Vitrificación De Ovocitos Maduros In Vitro Recogidos De Ovarios Adultos Y Prepúrromos En Ovejas
Summary
El protocolo tiene como objetivo proporcionar un método estándar para la vitrificación de ovocitos de ovejas adultas y juveniles. Incluye todos los pasos desde la preparación de los medios de maduración in vitro hasta el cultivo post-calentamiento. Los ovocitos se vitrifican en la etapa de MII utilizando Cryotop para asegurar el volumen mínimo esencial.
Abstract
En el ganado, los sistemas de producción de embriones in vitro se pueden desarrollar y mantener gracias a la gran cantidad de ovarios y ovocitos que se pueden obtener fácilmente de un matadero. Los ovarios adultos siempre llevan varios folículos antrales, mientras que en los donantes prepúerales los números máximos de ovocitos están disponibles a las 4 semanas de edad, cuando los ovarios tienen un número máximo de folículos antrales. Así, los corderos de 4 semanas de edad se consideran buenos donantes, incluso si la competencia de desarrollo de los ovocitos prepúrromos es menor en comparación con su contraparte adulta.
La investigación básica y las aplicaciones comerciales se verían impulsadas por la posibilidad de criopreservar con éxito ovocitos vitrificados obtenidos de donantes adultos y prepúterrales. La vitrificación de los ovocitos recogidos de donantes prepúrromos también permitiría acortar el intervalo de generación y, por lo tanto, aumentar la ganancia genética en los programas de cría. Sin embargo, la pérdida de potencial de desarrollo después de la criopreservación hace que los ovocitos de mamíferos sean probablemente uno de los tipos celulares más difíciles de criopreservar. Entre las técnicas de criopreservación disponibles, la vitrificación se aplica ampliamente a los ovocitos animales y humanos. A pesar de los avances recientes en la técnica, las exposiciones a altas concentraciones de agentes crioprotectores, así como lesiones escalofriantes y estrés osmótico todavía inducen varias alteraciones estructurales y moleculares y reducen el potencial de desarrollo de los ovocitos de mamíferos. Aquí, se describe un protocolo para la vitrificación de ovocitos de oveja recogidos de donantes juveniles y adultos y madurados in vitro antes de la criopreservación. El protocolo incluye todos los procedimientos desde la maduración in vitro de ovocitos hasta la vitrificación, el calentamiento y el período de incubación post-calentamiento. Los ovocitos vitrificados en la etapa de MII de hecho pueden ser fertilizados después del calentamiento, pero necesitan tiempo extra antes de la fertilización para restaurar el daño debido a los procedimientos de criopreservación y para aumentar su potencial de desarrollo. Por lo tanto, las condiciones de cultivo posteriores al calentamiento y el momento son pasos cruciales para la restauración del potencial de desarrollo de ovocitos, especialmente cuando los ovocitos se recolectan de donantes juveniles.
Introduction
El almacenamiento a largo plazo de los gametos femeninos puede ofrecer una amplia gama de aplicaciones, como la mejora de la cría de animales domésticos mediante programas de selección genética, la contribución a la preservación de la biodiversidad a través del programa de conservación de especies silvestres ex situ, y el impulso de la investigación y las aplicaciones biotecnológicas in vitro gracias a la disponibilidad de ovocitos almacenados para ser incorporados en la producción de embriones in vitro o en los programas de trasplante nuclear1,2,3. La vitrificación de ovocitos juveniles también aumentaría la ganancia genética al acortar el intervalo de generación en los programas de cría4. La vitrificación por enfriamiento y calentamiento ultrarrápido de ovocitos se considera actualmente un enfoque estándar para la criopreservación de ovocitos de ganado5. En los rumiantes, antes de la vitrificación, los ovocitos suelen madurar in vitro, después de la recuperación de folículos obtenidos de ovarios derivados demataderos 2. Los ovarios adultos, y especialmente los ovarios prepúrromos4,6,pueden suministrar un número prácticamente ilimitado de ovocitos que se criopreservan.
En el ganado vacuno, después de la vitrificación y calentamiento de los ovocitos, los rendimientos de blastocistos en >10% han sido comúnmente reportados por varios laboratorios durante la última década3. Sin embargo, en los pequeños rumiantes la vitrificación de ovocitos todavía se considera relativamente nueva tanto para ovocitos juveniles como para adultos, y queda por establecer un método estándar para la vitrificación de ovocitos ovinos2,5. A pesar de los avances recientes, el ovocito vitrificado y calentado presenta de hecho varias alteraciones funcionales y estructurales que limitan su potencial de desarrollo7,8,9. Por lo tanto, pocos artículos han reportado el desarrollo de blastocistos al 10% o más en ovocitos de oveja vitrificados /calentados2. Se han investigado varios enfoques para reducir las alteraciones antes mencionadas: optimización de la composición de las soluciones de vitrificación y descongelación10,11; experimentar con el uso de diferentes crio-dispositivos8,12,13; y la aplicación de tratamientos específicos durante la maduración in vitro (GIV)4,14,15 y/o durante el tiempo de recuperación después del calentamiento6.
Aquí describimos un protocolo para la vitrificación de ovocitos de oveja recogidos de donantes juveniles y adultos y madurados in vitro antes de la criopreservación. El protocolo incluye todos los procedimientos desde la maduración in vitro de ovocitos hasta la vitrificación, el calentamiento y el período de cultivo post-calentamiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
La criopreservación de ovocitos en animales domésticos puede permitir no sólo la conservación a largo plazo de los recursos genéticos femeninos, sino también avanzar en el desarrollo de biotecnologías embrionarias. Por lo tanto, el desarrollo de un método estándar para la vitrificación de ovocitos beneficiaría tanto al ganado como al sector de la investigación. En este protocolo, un método completo para la vitrificación adulta del oocyte de las ovejas se presenta y podría representar un punto de partida s?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores no recibieron financiación específica para este trabajo. La profesora Maria Grazia Cappai y la Dra. Valeria Pasciu son agradecidas por la voz en off en video y por configurar el laboratorio durante la realización del video.
Materials
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
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