיה פלאק
- הסר את שכבת-העל הנוזלית, ותקן את התאים עם 4% פורמלדהיד ב 1x PBS במשך 1 שעות. הסר את פתרון פורמלדהיד, ולשטוף פעם אחת עם 1x PBS או מים מזוקקים.
- להכתים את התאים הקבועים על ידי הוספת 1% פתרון סגול קריסטל במשך 15 דקות. הסר את צבע סגול קריסטל, ולשטוף את התאים עם מים זורמים. יבש את הצלחת ב RTP.
- לאחר הייבוש, ספור לוחות וחשב את הטייטר הנגיפי בהתאם לנוסחה הבאה:
מספר לוחות × פקטור דילול = מספר פלאק - יוצר יחידות ב 100 μL
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
למרות שתאי T קונבנציונליים מהווים את הרפרטואר העיקרי של תגובה חיסונית אדפטיבית נגד זיהום ויראלי כדי להקל על הסיווג הנגיפי, אוכלוסיית תאי ה- T המולדת פועלת על פני ספקטרום רחב יותר כדי לדכא את העומס הנגיפי לשחרור יעיל בשלב מאוחר יותר. לכן, פרוטוקול זה יוצר באופן ספציפי מצב חזק לחקור תאי T מולדים, ההפעלה שלהם, ואת האוכלוסייה התפקודית שלהם בעקבות זיהום שפעת, ללא צורך בדגימות אפיתל ותא חיסוני מאותו תורם. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם על וירוסים אחרים, אם כי זה עשוי להיות מוגבל וירוסים עם שחרור apical, כלומר, אין וירוס צריך להיכנס לשכבה הבסיסית לבוא במגע עם תא PBMC.
בהתבסס על התוצאות הייצוגיות באיור 1, פרוטוקול זה יכול לסייע בהשגת אוכלוסיות hNESPC הגדלות מהשעיית תאים ראשית בשכבת מזין 3T3. איור 1 מספק מדגם של ההתקדמות הצפויה של hNESPCs כאשר הם גדלים בשכבת המזין 3T3. תאים אלה ישמשו לבידול בתרבית ALI להשגת hNECs רב שכבתיים, הכוללים תאי ciliated וגביע פונקציונליים (איור 4). באמצעות hNECs, הפעלה מולדת של תאי T ניתן לחקור באמצעות cytometry זרימה. התוצאות המוצגות באיור 5 מראות את הזיהוי של תאי MAIT, תאי γδ-T ואוכלוסיות תאי NK, אשר גדלו באופן משמעותי בתרבות המשותפת הכוללת hNECs נגועים בנגיף שפעת. לאחר מכן ניתן להחיל הגדרה זו על זנים אחרים של נגיף השפעת כדי להקניט את האוכלוסייה האוניברסלית על פני זנים, כמו גם וירוסים אחרים ואת יכולתם להפעיל אוכלוסיות תאי T מולדות. בנוסף, לוח האיתור יכול גם להיות מותאם אישית על פי אוכלוסיית תאי החיסון המולדת של עניין להתבונן ההפעלה שלהם בהתאמה בתנאים של תרבות משותפת עם תאי אפיתל נגועים.
