Summary
Denne protokollen beskriver en undersøkelse av de tidlige interaksjonene mellom viralt infiserte neseepitelceller og medfødt celleaktivering. Individuelle undergrupper av immunceller kan skille seg ut basert på deres aktivering som svar på virusinfeksjoner. De kan deretter undersøkes nærmere for å fastslå deres effekter på tidlige antivirale responser.
Abstract
De tidlige interaksjonene mellom neseepitelandslaget og de medfødte immuncellene under virusinfeksjoner forblir et underutforsuppet område. Betydningen av medfødt immunitetssignalering ved virusinfeksjoner har økt betydelig ettersom pasienter med luftveisinfeksjoner som viser høy medfødt T-celleaktivering, viser et bedre sykdomsutfall. Derfor tillater dissekering av disse tidlige medfødte immuninteraksjonene belysningen av prosessene som styrer dem og kan lette utviklingen av potensielle terapeutiske mål og strategier for demping eller til og med forhindre tidlig progresjon av virusinfeksjoner. Denne protokollen beskriver en allsidig modell som kan brukes til å studere tidlig krysstale, interaksjoner og aktivering av medfødte immunceller fra faktorer utskilt av viralt infiserte luftveisepitelceller. Ved hjelp av et H3N2 influensavirus (A/Aichi/2/1968) som representativ virusmodell, har medfødt celleaktivering av samkulturerte perifere mononukleære celler i perifert blod (PBMCer) blitt analysert ved hjelp av strømningscytometri for å undersøke undergruppene av celler som aktiveres av de løselige faktorene som frigjøres fra epitelet som svar på virusinfeksjonen. Resultatene viser gating strategien for å differensiere undergrupper av celler og avsløre de klare forskjellene mellom de aktiverte populasjonene av PBMCs og deres krysstale med kontroll og infisert epitel. De aktiverte delsettene kan deretter analyseres ytterligere for å bestemme deres funksjoner samt molekylære endringer som er spesifikke for cellene. Funn fra en slik krysstaleundersøkelse kan avdekke faktorer som er viktige for aktivering av vitale medfødte cellepopulasjoner, som er gunstige for å kontrollere og undertrykke utviklingen av virusinfeksjon. Videre kan disse faktorene brukes universelt på forskjellige virussykdommer, spesielt for nylig fremvoksende virus, for å dempe virkningen av slike virus når de først sirkulerer i naive menneskelige populasjoner.
Introduction
Respiratoriske virus er kanskje blant de mest utbredte patogenene som forårsaker alvorlig helsehjelp og økonomisk byrde. Fra de periodiske globale utbruddene av fremvoksende epidemiske stammer (f.eks. H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) til de sesongmessige belastningene av influensa hvert år, er virus en konstant trussel mot folkehelsen. Selv om vaksiner utgjør hoveddelen av responsen på disse globale folkehelseutfordringene, er det nøkternt å merke seg at disse mottiltakene bare er responsive 1,2. Videre er en forsinkelse mellom fremveksten av en ny smittsom stamme og den vellykkede utviklingen av vaksinen uunngåelig3, noe som fører til en periode da tiltak tilgjengelig for å dempe spredningen av viruset er svært begrenset.
Disse forsinkelsene understrekes videre av kostnadene som påføres samfunnet økonomisk og sosialt. Sesonginfluensaen alene er ansvarlig for omtrent 8 milliarder dollar i indirekte kostnader, 3,2 milliarder dollar i medisinske kostnader og 36,3 tusen dødsfall i USA årlig4. Dette er før vurdering av forskningskostnadene som er nødvendige for å finansiere vaksineutvikling. Epidemiske utbrudd har enda mer alvorlige effekter på samfunnet, forsterket av den økende globaliseringsraten hvert år, noe som fremgår av de globale forstyrrelsene forårsaket av fremveksten og rask spredning av alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronovirus 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.
Nyere studier har vist at infiserte pasienter som har en større populasjon av aktiverte medfødte T-celler har en tendens til å ha et bedre sykdomsutfall 8,9,10. Videre er den medfødte T-cellepopulasjonen kategorisert i flere undergrupper: de mucosal-assosierte invariante T (MAIT) cellene, Vδ1 γδ T-celler, Vδ2 γδ T-celler og de naturlige killer T (NKT) cellene. Disse undergruppene av medfødte T-celler viser også heterogenitet i populasjonene, noe som øker kompleksiteten i interaksjonene mellom cellepopulasjonene som er involvert i den medfødte immunresponsen11. Derfor kan mekanismen som aktiverer disse medfødte T-cellene og kunnskapen om de spesifikke undergruppene av medfødte T-celler gi en annen måte å forske på for å begrense de smittsomme effektene av disse virusene på den menneskelige verten, spesielt i løpet av vaksineutviklingsperioden.
Epitelceller infisert av influensa produserer faktorer som aktiverer medfødte T-celler raskt 12,13,14. Basert på dette funnet, har denne kontaktfrie Air-Liquid Interface (ALI) samkulturmodellen som mål å etterligne de tidlige kjemiske interaksjonene (mediert av løselige faktorer utgitt av det infiserte epitellaget) mellom det infiserte neseepitellaget og PBMC-ene under tidlig infeksjon. Den fysiske separasjonen mellom neseepitelelaget (dyrket på membraninnlegg) og PBMC-ene (i kammeret under) og epitelintegriteten forhindrer direkte infeksjon av PBMC-ene av viruset, noe som gir en detaljert studie av effekten av epitelavledede løselige faktorer på PBMC-ene. De identifiserte faktorene kan derfor undersøkes nærmere for deres terapeutiske potensial i å indusere den aktuelle medfødte T-cellepopulasjonen som kan beskytte mot influensainfeksjon. Dette dokumentet har derfor detaljert metodene for å etablere en medkultur for studiet av medfødt T-celleaktivering fra epitel-avledede løselige faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Se tabell 1 for oppskrifter på medier som brukes i denne protokollen.
MERK: HNECS dyrket på 12-brønns transwell har vist seg å vokse til mer optimal tykkelse for løselige faktorer for å nå basalkammeret lett når smittet med influensavirus. Derfor anbefales bruk av 12-brønns transwell for samkultur.
1. Etablering av 3T3 materlaget
- Etablering fra frosne aksjer
- Tine en kryopisial av NIH /3T3 fibroblaster fra frosne lagre. Legg til innholdet i kryo toårig til 2 ml komplett Dulbeccos Minimal Essential Media (DMEM) og resuspend cellene.
- Sentrifuge i 5 min ved 300 × g og romtemperatur/trykk (rtp), og fjern supernatanten. Resuspend cellene i fullstendig DMEM.
- Tell cellene ved hjelp av trypan blå flekker. Tilsett 10 μL trypan blå til 10 μL av den resuspenderte cellefjæringen. Bland grundig, og tilsett 10 μL av suspensjonen til et hemocytometer for å telle cellene.
