羊の成人および前頭前卵巣から採取された体外期の成熟卵母細胞のガラス化
Summary
このプロトコルは、成体および若年性羊卵子のガラス化のための標準的な方法を提供することを目的としている。これは、体外成熟培地の調製から温暖化後の培養までのすべてのステップを含む。卵母細胞は最小必須容積を保障するためにクライオトップを使用してMII段階でガラス化される。
Abstract
家畜では、食肉処理場から容易に得ることができる多数の卵巣および卵母細胞のおかげで、インビトロ胚生産システムを開発し、持続させることができる。成人卵巣は常にいくつかの骨根卵胞を負担し、思春期前ドナーでは卵巣が四大葉包のピーク数を負担する4週齢で卵母細胞の最大数が利用可能である。したがって、4週齢の子羊は、成人の卵母細胞の発達能力が成人に比べて低い場合でも、良好なドナーとみなされる。
基礎研究と商業用途は、成人および前頭体ドナーの両方から得られたガラス状卵母細胞を正常に凍結保存する可能性によって後押しされるであろう。前立体ドナーから採取された卵母細胞のガラス化はまた、生成間隔を短くし、繁殖プログラムにおける遺伝的利益を増加させることも可能にする。しかし、凍結保存後の発達力の喪失は、哺乳類の卵母細胞をおそらく凍結保存するのが最も困難な細胞型の1つとなる。利用可能な凍結保存技術の中で、ガラス化は動物およびヒト卵母細胞に広く適用される。この技術の最近の進歩にもかかわらず、高濃度の凍結保護剤への暴露、ならびに冷たい傷害および浸透ストレスは依然としていくつかの構造的および分子的変化を誘発し、哺乳類卵母細胞の発達可能性を低下させる。ここでは、若年および成人ドナーから採取され、凍結保存の前に体外で成熟した羊の卵母細胞のガラス化のためのプロトコルについて述べている。このプロトコルには、卵母細胞の体外成熟からガラス化、温暖化および温暖化後のインキュベーション期間まで、すべての手順が含まれています。MII段階でガラス化された卵母細胞は、実際に温暖化後に受精することができるが、凍結保存手順による損傷を回復し、その発達可能性を高めるために受精前に余分な時間が必要である。したがって、温暖化後の培養条件およびタイミングは、特に卵母細胞が若年性ドナーから採取される場合、卵母細胞の発達可能性を回復するための重要なステップである。
Introduction
雌の配偶子の長期保存は、遺伝的選択プログラムによる家畜飼育の改善、元その場の野生動物種保護プログラムを通じた生物多様性の保全に寄与すること、および貯蔵された卵母細胞が体外胚生産または核移植プログラム1、2、3に組み込まれる可能性のおかげで、生体内バイオテクノロジーの研究と応用を促進するなど、幅広い用途を提供することができる。若年卵母細胞ガラス化はまた、繁殖プログラム4の生成間隔を短くすることによって遺伝的利益を増加させるだろう。卵母細胞の超急速冷却および温暖化によるガラス化は、現在、家畜卵母細胞凍結保存のための標準的なアプローチと考えられている5.反芻動物では、ガラス化の前に、卵母細胞は、通常、インビトロで成熟し、アバトワール由来卵巣から得られた卵胞から取り出した後2。成人、特に思春期前卵巣4,6は、凍結保存される卵母細胞の事実上無制限の数を実際に供給することができる。
牛では、卵子のガラス化および温暖化後、>10%の胚盤胞収量は、過去10年間にいくつかの実験室によって一般的に報告されている3。しかし、小さな反虫卵子では、卵形の卵形は、まだ若年卵母細胞と成人卵母細胞の両方について比較的新しいと考えられており、羊の卵母細胞のガラス化のための標準的な方法は、2,5に確立され続ける。最近の進歩にもかかわらず、ガラス化され、温めた卵母細胞は確かに彼らの発達の可能性7、8、9を制限するいくつかの機能的および構造的な変化を提示する。したがって、ガラス化/温めた羊の卵母細胞2では10%以上の胚盤胞発生を報告した記事はほとんどありません。上記の変更を減らすためにいくつかのアプローチが検討されている:ガラス化および解凍ソリューション10、11の組成を最適化する。異なるクライオデバイス8、12、13の使用を試してみる。そして、体外成熟(IVM)4、14、15および/または温暖化後の回復時間中に特定の治療を適用する6.
ここでは、若年性および成人ドナーから採取され、凍結保存の前に体外で成熟した羊の卵母細胞のガラス化のためのプロトコルについて説明する。このプロトコルには、卵母細胞の体外成熟からガラス化、温暖化および温暖化後の培養期間まで、すべての手順が含まれています。
Protocol
動物の議定書および実施された手順は、欧州連合指令86/609/ECおよび欧州共同体委員会の勧告2007/526/ECに従って、サッサリ大学で施行されている倫理指針に従っています。 1. 卵母細胞操作用メディアの準備 0.1 g/L ペニシリンおよび 0.1 g/L ストレプトマイシン (PBS) で Dulbecco のリン酸緩衝生理食塩を補って、採取した卵巣の輸送のための培地を準備します。 ペ?…
Representative Results
若年性ドナーからの卵母細胞の凍結耐性は、成人の卵子に比べて低い。最初に観察された効果は、成体卵母細胞と比較して温暖化後生存率が低い(図1A;χ2試験P<0.001)。若年卵母細胞は、温暖化後の膜完全性の低下を示した(図1B)。成熟培地におけるトレハロースの使用は、この糖が若年卵母細胞の凍結傷害を減少させるかどうかを検証するこ?…
Discussion
家畜における卵母細胞凍結保存は、女性の遺伝資源の長期的な保存だけでなく、胚性バイオテクノロジーの開発を進めることができる。したがって、卵母細胞ガラス化のための標準的な方法の開発は、家畜と研究部門の両方に有利であろう。このプロトコルでは、成虫の羊卵子ガラス化のための完全な方法が提示され、若年卵母細胞のための効率的なガラス化システムの開発のための固体の?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者たちはこの作品に対する具体的な資金を受け取っていなかった。マリア・グラツィア・カッパイ教授とヴァレリア・パシウ博士は、ビデオナレーションとビデオ制作中にラボを設置したことで感謝しています。
Materials
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Succu, S., Serra, E., Gadau, S., Varcasia, A., Berlinguer, F. Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep. J. Vis. Exp. (173), e62272, doi:10.3791/62272 (2021).