איור 1: hNESPCs הגדלים בשכבת מזין 3T3 2/5/10 ימים מזריעה. יום 2: שים לב לאיים של hNESPCs (דוגמה מסומנת בחץ לבן) כי יש לצפות 2 ימים לאחר זריעה על שכבת מזין 3T3. יום 5: האיים שנצפו ביום 2 צריכים כעת להיות גדולים יותר (דוגמאות של איים של hNESPCs מסומנים על ידי עיגולים ירוקים), ואת שכבת 3T3 יש לראות להיות מתנוון. יום 10: hNECPSs צריך להיות שולט על הצלחת כולה עם מעט או לא 3T3 תאים גלויים. סרגלי קנה מידה ליום 2 ויום 5 = 50 מיקרומטר בהתבסס על הגדלה של 200x, סרגל קנה מידה ליום 10 = 100 מיקרומטר בהתבסס על הגדלה של 100x. קיצור: hNESPCs = גזע אפיתל האף האנושי / תאי אב. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דיאגרמות באר עבור תוספות ממברנה בלוחות של 24 בארות ו-12 בארות. שים לב לעוצמת הקול הבינונית שישמש עבור כל תא. hNESPCs נזרעים בתאים האפויים של תוספות הממברנה. קיצור: hNESPCs = גזע אפיתל האף האנושי / תאי אב. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: דיאגרמות באר עבור תוספות ממברנה בלוחות של 24 בארות ו-12 בארות עבור מפעל התרבות המשותפת של ALI. שים לב לעוצמת הקול הבינונית שישמש עבור כל תא. שים לב להבדלים בנפח בינוני שישמשו עבור המרווחים השונים (יומיים/שלושה ימים) בין שינויים בינוניים. קיצור: ALI = ממשק נוזל אוויר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: β4-טובולין וכתם משותף MUC5AC של שכבת hNEC. β4-טובולין מוכתם בירוק, בעוד MUC5AC מוכתם באדום. הגרעינים מוכתמים בכחול עם DAPI. MUC5AC מציין את נוכחותם של תאי גביע מייצרי ריר, בעוד β4-טובולין מציין את נוכחותם של cilia על תאים ciliated. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר בהתבסס על הגדלה של פי 600. קיצורים: hNEC = תא אפיתל האף האנושי; MUC5AC = mucin 5AC; DAPI = 4′,6-diamidino-2-פנילינדולה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תוצאות מייצגות של PBMCs דגירה עם או בלי אפיתל האף או אפיתל נגוע בשפעת במשך 24 שעות. הפעלה של תאי MAIT, Vδ1 T, תאי Vδ2 T ותאי NK נקבעה על-ידי סמנים ספציפיים לתא, כולל Vα 7.2 TCR, Vδ1 TCR, Vδ2 TCR, CD56 והכתמת CD69. הערכים מעל השערים מציינים את אחוז התאים החיוביים של CD69. קיצורים: PBMCs = תאים חד-גרעיניים בדם היקפי; אפית = אפיתל האף; שפעת-אפית = אפיתל נגוע בשפעת; MAIT = תאי T invariant הקשורים לקריעת; NK = רוצח טבעי; TCR = קולטן תאי T; CD = אשכול של בידול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| בינוני | מתכון | הרכב | הערות |
| בינוני 3 | תערובת DMEM/חומרים מזינים F-12 | 500 מ"ל | |
| גורם גדילה אפיתל אנושי | 5 ננוגרם/מ"ל | ||
| אינסולין | 2.5 מיקרוגרם/מ"ל | ||
| כולרה רעלן | 0.1 ננומטר | ||
| הידרוקורטיזון | 0.5 מיקרוגרם/מ"ל | ||
| 3,3', 5-טריודו-ל-ת'ירונין | 2 ננומטר | ||
| תוספת N-2 | 5 מ"ל | 10 μL / מ"ל | |
| אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית | 5 מ"ל | ||