- Frøceller med en tetthet på 1 × 104 celler/cm2 i en passende kulturrett (f.eks. T75-kolbe). Inkuber den resulterende kulturflasken i 3 dager ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære .
- Mitomycin C-behandling
- Ved 3 dager, sørg for at samløpet er 60% -80%, fjern mediet og vask cellene med 1x fosfatbufret saltvann (PBS).
MERK: Det er viktig at 3T3-materlaget ikke når full sammenløp; Ellers vil mitomycin C-behandlingen ikke være effektiv. - Tilsett mitomycin C-supplert komplett DMEM i kolben, og inkuber i 3,5 timer ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære . Fjern det mitomycin C-inneholdende mediet, og vask cellene 2x med 1x PBS.
- Ved 3 dager, sørg for at samløpet er 60% -80%, fjern mediet og vask cellene med 1x fosfatbufret saltvann (PBS).
- Såing 3T3 celler i 6-brønns plater
- Tilsett 3 ml 1x trypsin-EDTA i kolben i 3-5 min for å fjerne tilknytningen til cellene. Samle de disassosierte cellene i et friskt 15 ml rør. Sentrifuger 15 ml-røret i 5 min ved 300 × g, rtp; kast supernatanten. Resuspend cellene i fullstendig DMEM.
- Tell cellene ved hjelp av trypan blå flekker. Frø cellene i en 6-brønns plate på 7,5 × 10 5-2,5 × 106 celler / brønn. Inkuber platen over natten ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære.
MERK: 3T3-materlaget anses som klart hvis cellene er friske. På dette tidspunktet, frø den menneskelige nasal epitelial stem / forfedre celler (hNESPCs) på materlaget for ekspansjon. - Legg komplett DMEM til kolben og inkuber ved 37 °C, 5 % CO2 over natten for 3T3 celler for å komme seg etter mitomycin C-behandling.
2. Etablering av menneskelig nese epitelcelle (hNEC) kultur
MERK: Kliniske prøver bør fås fra pasienter som er fri for symptomer på øvre luftveisinfeksjon.
- Behandling av nesevev i encellet suspensjon
- Vask nesevevet i 1x Dulbeccos PBS (dPBS) (PBS uten Mg2+ og Ca2+) som inneholder 100 μL/ml av en antibiotika-antimykotisk blanding. Skjær vevet i små fragmenter, og behandle prøven i 10 mg/ml nøytral protease over natten ved 4 °C med risting.
- Sentrifuge i 5 min ved 200 × g, og fjern supernatanten etter sentrifugering. Inkuber pelletsen i 1-2 ml 1x trypsin-EDTA (37 °C, 15 min), og slukk ved å legge til et volum foster bovint serum som tilsvarer 10% av volumet i røret.
- Mekanisk dissosiere det fordøyde vevet i encellede aggregater ved pipettering, og send deretter den resulterende suspensjonen gjennom en 70 μm cellesil. Resuspend cellene i fullstendig DMEM.
MERK: Etter dette trinnet er cellesuspensjonen en blanding av terminalt differensierte celler og stamceller som kalles humane neseepitelformede stam-/stamceller (hNESPCer). Målet med de påfølgende trinnene er å velge og berike hNESPC-befolkningen fra blandingen av forskjellige cellepopulasjoner.
- Såing av en encellet suspensjon på 3T3-materlaget for valg av hNESPCer
- Sentrifuger cellesuspensjonen fra trinn 2.1.3 (300 × g, 5 min, rtp), og fjern supernatanten. Resuspend cellene i 3-5 ml middels 3.
MERK: Medium 3 er formulert for å fremme selektiv vekst av hNESPCer. - Tell cellene via trypan blå flekker. Frø 1 x 106 celler i 2 ml middels 3 per brønn på 6-brønnsplate som inneholder forberedt 3T3 materlag etter fjerning av mediet i 6 brønnplaten. Inkuber den resulterende samkulturen ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære .
MERK: Etter sådd må du passe på at du ikke agiterer platen, da det vil påvirke vedlegget til hNESPCene. - Bytt medium 3 (2 ml) hver 2-4 dager ved å fjerne det gamle mediet helt og erstatte det med friskt medium 3.
MERK: Medium endres for å fylle opp næringsstoffer og for å forhindre at altfor sure forhold påvirker veksten av hNESPCene negativt. Intervallet mellom hvert medium endres avhengig av hvor surt (gult) mediet blir. Intervaller bør forkortes hvis mediet blir surt raskt. - Etter 7-10 dager må du være oppmerksom på at hNESPCer har en samtidighet som er egnet for overføring av dem til membraninnlegg. Se figur 1 for representativ morfologi av hNESPCer ved 3 forskjellige tidspunkter (2 dager, 5 dager og 10 dager).
- Sentrifuger cellesuspensjonen fra trinn 2.1.3 (300 × g, 5 min, rtp), og fjern supernatanten. Resuspend cellene i 3-5 ml middels 3.
- Overføre hNESPCer til membraninnlegg
MERK: På grunn av mitomycin C-behandlingen vil 3T3-materlaget sakte forringes over hNESPC-utvidelsesperioden. Dette vil resultere i en svekket vedheft til overflaten av brønnen, slik at deres løsrivelse ved å skylle med en pipette, og etterlater bare de sunne hNESPCene.- Fjern mediet, og tilsett 500 μL 1x dPBS til hver brønn. Skyll cellene 3x med en mikropipette for å løsne 3T3-cellene, og kast 1x dPBS. Vær oppmerksom på under mikroskopet at de runde hNESPCene forblir mens det spindelformede 3T3-materlaget løsnes.
- Tilsett 500 μL av et celledisassosiasjonsreagens per brønn, og inkuber ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære i 5–10 minutter, eller til hNESPCene har løsnet fra brønnoverflaten.
- Samle hNESPC suspensjon, sentrifuge (300 × g, 5 min, RTP), og fjern supernatanten.
- Resuspend pellets i medium 3. Tell cellene via trypan blå flekker. Frø 3 × 104 celler i 150 μL middels 3 per membraninnsats (24-brønnsplate) eller 1 × 105 celler i 300 μL middels 3 per membraninnsats (12-brønnsplate) (figur 2). Inkuber cellene ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære .
- Bytt medium (medium 3) av de apikale og basale kamrene hver annen dag. Naviger i en pipettespiss mellom membraninnsatsens støttearmer for å få tilgang til basalkammeret, fjern det gamle mediet, og gjeninnfør deretter friskt medium ved samme metode. Selv om det apikale kammeret er lett tilgjengelig, må du passe på å ikke forstyrre det voksende hNESPC-laget.
MERK: Ikke forstyrr mediet i det apikale kammeret i minst 2 dager etter sådd, da cellene trenger tid til å feste seg til membranen.
