양에서 성인 및 프레우버탈 난소에서 채취한 생체외 성숙 난소의 진동
Summary
이 프로토콜은 성인 및 청소년 양 난모세포의 유리화를 위한 표준 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다. 여기에는 시험관 내 성숙 미디어 준비부터 온난화 후 문화에 이르기까지 모든 단계가 포함됩니다. 난동체는 최소한의 필수 볼륨을 보장하기 위해 Cryotop을 사용하여 MII 단계에서 진동됩니다.
Abstract
가축에서는 도살장에서 쉽게 얻을 수 있는 많은 수의 난소와 난소 로 인해 체외 배아 생산 시스템을 개발하고 지속할 수 있다. 성인 난소는 항상 여러 개 항성 여포를 부담, 전 사춘기 기증자에서 난소의 최대 수는 4 주에 사용할 수 있습니다, 때 난소는 개소 여포의 피크 번호를 곰. 따라서, 4 주 된 양은 좋은 기증자로 간주됩니다, 프레우버탈 난모세포의 발달 능력이 성인 대응에 비해 낮은 경우에도.
기본 연구 및 상업 응용 프로그램은 성인 및 프레우버탈 기증자 모두에서 얻은 유리화 된 난초를 성공적으로 냉동 보존 할 수있는 가능성에 의해 증폭 될 것입니다. 프레우버탈 기증자로부터 수집된 난소세포의 병리화는 또한 생성 간격을 단축하고 따라서 사육 프로그램에서 유전 이득을 증가시키는 것을 허용할 것입니다. 그러나, 동결 보존 후 발달 잠재력의 손실은 포유류 난모세포를 아마 냉동 보존하는 가장 어려운 세포 유형 중 하나를 만든다. 사용 가능한 냉동 보존 기술 중, 유리화는 동물과 인간의 난모세포에 널리 적용됩니다. 기술의 최근 발전에도 불구하고, 냉동 보호제의 고농도에 노출뿐만 아니라 차가운 부상과 삼투압은 여전히 여러 구조적 및 분자 변화를 유도하고 포유류 난모세포의 발달 잠재력을 감소. 여기에서, 우리는 청소년과 성인 기증자에게서 집합되고 냉동 보존 의 앞에 시험관에서 성숙한 양 난모세포의 병신을 위한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜에는 시험외 성숙에서 부터 진동, 온난화 및 후 침습 기간에 이르는 모든 절차가 포함되어 있습니다. MII 단계에서 진동하는 난초는 실제로 온난화 에 따라 수정 될 수 있지만 냉동 보존 절차로 인한 손상을 복원하고 발달 잠재력을 높이기 위해 수정되기 전에 추가 시간이 필요합니다. 따라서, 온난화 후 문화 조건과 타이밍은 난모세포 발달 잠재력의 회복을위한 중요한 단계입니다, 특히 난모세포는 청소년 기증자로부터 수집 될 때.
Introduction
여성 게임테의 장기 저장은 유전적 선정 프로그램에 의한 국내 동물 사육 개선, 전시 야생동물 종 보존 프로그램을 통한 생물다양성 보존 에 기여하고, 생체외 배아 생산 또는 핵이식 프로그램1,2,3에통합될 저장된 난모세포의 가용성에 힘입어 체외 생명공학 연구 및 응용 프로그램을 강화하는 등 광범위한 응용 프로그램을 제공할 수 있다. 청소년 난소 성 유리화는 또한 사육 프로그램4에서생성 간격을 단축하여 유전 적 이득을 증가시킬 것이다. 난모세포의 초고속 냉각 및 온난화에 의한 진동은 현재 가축 난모세포 냉동 보존5에대한 표준 접근법으로 간주됩니다. 반추제에서는, 진동하기 전에, 난소는 일반적으로 아바토이르 유래 난소2로부터얻은 여포로부터 회수 한 후 시험관 내에서 성숙된다. 성인, 특히 프레우버탈 난소4,6은실제로 냉동 보존될 난귀의 거의 무제한 수를 공급할 수 있다.
가축에서, 오낭 성 진동 및 온난화 후, 배반물 수확량>10% 일반적으로 지난 10 년 동안 여러 실험실에 의해 보고 되었습니다3. 그러나, 작은 반추제 난미제에서 난막염 은 여전히 청소년과 성인 난소 모두에 대해 상대적으로 새로운 것으로 간주되며, 양 난미화물 진동에 대한 표준 방법은2,5로확립되어야 한다. 최근의 발전에도 불구하고, 유리화되고 따뜻해진 난소세포는 실제로 발달 잠재력을 제한하는 몇 가지 기능적 및 구조적 변화를 제시합니다7,8,9. 따라서, 생체화/온수 양 난모세포 2에서 10% 이상에서 발아세포 개발을 보고한 기사는 거의없다. 전술한 변경 사항을 줄이기 위해 여러 가지 접근법을 조사했습니다: 바이트로화 및 해동 용액의 조성을최적화(10·11); 다른 저온 장치의 사용을 실험8,12,13; 및 시험관 내 성숙(IVM)4,14, 15 및/또는온난화후 회복 시간 동안 6.
여기에서 우리는 청소년과 성인 기증자에게서 집합되고 냉동 보존 의 앞에 시험관에서 성숙한 양 난모세포의 병용 을 위한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜에는 시험외 성숙에서 부터 진동, 온난화 및 온난화 후 문화 기간에 이르는 모든 절차가 포함되어 있습니다.
Protocol
동물 프로토콜 및 아래에 설명된 구현된 절차는 유럽 연합 지침 86/609/EC및 유럽 공동체 위원회 2007/526/EC의 권고에 따라 사사리 대학의 발효 윤리 지침에 따라 결정됩니다. 1. 오낭 조작을 위한 미디어 준비 덜벡코의 인산완충식식염을 0.1g/L 페니실린과 0.1g/L 연쇄상구균(PBS)으로 보충하여 수집된 난소의 수송을 위한 매체를 준비한다. 페니실린으로 보충된 밀리큐 ?…
Representative Results
청소년 기증자의 난소 세포의 극온성은 성인 기증자에 비해 낮습니다. 관찰된 첫 번째 효과는 성인 난모세포에 비해 온난화 후 생존율이 낮습니다(도1A;θ 2 시험 P<0.001). 청소년 난모세포는 온난화 후 멤브레인 무결성이 낮은 것으로나타났다(그림 1B). 성숙 배지에서 트레할로오스를 사용하는 것은 이 설탕이 청소년 난모세포에서 저온 부상을 줄…
Discussion
가축의 오키테 냉동 보존은 여성 유전 자원의 장기적인 보존뿐만 아니라 배아 생명 공학의 개발을 진전시킬 수 있습니다. 따라서, 난소 진동을 위한 표준 방법의 개발은 가축과 연구 분야 모두에 유리할 것이다. 이 프로토콜에서는 성인 양 난소 진동을 위한 완전한 방법이 제시되고 청소년 oocyte에 대한 효율적인 유리화 시스템의 개발을 위한 견고한 출발점을 나타낼 수 있습니다.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는이 작품에 대한 구체적인 자금을받지 못했습니다. 마리아 그라치아 카파이 교수와 발레리아 파시우 박사는 비디오 보이스오버와 비디오 제작 중 실험실 을 설립한 것에 대해 감사하게 인정받고 있습니다.
Materials
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
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Citazione di questo articolo
Succu, S., Serra, E., Gadau, S., Varcasia, A., Berlinguer, F. Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep. J. Vis. Exp. (173), e62272, doi:10.3791/62272 (2021).