| מדיית בידול | מדיום בזאלי PneumaCult-ALI | 441 מ"ל | |
| תוספת ריאותקולט-עלי 10x | 50 מ"ל | ||
| פתרון הידרוקורטיזון (200x) | 2.5 מ"ל | ||
| 0.2% (2 מ"ג /מ"ל; 1000 יחב"ל / מ"ל) מלח נתרן הפרין מלוחים מלוחים עם מאגר פוספט | 1 מ"ל | ||
| אנטיביוטיקה-אנטי-אנטימיקוטית (100x) | 5 מ"ל | ||
| תוסף תחזוקה PneumaCult-ALI (100x) | 500 μL | רק להוספה ממש לפני השימוש | |
| השלם את המדיום החיוני המינימלי של דולבקו (DMEM) | DMEM/גלוקוז גבוה | 450 מ"ל | |
| סרום בקר עוברי מושבת בחום | 50 מ"ל | ||
| אנטיביוטיקה-אנטי-אנטימיקוטית (100x) | 5 מ"ל | ||
| מכון הזיכרון המלא של רוזוול פארק (RPMI) מדיום | RPMI 1640 (w L-גלוטמין) | 445 מ"ל | |
| סרום בקר עוברי מושבת בחום | 50 מ"ל | ||
| אנטיביוטיקה-אנטי-אנטימיקוטית (100x) | 5 מ"ל | ||
| המדיום החיוני המינימלי של הנשר (EMEM) | EMEM (w L-גלוטמין) | 450 מ"ל | |
| סרום בקר עוברי מושבת בחום | 50 מ"ל | ||
| מדיום זיהום | EMEM (w L-גלוטמין) | 4 מ"ל | |
| טריפסין TPCK (500 מיקרוגרם/מ"ל) | 8 μL | ריכוז טריפסין TPCK סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל | |
| מאגר מיון תאים המופעל באמצעות מגנטים | 1x PBS | 498 מ"ל | |
| 0.5 מטר EDTA | 2 מ"ל | ||
| BSA (כיתה תרבית רקמות) | 2.5 גרם | ||
| DMEM מלא בתוספת מיטומיצין C | השלמת DMEM | 10 מ"ל | |
| מיטומיצין C | 500 μL | מיטומיצין C (10 מיקרוגרם/מ"ל) |
טבלה 1: מתכון למדיה בשימוש.
| סמן פני תא | פלואורופור |
| קולטן תאי T Vδ1 (TCR) | פלואורסצ'ין איזותיוציאנט (FITC) |
| Vδ2 TCR | פרידינין-כולורפיל-חלבון (PerCP) |
| CD3 | V500 |
| CD8 | אלופיקוציאנין-ציאנין-ציאנין 7 צבע (APC-Cy7) |
| CD14 | פיקוריתרין (PE)-CF594 |
| CD56 | פיקוריתרין (PE)-ציאנין 7 (Cy7) |
| CD69 | סגול מבריק 421 (BV421) |
| CD83 | אלופיקוציאנין (נגמ"ש) |
| CD161 | סגול מבריק 605 (BV605) |
| Vα 7.2 | פיקוריתרין (PE) |
| CD38 | UltraViolet מבריק 395 (BUV395) |
טבלה 2: סמני כתמי משטח לדוגמה.
| תמהיל תגובה qPCR | תערובת ראשית של qPCR | 5 μL |
| מים נטולי נוקלאז | 3 μL | |
| פריימר קדמי (1 מ"מ) | 0.5 μL | |
| פריימר הפוך (1 מ"מM) | 0.5 μL | |
| cDNA (12.5 ננוגרם/μL) | 1 μL | |
| נפח תגובה כולל | 10 μL | |
| תערובת תגובה RT-PCR | מאגר RT-PCR 5x | 2.5 μL |
| פריימרים אקראיים (500 ננוגרם/μL) | 0.2 μL | |
| מעכב RNase | 0.625 μL | |
| תערובת dNTP | 2.5 μL | |
| תמלול הפוך | 0.5 μL | |
| RNA (200 ננוגרם/μL) | 1 μL | |
| מים נטולי נוקלאז | 12.675 μL | |
| נפח תגובה כולל | 20 μL |