- Differensiering av hNESPCer i hNECer
- Når hNESPCer når 100% samløp (ca. 3-7 dager fra såing på membraninnsatsen), start ALI-kulturen. Endre basalmediet til differensieringsmediet, og fjern mediet fra det apikale kammeret. Bare legg medium til basalkammeret uten å legge det til det apikale kammeret når du bytter medium hver 2-3 dager, som angitt i figur 3 og trinn 2.3.5.
MERK: Medium endres til differensieringsmedium for å fremme differensiering av hNESPCene til hNECs i ALI. HNESPCene tar omtrent 3-4 uker å nå full modenhet til å bli hNECs i ALI, og da ville cellene ha vokst til et flerlags med forskjellige populasjoner av celler i hvert lag. Cilia bør også observeres ved en forstørrelse på 400x (cilia kan identifiseres ved deres slagbevegelse, noe som får mikroskopfeltet til å virke som om det vibrerer). På dette tidspunktet er cellene klare til å brukes til samkultureksperimentene. Se figur 4 for tverrsnittet av et fullstendig differensiert hNEC-lag. - Etter å ha oppnådd modne hNECer, vask cellene i det apikale kammeret 3x med 1x dPBS med 2-3-dagers intervaller i 1 uke før samkultureksperimentet. Synergiser vasketrinnet med basalmediet endres, og utfør vaskene som følger.
- Tilsett 50 μL (24-brønn)/150 μL (12-brønn) av 1x dPBS i det apikale kammeret i membraninnsatsen, og inkuber cellene ved 37 °C i 10 minutter. Fjern dPBS etter 10 min inkubasjon for å fjerne akkumulert slim og døde celler i løpet av differensiering.
MERK: Avhengig av eksperimentets art, kan natriumbikarbonatoppløsning brukes til å vaske av slimlaget helt. Men for virusinfeksjon i samkultureksperimenter beholdes slimlaget, og bare overflødig slim fjernes med dPBS-vask. Denne oppbevaringen er å etterligne det fysiologiske slimlaget som er tilstede på neseepillet som vil samhandle med den innkommende virusinfeksjonen.
- Tilsett 50 μL (24-brønn)/150 μL (12-brønn) av 1x dPBS i det apikale kammeret i membraninnsatsen, og inkuber cellene ved 37 °C i 10 minutter. Fjern dPBS etter 10 min inkubasjon for å fjerne akkumulert slim og døde celler i løpet av differensiering.
- Når hNESPCer når 100% samløp (ca. 3-7 dager fra såing på membraninnsatsen), start ALI-kulturen. Endre basalmediet til differensieringsmediet, og fjern mediet fra det apikale kammeret. Bare legg medium til basalkammeret uten å legge det til det apikale kammeret når du bytter medium hver 2-3 dager, som angitt i figur 3 og trinn 2.3.5.
3. Transepithelial elektrisk motstand (TEER) måling
MERK: Bekreftelse av epitelintegritet er viktig for å sikre at et intakt og sunt epitellag oppnås. Et intakt epitellag bestemmes gjennom TEER-måling utført på 4 tilfeldige brønner ved hjelp av et voltohmmeter.
- Skyll elektroden med 70% etanol, og steriliser den med ultrafiolett lys i 15 minutter før bruk for å sikre sterilitet. Skyll med 1x dPBS etter sterilisering.
- Tilsett 100 μL (for 24-brønn) eller 300 μL (for 12 brønn) av 1x dPBS til det apikale kammeret i membraninnsatsen. Inkuber platen ved 37 °C i 10 minutter; Deretter fjerner du dPBS.
- For hver brønn som skal måles, lag en ubrukt brønn med 1 ml (for 24 brønn) eller 3 ml (for 12 brønn) for forhåndsvarslet (til 37 °C) differensieringsmedium. Plasser membraninnsatsen i den forberedte brønnen, og tilsett 200 μL (for 24-brønn) eller 600 μL (for 12 brønn) forhåndsvarslet differensieringsmedium til det apikale kammeret. Likevekt ved 37 °C (underlagt inkubasjonstemperaturen til den typen virus som tilsettes, for eksempel 35 °C for influensa) i 15 minutter.
MERK: Klargjør en tom (tom membraninnsats) på samme måte for beregning av TEER. - Likevekt et 15 ml rør med forhåndsvarslet differensieringsmedium ved samme temperatur i 15 min også. Plasser elektrodene i 15 ml-røret, og slå på voltohmmeteret.
MERK: På dette tidspunktet skal avlesningen være 0 motstand, da elektrodene er i samme medium. Hvis en annen avlesning oppnås, likevekt elektroden i 15 ml-røret til avlesningen er 0. - Start fra det tomme, plasser elektrodene i hver brønn slik at en elektrode er nedsenket i det apikale kammermediet og den andre i basalkammermediet. Registrer lesingen bare når en konstant avlesning er oppnådd i en periode på minst 5 minutter.
- Etter hver måling, vask elektroden med PBS før neste måling. For hver godt testet, ta målinger for tre prøver i forskjellige membranposisjoner. Hvis du vil beregne netto TEER for hver prøve, trekker du bakgrunnsmotstanden, gitt av den tomme membraninnsatsen, fra hver måling.
- Beregn den totale TEER-lesingen for en brønn ved hjelp av følgende formel:
Epitelial integritet (Ωcm2) = Netto TEER(ohm) × Membranområde (cm2)
MERK: TEER-verdiene til hNECer for virusinfeksjonsforsøk bør være > 1000 Ωcm2 13,15,16.
4. Isolering av perifere blodmonycytter og NK-celler
MERK: Blodprøver bør fås fra friske frivillige og brukes på samme isolasjonsdag.
- Samle 30-40 ml fullblod fra hver donor i 10 ml blodoppsamlingsrør.
- Isoler PBMCer ved hjelp av tetthet gradient sentrifugering, og få PBMCs fra buffy frakk etter følgende trinn (se også tabellen over materialer).
- Bland grundig ~ 10 ml blod fra blodoppsamlingsrøret i en vacutainer før du fortynner med et likt volum balansert saltoppløsning (PBS).
- Tilsett 15 ml tetthetsgradientmedium til bunnen av et 50 ml rør.
MERK: Forholdet mellom tetthetsgradient middels til fortynnet blod skal være 2:3-3,5. - Lag 35 ml fortynnet blod på tetthetsgradientmediet med en pipettepistol (med dispenserinnstillingen satt til lavest mulig) ved å vippe røret med 45° og la det fortynnede blodet falle dråpevis på den indre veggen av røret slik at laget av tetthetsgradientsmedium ikke forstyrres.
- Sentrifugelys ved 500 × g, 18-20 °C i 30 min (brems: av). Fjern og kast forsiktig det øvre plasmalaget uten å forstyrre det nedre laget.
- Overfør den buffy kappen til et nytt rør uten å blande det røde blodcellelaget, gradienttetthet middels lag eller buffy frakk. Når den buffy kappen er samlet i et nytt 50 ml rør, fyll opp volumet til 50 ml med 1x PBS.
- Sentrifugelys ved 800 × g, 18-20 °C, 8 min (brems: av), og fjern supernatanten med en pipettepistol. Resuspend cellepellet med 50 ml 1x PBS, og sentrifuge ved 120 × g, 18-20 °C, 10 min for å fjerne blodplater.
- Kast supernatanten ved pipettering, uten å forstyrre cellepellet.
MERK: Siden cellepelletet kan være løst, er det ikke tilrådelig å kaste supernatanten ved å helle. - Resuspend cellepellet med komplett RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium. Utfør et celleantall ved å tilsette 10 μL eddiksyre med metylenblå til 10 μL av den resuspenderte cellesuspensjonen. Bland grundig, og tilsett 10 μL av blandingen til et hemocytometer for å telle cellene.
- Fortynn PBMCer med komplett RPMI-medium til en tetthet på 2 × 106/ml (for 24-brønn) eller 4 × 106/ml (for 12-brønn).
5. hNEC Virusinfeksjon og overgang til hNEC:PBMC co-kultur
MERK: H3N2 (A/Aichi/2/1968) brukes som representativ infeksjonsstamme i denne protokollen. Multiplisitet av infeksjon (MOI) av 0.1 brukes som representativ MOI i denne protokollen.
- Dag 0 (Infeksjon av hNEC)
MERK: En brønn fra hNECene som vokser fra samme donor, brukes til å oppnå et representativt celleantall for hver brønn som brukes i eksperimentet.- I den representative brønnen legger du til 150 μL 1x trypsin-EDTA til det apikale kammeret i membraninnsatsen og 350 μL 1x trypsin-EDTA til basalkammeret, og inkuberer ved 37 °C i 10 minutter, eller til cellene løsner fra membranen.
- Skyll cellene på membranen ved å pipettere opp og ned, og samle suspensjonen i et 1,5 ml sentrifugerør. Tilsett 200 μL fullstendig DMEM for å slukke trypsinaktivitet. Tell celler via trypan blå farging for å oppnå celleantall per brønn.
- Beregn den nødvendige MOI av viruset basert på celleantall per brønn, og fortynn virusbestanden tilsvarende med fullstendig RPMI på is.
MERK: MOI 0,1 av 1,26 × 106 hNEC per brønn = 1,26 × 105 H3N2 virale partikler per brønn i 30 μL (for 24-brønn) / 100 μL (for 12 brønn) - For de resterende brønnene for infeksjonsforsøket, tilsett 50 μL (for 24-brønn) / 150 μL (for 12 brønn) av 1x dPBS i de apikale kamrene i membraninnsatsene, inkuber ved 37 °C i 10 minutter, og fjern 1x dPBS.
- Endre basalmediet i membraninnsatsene for å fullføre RPMI-mediet ved å overføre innsatsene til en ny plate med fullstendig RPMI tilsatt brønnene (350 μL (for 24-brønn) / 700 μL (for 12-brønn)).
MERK: Når hNESPCer er fullstendig differensiert til hNECer, er de tolerante/tillatte for forskjellige medier i opptil 72 timer, uten endringer i morfologi eller organisering når mediet byttes til RPMI12. RPMI brukes til å støtte veksten og vedlikeholdet av PBMC-befolkningen. - Tilsett den tilberedte 30 μL (for 24-brønn)/100 μL (for 12-brønn) av viruset inoculum i det apikale kammeret i membraninnsatsen, inkuber ved 35 °C i en 5% CO2-atmosfære i 1 time, og fjern det virale inokulumet fra det apikale kammeret.
- Endre basal medium av membran innsats til frisk komplett RPMI medium og inkubere for ved 35 °C i en 5% CO2 atmosfære i 24 timer.
- Dag 1 (etablering av hNECs + PBMCs co-kultur)
- Frø det nødvendige antallet PBMCer i 150 μL (for 24-brønn) / 300 μL (for 12-brønn) av komplett RPMI-medium ved å direkte legge PBMC-suspensjonen inn i basalkammeret til hver brønn med uinfiserte eller infiserte hNECer fra dag 0 (1,5 × 106 for 24-brønnsplater og 3 × 106 for 12-brønnsplater). Inkuber ved 37 °C i 24/48 timer.
MERK: Det endelige volumet i basalkammeret etter etableringen av samkulturen er 500 μL (for 24-brønn) / 1000 μL (for 12-brønn).
- Frø det nødvendige antallet PBMCer i 150 μL (for 24-brønn) / 300 μL (for 12-brønn) av komplett RPMI-medium ved å direkte legge PBMC-suspensjonen inn i basalkammeret til hver brønn med uinfiserte eller infiserte hNECer fra dag 0 (1,5 × 106 for 24-brønnsplater og 3 × 106 for 12-brønnsplater). Inkuber ved 37 °C i 24/48 timer.
- Dager 2-3 (høsting av PBMC 48/72 h post-viral infeksjon)
- Innsamling av apikale supernatanter (48/72 h post-viral infeksjon)
- Tilsett 50 μL (for 24-brønn) / 150 μL (for 12 brønn) av 1x dPBS til hvert apikale kammer, og inkuber ved 37 °C i 10 minutter. Samle 1x dPBS i 1,5 ml rør. Aliquot 25 μL (for 24-brønn) / 50 μL (for 12-brønn) av supernatanten for plakkanalyse i et nytt 1,5 ml rør, og umiddelbart fryse både lageret og aliquots ved -80 °C.
- Innsamling av cellulær RNA fra hNECs (48/72 h post-viral infeksjon)
- Overfør membraninnsatsen til en ren brønn, tilsett 300 μL (for 24-brønn)/600 μL (for 12 brønn) RNA lysisbuffer til det apikale kammeret, og inkuber ved rtp i 5 min. Samle supernatanten i et 1,5 ml sentrifugerør, og oppbevar det ved -80 °C til RNA ekstraksjon for molekylær analyse.
- Høsting av PBMCer (48/72 h post-viral infeksjon)
- Med den brede basen av en steril pipettespiss skraper du forsiktig overflaten av brønnen for å løsne de aktiverte PBMCene som kan festes til brønnoverflaten. Samle basalmediet som inneholder PBMCer i et 2 ml sentrifugerør.
- Skyll brønnene 2x med 300 μL 1x dPBS, og samle vasken i samme 2 ml rør. Sentrifuger 2 ml-røret (500 × g, 5 min, rtp), og samle supernatanten i et friskt 2 ml rør uten forstyrrende cellepellet. Oppbevar supernatanten ved -80 °C for cytokin- og kjemokinanalyse; cellepellet i 200 μL 1x dPBS.
- Innsamling av apikale supernatanter (48/72 h post-viral infeksjon)
6. Flowcytometri
MERK: Denne delen av protokollen fortsetter direkte fra forrige avsnitt ved hjelp av PBMC-cellesuspensjonen fra trinn 5.3.3.2. Sørg for minimal lyseksponering under følgende trinn i denne delen. Et prøvepanel med overflateflekkmarkører finnes i tabell 2.