טבלה 3: מתכון לתערובות תגובה של תגובת שרשרת פולימראז תעתיק הפוכה (RT-PCR) ו- PCR כמותי (qPCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תגובות חיסוניות מולדות נגד וירוסים הן תחום מחקר שלא נחקר בניהול אנטי-ויראלי. תאי האפיתל בדרכי הנשימה ותאי החיסון המולדים פועלים בתיאום כדי לדכא שכפול ויראלי במהלך זיהום, מלבד לשמש כגורם דטרמיננטה של תגובה אדפטיבית מוגזמת אם העומס הנגיפי אינו נשמר בבדיקה 12,13,17. עם זאת, הפיתוח של מודל אנושי רלוונטי לחקר האפיתל-מולד מערכת החיסון crosstalk כדי לחקור את ההפעלה של תאי מערכת החיסון המולדת כדי להעניק תגובה אנטי ויראלית מתאימה נשאר אתגר. לפיכך, מודל זה של תרבות משותפת ALI מייצג טכניקה רב-תכליתית שניתן להשתמש בה כדי להעריך שורה שלמה של אינטראקציות בין שכבת אפיתל האף לבין תאי החיסון. כמודל זה משלב hNECs מובחנים במבחנה, ניתוח הפעלת PBMC באמצעות cytometry זרימה, וזיהום ויראלי, רבים מהצעדים המכריעים כבר מסומן בבירור כדי להבטיח את ההצלחה של פרוטוקול זה. בנוסף, ניתן לעשות שינוי נוסף גם לחלק של דרכי הנשימה המעורבות בו ניתן להשתמש בתאים מובחנים במבחנה מדרכי הנשימה העליונות והתחתונות, מה שמוסיף שכבה נוספת של רב-תכליתיות לפרוטוקול.
עם זאת, בעת עבודה עם צלב תאים אפיתל-חיסוניים בזיהום ויראלי, זה קריטי כי הנגיפים אינם אינטראקציה ישירה עם PBMCs כדי לזהות גורמים מסיסים שמקורם האפיתל המקומי מוקדם ששוחררו על ידי hNECs. לכן, מודל זה מתאים יותר לבדיקת וירוסים עם שחרור ויראלי מקוטב, שבו וירוסים רק ניצנים מן פני השטח apical לתוך התא apical, למשל, וירוסי שפעת12 ו SARS-CoV-2 וירוס19. בנוסף, כדי למנוע דליפה של וירוסים שחרור אפיקלי לתוך התא הבסיסי להתפשר על הניסוי, שכבה אפיתל שלמה של עובי מספיק הוא חיוני. לכן, חשוב כי מדידת TEER וכימות RNA ויראלי יבוצעו כדי להבטיח כי התוצאות הן ללא דליפות ויראליות לתוך תא הבסיס 13,16,20. קריאת TEER של >1000 מרמזת על ריבוי שכבות שלם של תאים המתאימים לווירוסים עם שחרור מקוטב; התקשורת הבסיסית צריכה להיות נקייה מכל זיהום RNA ויראלי 13,15,16. עם זאת, התועלת של המודל עבור וירוסי שחרור דו כיווני, כגון rhinoviruses, נשאר להיחקר16. וירוסים כאלה אינם מוגבלים לשחרור צאצאיהם באופן מקוטב ועשויים לשחרר באופן דו-צדדי וירוסים חדשים לאזורים אפיקליים ובסיסיים של האפיתל. אופטימיזציה נוספת נדרשת לפני שניתן יהיה להחיל מודל זה על וירוסים עם שחרור לא מקוטב.
כמו פרוטוקול זה כרוך בעבודה עם דגימות אנושיות מאנשים שונים, אין שתי דגימות של hNECs יציגו את אותם מאפיינים ותגובות12,16. לדוגמה, הצמיגות של הריר המיוצר על ידי שכבת hNEC המובחנת באופן סופי יכולה להיות שונה מאוד. המהירות של פיתוח cilia עשוי גם להיות שונה. חשוב, אם כן, להפעיל רמה מסוימת של גמישות בעת דבקות בהנחיות המפורטות בפרוטוקול זה. אמנם בהחלט ניתן להשתמש קווי תא אפיתל, זה יסיר את המורכבות (ריר, אינטראקציות בין סוגי תאים שונים) של האינטראקציות בין סוגי התאים השונים של שכבת האפיתל, אשר יהיה אידיאלי לחקירה של איך צלב אפיתל משפיע על התגובות של PBMCs. קו תאים ראשי נחוץ כדי לחקות את הפיזיולוגיה של רקמות האף, שם התאים הם רב שכבתיים, וסוגי התאים השונים הם מקומיים לנישה האישית שלהם, אם כי שונות עשויה להיות בעיה. ניתן להתגבר על שונות בהקשר זה על ידי שימוש ברצף RNA חד-תאי כדי להבדיל ולהפריד את האוכלוסייה ההטרוגנית של התאים.