- Overflatefarging
- Overfør den resuspenderte PBMC-cellepelleten til en 96 V bunnbrønnplate. Sentrifuger lysat ved 800 × g i 3 min, og fjern supernatanten.
- Inkuber alle PBMC-ene (unntatt de "unstained") med 100 μL av en levedyktighetsflekk i 15 min ved rtp. Fyll opptil 200 μL med 150 μL magnetisk aktivert cellesorteringsbuffer (MACS). Sentrifuger lysat ved 800 × g i 3 min, og kast supernatanten.
- Forbered et panel av overflatefargingsantistoffer av interesse med passende fortynningsforhold og et sluttvolum på 50 μL per reaksjon (fyll på med MACS-buffer for å oppnå det endelige volumet). Utfør overflatefarging ved å tilsette 50 μL av den tilberedte antistoffblandingen til cellene ved hjelp av en flerkanals pipette. Inkuber ved 4 °C i 15 minutter i mørket.
- Vask ved å legge til 150 μL MACS-buffer. Sentrifuger lysat ved 800 × g i 3 min, og kast supernatanten. Hvis intracellulær farging ikke er nødvendig, fortsett direkte til 15 min inkubasjon i trinn 6.3.
- Intracellulær farging (om nødvendig)
- Tilsett 100 μL av en fikserings- og permeabiliseringsløsning til hver brønn. Inkuber ved 4 °C i 20 minutter i mørket. Fyll opp brønnene med 100 μL 1x MACS-buffer.
- Sentrifuge (800 × g, 3 min, 25 °C), og fjern supernatanten. Gjenta vasken ved å tilsette 200 μL 1x permeabilisering Vaskebuffer. Sentrifuge (500 × g, 3 min, 25 °C), og fjern supernatanten.
- Forbered fortynning for antistoffpanelet av interesse for å oppnå et sluttvolum på 50 μL ved hjelp av 1x permeabilisering Vaskebuffer. Inkuber på is i 30 min i mørket. Tilsett 200 μL 1x permeabilisering Vaskebuffer.
- Sentrifuger cellene (800 × g, 3 min, 4 °C), og fjern supernatanten. Bruk cellene på nytt i 100 μL fluorescensaktivert cellesorteringsbuffer.
- Pipette 200 μL av en lysløsning i hver brønn. Inkuber i 15 min på rtp. Sentrifuger lysat ved 800 × g i 3 min og kast supernatanten.
- Resuspend cellepellets i 200 μL MACS buffer. Utfør strømningscytometri i henhold til innstillingene som er skissert tidligere13, eller oppbevar ved 4 °C i mørket.
7. Bestemmelse av cytokin- og kjemokinnivåer
- Behandle 25 μL av basalkammeret supernatant ved hjelp av en immunologi multipleksanalyse i henhold til produsentens protokoll18.
- Beregn konsentrasjonen av hver analytt ved hjelp av multiplex manager programvare ved hjelp av en kurve-tilpasning algoritme (5 parametere) for standardkurven.
8. Vurdering av virusforurensning
- Trekk ut viral RNA ved hjelp av et ekstraksjonssett på 4 sett med løsninger: lager H3N2-løsningen, MOI 0.1-fortynning for infeksjon, 10x seriell fortynning av MOI 0.1 og basalmediet fra prøvene (både 48 og 72 timer post-viral infeksjon)12.
- Velg ikke-strukturelt gen (NS1) og matrise (M1) som mål for polymerasekjedereaksjon (PCR) (se materialtabellen for primere som brukes i det representative eksperimentet).
- Utfør omvendt transkripsjon-PCR (RT-PCR) (42 °C, 60 min) for å konvertere viral RNA til cDNA før du utfører kvantitativ PCR (qPCR) for å måle NS1- og M1-nivåer som en proxy for viral tilstedeværelse, og korreler nivåene til standardkurven oppnådd fra RT-qPCR utført på 10x seriell fortynning av MOI 0.1 aliquot. Se tabell 3 for sammensetningen av reaksjonsblandingene, og bruk følgende forhold: preinkubering ved 95 °C i 10 minutter, etterfulgt av en 3-trinns forsterkning i 40 sykluser: 95 °C i 10 s, 60 °C i 10 s, 72 °C i 30 s; smeltekurve: 95 °C i 10 s, 65 °C i 60 s og 97 °C i 1 s.
9. Plakettanalyse
- Dag 0: såing MDCK (Madin Darby Canine Kidney) i 24-brønns plater
- Fjern mediet fra en T75-kolbe med sammenfølende MDCK-celler. Vask 2x med 1x PBS for å fjerne alle spor av serum. Prøv MDCK-cellene ved å tilsette 10 ml trypsin og inkubere ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære i 20–30 minutter til cellene løsner.
MERK: Ikke trykk på kolben, da dette kan føre til klumping. - Pipette cellefjæringen inn i et 15 ml rør som inneholder 2 ml komplett Eagles Minimal Essential Medium (EMEM). Sentrifuge (300 × g, 5 min, rtp), og fjern supernatanten.
- Resuspend cellene i 6 ml fullstendig EMEM. Tell cellene ved trypan blå farging.
- Fortynn MDCK-cellefjæringen til en konsentrasjon på 1 × 105 celler/ml, og frø 1 ml av den fortynnede suspensjonen i hver brønn med en steril 24-brønnsplate. Inkuber ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære i 24 timer for å oppnå en samtidig monolayer av MDCK-celler i hver brønn.
- Fjern mediet fra en T75-kolbe med sammenfølende MDCK-celler. Vask 2x med 1x PBS for å fjerne alle spor av serum. Prøv MDCK-cellene ved å tilsette 10 ml trypsin og inkubere ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære i 20–30 minutter til cellene løsner.
- Dag 1: infeksjon av MDCK-celler
- Forbered infeksjonsmediet. Fjern mediet fra MDCK-monolageren i 24-brønnsplaten, og vask 2x med 1x dPBS. For den andre vasken, la PBS i brønnene mens du forbereder seriell fortynning av viruset.
- Tin virusprøvene på is, og fortynn dem serielt i en 24-brønnsplate for å oppnå serielle fortynninger fra 10-1 til 10-6.
MERK: Som et eksempel, fyll hver brønn i en 24-brønns plate med 270 μL infeksjonsmedium. - Tilsett 30 μL av virusprøven til den første brønnen på raden. Med en ny pipettespiss blander du godt og overfører til neste brønn på rad for å fortynne prøven med 10x. Fortsett til 10-6 fortynning er oppnådd; utfør trinn 9.2.1-9.2.3 for alle virusprøver.