סוגי האינטראקציות שניתן להעריך אכן מוגבלים על ידי מקור המחשבים האישיים וה- hNECs. כאשר ה- PBMCs וה- hNECs מתקבלים מתורמים שונים, הבטחת שלמות אפיתל והפרדה היא קריטית. כאשר PBMCs באים במגע עם hNECs, תגובות חיסוניות אלוגניות עלולות להתרחש. לפיכך, האינטראקציות היחידות הרלוונטיות הן אינטראקציות בתיווך גורמים מסיסים שיכולים לעבור דרך תוספות הממברנה, כפי שתואר בפרוטוקול לעיל. עם זאת, כאשר שתי אוכלוסיות התאים מקורן באותו אדם, למודל זה יש שכבה נוספת של תועלת כמו תגובות תאי חיסון קונבנציונליים בין hNECs לבין אוכלוסיית PBMC ניתן כעת להעריך, כולל ציטוטוקסיות בתיווך תאי T ותגובות בתיווך נוגדנים. בנוסף, ניתן לבצע מחקרים אפיגנטיים גם כדי לבחון כיצד שינויים בגנום עשויים להשפיע על ביטוי/הפרשת גן/חלבון ציטוקינים.
יתר על כן, ניתן להוסיף אוכלוסיות תאים שונות לתא הבסיס כדי לחקור עוד יותר אוכלוסייה ספציפית. זה יכול להתבצע על ידי בידוד אוכלוסיות התאים של עניין (תאי T, תאי NK, מונוציטים) ולהציג אותם לתא הבסיס במקום PBMCs. עם זאת, מודל זה לא יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות תאיות הדורשות מגע ישיר בשל ההפרדה של שתי אוכלוסיות התאים על ידי הממברנה. ככזה, החקירה של תגובות חיסוניות מסתגלות עשויה להיות מוגבלת על ידי פרט זה. לסיכום, מודל זה של ALI שיתוף תרבות מציע נקודת התחלה רב-תכליתית לחקירה במבחנה של השיח הצולב בין רקמות האף לתאי החיסון. הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מנסה לספק קו מנחה שיועיל גם אם האוכלוסיות/התנאים ישתנו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לצוות המחקר במחלקה לאוטולרנגולוגיה של NUS ולמחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה על עזרתם בעבודה הקשורה לתרבות HNEC ולתרבות ויראלית. ברצוננו גם להודות למנתחים ולצוות הכירורגי בבית החולים האוניברסיטאי הלאומי, המחלקה לאוטולרנגולוגיה, על עזרתם באספקת דגימות התא והדם הנדרשות למחקר.