- Fjern PBS fra MDCK-platen, og infiser i duplikat med 100 μL av de tilberedte virale fortynningene. For kontrollbrønner, tilsett 100 μL av infeksjonsmediet (uten viral prøve). Inkuber ved 35 °C i en 5 % CO2-atmosfære i 1 time, rist platen for å eliminere tørre flekker hvert 15.
- Fjern viral inoculum, og tilsett 1 ml flytende overlegg for hver brønn. Inkuber ved 35 °C i en 5 % CO2-atmosfære i 72 timer.
- Dag 4 (72 timer etter infeksjon): plakkvisualisering
- Fjern væskeoverlegget, og fest cellene med 4% formaldehyd i 1x PBS i 1 time. Fjern formaldehydoppløsningen, og vask en gang med 1x PBS eller destillert vann.
- Flekk de faste cellene ved å tilsette 1% krystallfiolett løsning i 15 min. Fjern det krystallfiolette fargestoffet, og vask cellene med rennende vann. Tørk platen ved rtp.
- Når det er tørt, telle plakk, og beregne viral titer i henhold til følgende formel:
Antall plakk × fortynningsfaktor = Antall plakk - Formingsenheter i 100 μL
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Selv om konvensjonelle T-celler danner det viktigste repertoaret av adaptiv immunrespons mot virusinfeksjon for å lette viral clearance, fungerer den medfødte T-cellepopulasjonen over et bredere spekter for å undertrykke virusbelastningen for effektiv clearance på et senere tidspunkt. Derfor skaper denne protokollen spesielt en robust tilstand for å studere medfødte T-celler, deres aktivering og deres funksjonelle befolkning etter influensainfeksjon, uten å trenge epitel- og immuncelleprøver fra samme donor. Denne protokollen kan også brukes på andre virus, selv om den kan være begrenset til virus med apikal utgivelse, det vil si at ingen virus skal komme inn i basallaget for å komme i kontakt med PBMC-rommet.
Basert på de representative resultatene i figur 1, kan denne protokollen bidra til å oppnå hNESPC-populasjoner som vokser fra en primærcellesuspensjon i et 3T3-materlag. Figur 1 inneholder et utvalg av den forventede progresjonen av hNESPCene etter hvert som de vokser på 3T3-materlaget. Disse cellene vil bli brukt til differensiering i ALI-kulturen for å oppnå flerlags hNECer, komplett med funksjonelle ciliated og begerceller (figur 4). Ved hjelp av hNECene kan medfødt T-celleaktivering undersøkes ved hjelp av strømningscytometri. Resultatene vist i figur 5 viser påvisning av MAIT-celle, γδ-T-celle og NK-cellepopulasjoner, som ble betydelig økt i samkultur som involverte hNECer infisert med influensavirus. Dette oppsettet kan deretter brukes på andre stammer av influensaviruset for å erte ut den universelle befolkningen på tvers av stammer, samt andre virus og deres evne til å aktivere medfødte T-cellepopulasjoner. I tillegg kan deteksjonspanelet også tilpasses i henhold til den medfødte immuncellepopulasjonen av interesse for å observere deres respektive aktivering under samkulturelle forhold med infiserte epitelceller.
Figur 1: hNESPCer dyrket på et 3T3-materlag 2/5/10 dager fra sådd. Dag 2: Legg merke til holmene til hNESPCer (et eksempel er avgrenset med en hvit pil) som skal observeres 2 dager etter sådd på 3T3-materlaget. Dag 5: Holmene som observeres på dag 2 skal nå være større (eksempler på øyer med hNESPCer er avgrenset av grønne sirkler), og 3T3-laget bør observeres å være degenererende. Dag 10: HNECPSs skal dominere hele platen med lite eller ingen 3T3 celler synlige. Skalastolper for dag 2 og dag 5 = 50 μm basert på en forstørrelse på 200x, skalalinje for dag 10 = 100 μm basert på en forstørrelse på 100x. Forkortelse: hNESPC = humane neseepiteringsstamme/stamceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Brønndiagrammer for membraninnlegg i 24-brønns og 12-brønnsplater. Legg merke til det middels volumet som skal brukes for hvert rom. hNESPCer er sådd i de apikale kamrene i membraninnleggene. Forkortelse: hNESPC = humane neseepiteringsstamme/stamceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Brønndiagrammer for membraninnlegg i 24-brønns- og 12-brønnsplater for ALI-samkulturvirksomhet. Legg merke til det middels volumet som skal brukes for hvert rom. Legg merke til forskjellene i middels volum som skal brukes for de forskjellige intervallene (2 dager / 3 dager) mellom middels endringer. Forkortelse: ALI = luft-væske grensesnitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: β4-Tubulin og MUC5AC co-flekk av et hNEC-lag. β4-Tubulin er farget i grønt, mens MUC5AC er farget i rødt. Kjernene er farget i blått med DAPI. MUC5AC indikerer tilstedeværelsen av slimproduserende begerceller, mens β4-tubulin indikerer tilstedeværelsen av cilia på ciliated celler. Skalastang = 20 μm basert på 600x forstørrelse. Forkortelser: hNEC = human nese epitelcelle; MUC5AC = mucin 5AC; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representative resultater av PBMCer inkubert med eller uten nasal epitel eller influensainfisert epitel i 24 timer. Aktivering av MAIT-, Vδ1 T-celler, Vδ2 T-celler og NK-celler ble bestemt av celletypespesifikke markører, inkludert Vα 7.2 TCR, Vδ1 TCR, Vδ2 TCR, CD56 og CD69-flekker. Verdiene over portene angir prosentandelen av CD69-positive celler. Forkortelser: PBMCs = perifere mononukleære celler i blodet; Epith = nasal epitel; FLU-Epith = influensainfisert epitel; MAIT = mucosal-assosierte konstante T-celler; NK = naturlig morder; TCR = T-celle reseptor; CD = differensieringsklynge. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Middels | Oppskrift | Komposisjon | Kommentarer |
| Middels 3 | DMEM/Næringsblanding F-12 | 500 ml | |
| Vekstfaktor for menneskelig epitel | 5 ng/ml | ||
| Insulin | 2,5 μg/ml | ||
| Koleratoksin | 0,1 nM | ||
| Hydrocortisone | 0,5 μg/ml | ||
| 3,3',5-triiodo-l-thyronin | 2 nM | ||
| N-2 supplement | 5 ml | 10 μL/ml | |
| Antibiotika-antimykotisk | 5 ml | ||
| Differensieringsmedier | PneumaCult-ALI Basal Medium | 441 ml | |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | 50 ml | ||
| Hydrokortisonløsning (200x) | 2,5 ml | ||
| 0,2 % (2 mg/ml, 1000 IE/ml) Heparin natriumsalt i fosfatbufret saltvann | 1 ml | ||
| Antibiotikum-antimykotika (100x) | 5 ml | ||
| PneumaCult-ALI Vedlikeholdstillegg (100x) | 500 μL | Skal bare legges til rett før bruk | |
| Komplett Dulbeccos minimale essensielle medium (DMEM) | DMEM/Høy glukose | 450 ml | |
| Varme-inaktivert foster Bovine Serum | 50 ml | ||
| Antibiotikum-antimykotika (100x) | 5 ml | ||
| Komplett Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium | RPMI 1640 (w L-Glutamin) | 445 ml | |
| Varme-inaktivert foster Bovine Serum | 50 ml | ||
| Antibiotikum-antimykotika (100x) | 5 ml | ||
| Komplett Eagles minimale essensielle medium (EMEM) | EMEM (w L-Glutamin) | 450 ml | |
| Varme-inaktivert foster Bovine Serum | 50 ml | ||
| Infeksjonsmedium | EMEM (w L-Glutamin) | 4 ml | |
| TPCK Trypsin (500 μg/ml) | 8 μL | Endelig TPCK Trypsin-konsentrasjon på 1 μg/ml | |
| Magnetisk aktivert cellesorteringsbuffer | 1x PBS | 498 ml | |
| 0,5 M EDTA | 2 ml | ||
| BSA (Tissue Culture Grade) | 2,5 g | ||
| Mitomycin C-supplert komplett DMEM | Fullstendig DMEM | 10 ml | |
| Mitomycin C | 500 μL | Mitomycin C (10 μg/ml) |
Tabell 1: Oppskrift på medier som brukes.
| Markør for celleoverflate | Fluorofor |
| Vδ1 T-celle reseptor (TCR) | Fluoresceinisiocyanat (FITC) |
| Vδ2 TCR | Peridinin-cholorphyll-protein (PerCP) |
| CD3 | V500 |
| CD8 | Allophycocyanin-cyanin 7 fargestoff (APC-Cy7) |
| CD14 | Phycoerythrin (PE)-CF594 |
| CD56 | Phycoerythrin (PE)-Cyanin 7 (Cy7) |
| CD69 | Strålende fiolett 421 (BV421) |
| CD83 | Allophycocyanin (APC) |
| CD161 | Strålende fiolett 605 (BV605) |
| Vα 7.2 | Phycoerythrin (PE) |
| CD38 | Strålende UltraFiolett 395 (BUV395) |
Tabell 2: Prøve overflateflekker.
| qPCR-reaksjonsblanding | qPCR-hovedmiks | 5 μL |
| Nukleasefritt vann | 3 μL | |
| Fremover primer (1 mM) | 0,5 μL | |
| Omvendt primer (1 mM) | 0,5 μL | |
| cDNA (12,5 ng/μL) | 1 μL | |
| Totalt reaksjonsvolum | 10 μL | |
| RT-PCR reaksjonsblanding | RT-PCR 5x-buffer | 2,5 μL |
| Tilfeldige primere (500 ng/μL) | 0,2 μL | |
| RNase-hemmer | 0,625 μL | |
| dNTP-blanding | 2,5 μL | |
| Omvendt transkripsjon | 0,5 μL | |
| RNA (200 ng/μL) | 1 μL | |
| Nukleasefritt vann | 12.675 μL | |
| Totalt reaksjonsvolum | 20 μL |
Tabell 3: Oppskrift på reaksjonsblandinger av polymerasekjedereaksjon med omvendt transkripsjon (RT-PCR) og kvantitativ PCR (qPCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medfødte immunresponser mot virus er et under-undersøkt studiefelt i antiviral behandling. Luftveis epitelceller og medfødte immunceller fungerer sammen for å undertrykke viral replikasjon under en infeksjon, i tillegg til å fungere som en determinant for overaktiv adaptiv respons hvis virusbelastningen ikke holdes i sjakk 12,13,17. Utviklingen av en relevant menneskelig modell for studiet av epitel-medfødt immunkorstale for å undersøke aktiveringen av medfødte immunceller for å gi en passende antiviral respons er imidlertid fortsatt en utfordring. Derfor representerer denne ALI-samkulturmodellen en allsidig teknikk som kan brukes til å vurdere en hel rekke interaksjoner mellom neseepitellaget og immuncellene. Ettersom denne modellen kombinerer in-vitro-differensierte hNECer, PBMC-aktiveringsanalyse via strømningscytometri og virusinfeksjon, har mange av de avgjørende trinnene blitt tydelig avgrenset for å sikre suksessen til denne protokollen. I tillegg kan ytterligere modifikasjon også gjøres til den delen av luftveiene som er involvert der in-vitro-differensierte celler fra både øvre og nedre luftveier kan brukes, og legger til et annet lag av allsidighet til protokollen.
Men når du arbeider med epitel-immun-immuncelle krysstale i virusinfeksjon, er det viktig at virusene ikke samhandler direkte med PBMCene for å identifisere tidlige lokale epitel-avledede løselige faktorer utgitt av hNECene. Derfor er denne modellen mer egnet for å undersøke virus med polarisert viral frigjøring, hvor virus bare knopper ut fra den apikale overflaten inn i det apikale kammeret, for eksempel influensavirus12 og SARS-CoV-2 virus19. I tillegg, for å forhindre lekkasje av apikale frigjøringsvirus i basalkammeret som kompromitterer eksperimentet, er et intakt epitellag med tilstrekkelig tykkelse viktig. Derfor er det viktig at TEER-måling og viral RNA-kvantifisering utføres for å sikre at resultatene er fri for virale lekkasjer inn i basalkammeret 13,16,20. En TEER-lesing av >1000 innebærer et intakt flerlags celler som passer for virus med polarisert frigjøring. basale medier skal være fri for viral RNA-forurensning 13,15,16. Imidlertid gjenstår nytten av modellen for toveis frigjøringsvirus, for eksempel rhinovirus, å bli utforsket16. Slike virus er ikke begrenset til å frigjøre sitt avkom på en polarisert måte og kan toveis frigjøre nye virus i både apikale og basale områder av epitelet. Ytterligere optimalisering er nødvendig før denne modellen kan brukes på virus med ikke-polarisert utgivelse.
Siden denne protokollen innebærer å arbeide med menneskelige prøver fra forskjellige individer, vil ingen to prøver av hNECer vise de samme egenskapene og svarene12,16. For eksempel kan viskositeten til slimet produsert av det terminalt differensierte hNEC-laget variere sterkt. Hastigheten på cilia-utviklingen kan også være forskjellig. Det er derfor viktig å utøve en viss fleksibilitet når man følger retningslinjene som er fastsatt i denne protokollen. Selv om det absolutt er mulig å bruke epitelcellelinjer, vil dette fjerne kompleksiteten (slim, interaksjoner mellom forskjellige celletyper) av interaksjonene mellom de forskjellige celletypene i epitellaget, noe som ville være ideelt for undersøkelse av hvordan epitelial krysstale påvirker responsen til PBMC-ene. En primær cellelinje er nødvendig for å etterligne fysiologien til nesevevet, hvor cellene er flerlags, og de forskjellige celletypene er lokalisert til sin egen individuelle nisje, selv om variasjon kan være et problem. Variasjon i denne forbindelse kan overvinnes ved å bruke encellet RNA-sekvensering for å skille og skille den heterogene populasjonen av celler.