מחקר זה מומן על ידי המועצה הלאומית למחקר רפואי, סינגפור לא. NMRC/CIRG/1458/2016 (לדה יון וואנג) ו-MOH-OFYIRG19may-0007 (לקאי סן טאן). קאי סן טאן הוא מקבל תמיכה מלגה ממלגת מחקר לאלרגיה ואימונולוגיה קלינית (EAACI) אירופאית לשנת 2019.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free | Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
| 1.5 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120086 | 1.5mL Centrifuge Tube |
| 10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes | BD | 366643 | 10mL Blood Collection Tubes |
| 10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
| 10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
| 12-well Plate | Corning | 3513 | |
| 12-well Transwell Insert | Corning | 3460 | membrane insert |
| 1x FACS Lysing Solution | BD | 349202 | |
| 2.0 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120094 | 2 mL centrifuge tube |
| 24-well Plate | Corning | 3524 | |
| 24-well Transwell Insert | Corning | 3470 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | STEMCELL Technologies | 07060 | |
| 3,3',5-triiodo-l-thyronine | Sigma | T-074 | |
| 37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O | Sigma | 533998 | |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | 5811000320 | |
| 5 mL polypropylene tubes (flow tubes) | BD | 352058 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| A-4-62 Rotor | Eppendorf | 5810709008 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | Cell Dissociation Reagent |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | Liquid Overlay |
| Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | Multiplex Manager Software |
| Butterfly Needle 21 G | BD | 367287 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Crystal Violet | Merck | C6158 | |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Fixation and Permeabilization Solution |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Neutral Protease |
| DMEM/High Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | |
| DMEM/Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
| dNTP Mix | Promega | U1515 | dNTP Mix |
| EMEM (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2003 | |
| EVOM voltohmmeter device | WPI, Sarasota, FL, USA | 300523 | |
| FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 1x Lysing Solution |
| Falcon tube 15 mL | CellStar | 188271 | 15 mL tube |
| Falcon tube 50 mL | CellStar | 227261 | 50 mL Tube |
| Fast Start Essential DNA Probes Master | Roche | 6402682001 | qPCR Master Mix |
| Ficoll Paque Premium | Research Instruments | 17544203 | Density Gradient Media |
| H3N2 (A/Aichi/2/1968) | ATCC | VR547 | |
| H3N2 M1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3' | |
| H3N2 M1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3' | |
| H3N2 NS1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3' | |
| H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3' | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | |
| hNESPCs | Human Donors | NA | |
| Human Epithelial Growth Factor | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
| Hydrocortisone | STEMCELL Techonologies | 7925 | Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR Instrument |
| Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation | Thermofisher | L23105 | Viability Stain |
| MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | Immunology Multiplex Assay |
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | |
| M-MLV 5x Buffer | Promega | M1705 | RT-PCR 5x Buffer |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | M1706 | Reverse Transcriptase |
| N-2 supplement | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
| NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
| Perm/Wash Buffer | BD | 554723 | Permeabilization Wash Buffer |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Basal Medium | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| Random Primers | Promega | C1181 | Random Primers |
| Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor | Promega | N2511 | RNase Inhibitor |
| RNA Lysis Buffer | Qiagen | Part of 52904 | |
| RPMI 1640 (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2001 | |
| STX2 electrodes | WPI, Sarasota, FL, USA | STX2 | Electrode |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| TPCK Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Trypan Blue | Hyclone | SV30084.01 | |
| Viral RNA Extraction Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA Extraction Kit |
| V-Shaped 96-well Plate | Corning | 3894 |
References
- Monto, A. S. Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness. Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).
- Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L.
- Gerdil, C. The annual production cycle for influenza vaccine. Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).
- Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. Economic burden of seasonal influenza in the United States. Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).
- Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M.
- Guo, Y. R., et al. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status. Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).
- Guan, W. J., et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).
- van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells are activated during human viral infections. Nature Communications. 7, 11653 (2016).
- Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. Gammadelta T cells: first line of defense and beyond. Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).
- van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo. Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).
- Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).
- Yan, Y., et al. Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).
- Luukkainen, A., et al. A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium. Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).
- Tan, K. S., et al. RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications. Cells. 8 (9), 986 (2019).
- Kim, N., et al. Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells. Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).
- Tan, K., et al. In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses. Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).
- Tan, K. S., et al. Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures. Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).
- Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay,MM_NF-HCP2MAG-62K-PX23?#documentation (2020).
- Gamage, A. M., et al. Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).
- Zhao, X. N., et al. The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro. American Journal of Rhinology & Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).