Hvilke typer interaksjoner som kan vurderes er faktisk begrenset av opprinnelsen til PBMCene og hNECene. Når PBMC-ene og hNEC-ene er hentet fra forskjellige givere, er det avgjørende å sikre epitelintegritet og separasjon. Når PBMCer kommer i kontakt med hNECer, kan allogene immunreaksjoner oppstå. Derfor er de eneste interaksjonene som er relevante interaksjoner formidlet av løselige faktorer som kan passere gjennom membraninnleggene, som beskrevet i protokollen ovenfor. Men når begge populasjonene av celler stammer fra samme individ, har denne modellen et ekstra lag av nytte som konvensjonelle immuncellereaksjoner mellom hNECene og PBMC-befolkningen kan nå vurderes, inkludert T-cellemediert cytotoksisitet og antistoffmedierte responser. I tillegg kan epigenetiske studier også utføres for å undersøke hvordan modifikasjoner av genomet kan påvirke cytokingen/proteinuttrykk/sekresjon.
Videre kan forskjellige cellepopulasjoner legges til basalkammeret for å undersøke en bestemt befolkning nærmere. Dette kan utføres ved å isolere cellepopulasjonene av interesse (T-celler, NK-celler, monocytter) og introdusere dem til basalkammeret i stedet for PBMC-ene. Denne modellen kan imidlertid ikke brukes til å undersøke cellulære interaksjoner som krever direkte kontakt på grunn av separasjonen av de to cellepopulasjonene ved membranen. Som sådan kan undersøkelsen av adaptive immunresponser begrenses av denne detaljen. Til slutt tilbyr denne ALI-samkulturmodellen et allsidig utgangspunkt for in vitro-undersøkelsen av krysstale mellom nesevev og immunceller. Protokollen som er beskrevet i dette manuskriptet, forsøker å gi en retningslinje som vil være nyttig selv om populasjonene/betingelsene endres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi vil takke vitenskapelig ansatte ved NUS Institutt for otolaryngologi og Institutt for mikrobiologi og immunologi for deres hjelp med hNEC kultur- og viralkulturrelatert arbeid. Vi vil også takke kirurgene og operasjonsteamet ved Nasjonalt universitetssykehus, Institutt for otolaryngologi, for deres hjelp til å gi cellen og blodprøvene som kreves for studien.
Denne studien ble finansiert av National Medical Research Council, Singapore No. NMRC/CIRG/1458/2016 (til De Yun Wang) og MOH-OFYIRG19may-0007 (til Kai Sen Tan). Kai Sen Tan er mottaker av stipendiatstøtte fra European Allergy and Clinical Immunology (EAACI) Research Fellowship 2019.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free | Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
| 1.5 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120086 | 1.5mL Centrifuge Tube |
| 10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes | BD | 366643 | 10mL Blood Collection Tubes |
| 10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
| 10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
| 12-well Plate | Corning | 3513 | |
| 12-well Transwell Insert | Corning | 3460 | membrane insert |
| 1x FACS Lysing Solution | BD | 349202 | |
| 2.0 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120094 | 2 mL centrifuge tube |
| 24-well Plate | Corning | 3524 | |
| 24-well Transwell Insert | Corning | 3470 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | STEMCELL Technologies | 07060 | |
| 3,3',5-triiodo-l-thyronine | Sigma | T-074 | |
| 37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O | Sigma | 533998 | |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | 5811000320 | |
| 5 mL polypropylene tubes (flow tubes) | BD | 352058 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| A-4-62 Rotor | Eppendorf | 5810709008 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | Cell Dissociation Reagent |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | Liquid Overlay |
| Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | Multiplex Manager Software |
| Butterfly Needle 21 G | BD | 367287 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Crystal Violet | Merck | C6158 | |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Fixation and Permeabilization Solution |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Neutral Protease |
| DMEM/High Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | |
| DMEM/Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
| dNTP Mix | Promega | U1515 | dNTP Mix |
| EMEM (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2003 | |
| EVOM voltohmmeter device | WPI, Sarasota, FL, USA | 300523 | |
| FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 1x Lysing Solution |
| Falcon tube 15 mL | CellStar | 188271 | 15 mL tube |
| Falcon tube 50 mL | CellStar | 227261 | 50 mL Tube |
| Fast Start Essential DNA Probes Master | Roche | 6402682001 | qPCR Master Mix |
| Ficoll Paque Premium | Research Instruments | 17544203 | Density Gradient Media |
| H3N2 (A/Aichi/2/1968) | ATCC | VR547 | |
| H3N2 M1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3' | |
| H3N2 M1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3' | |
| H3N2 NS1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3' | |
| H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3' | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | |
| hNESPCs | Human Donors | NA | |
| Human Epithelial Growth Factor | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
| Hydrocortisone | STEMCELL Techonologies | 7925 | Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR Instrument |
| Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation | Thermofisher | L23105 | Viability Stain |
| MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | Immunology Multiplex Assay |
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | |
| M-MLV 5x Buffer | Promega | M1705 | RT-PCR 5x Buffer |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | M1706 | Reverse Transcriptase |
| N-2 supplement | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
| NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
| Perm/Wash Buffer | BD | 554723 | Permeabilization Wash Buffer |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Basal Medium | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| Random Primers | Promega | C1181 | Random Primers |
| Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor | Promega | N2511 | RNase Inhibitor |
| RNA Lysis Buffer | Qiagen | Part of 52904 | |
| RPMI 1640 (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2001 | |
| STX2 electrodes | WPI, Sarasota, FL, USA | STX2 | Electrode |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| TPCK Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Trypan Blue | Hyclone | SV30084.01 | |
| Viral RNA Extraction Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA Extraction Kit |
| V-Shaped 96-well Plate | Corning | 3894 |
References
- Monto, A. S. Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness. Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).
- Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L.
- Gerdil, C. The annual production cycle for influenza vaccine. Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).
- Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. Economic burden of seasonal influenza in the United States. Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).
- Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M.
- Guo, Y. R., et al. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status. Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).
- Guan, W. J., et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).
- van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells are activated during human viral infections. Nature Communications. 7, 11653 (2016).
- Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. Gammadelta T cells: first line of defense and beyond. Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).
- van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo. Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).
- Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).
- Yan, Y., et al. Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).
- Luukkainen, A., et al. A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium. Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).
- Tan, K. S., et al. RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications. Cells. 8 (9), 986 (2019).
- Kim, N., et al. Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells. Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).
- Tan, K., et al. In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses. Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).
- Tan, K. S., et al. Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures. Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).
- Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay,MM_NF-HCP2MAG-62K-PX23?#documentation (2020).
- Gamage, A. M., et al. Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).
- Zhao, X. N., et al. The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro. American Journal of Rhinology & Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).
