הפרוטוקול נועד לספק שיטה סטנדרטית לרטט של ביציות כבשים בוגרות וצעירות. הוא כולל את כל השלבים מהכנת אמצעי ההבשלה במבחנה לתרבות שלאחר ההתחממות. אוציטים עוברים רטט בשלב MII באמצעות Cryotop כדי להבטיח את עוצמת הקול החיונית המינימלית.
במשק החי, מערכות ייצור עובר במבחנה ניתן לפתח ומתקיים הודות למספר רב של שחלות וביצים שניתן להשיג בקלות מבית מטבחיים. השחלות הבוגרות נושאות תמיד מספר זקיקי נמלים, ואילו בתורמים לפני גיל ההתבגרות המספרים המקסימליים של ביציות זמינים בגיל 4 שבועות, כאשר השחלות נושאות מספר שיא של זקיקים antral. לכן, כבשים בני 4 שבועות נחשבים לתורמים טובים, גם אם היכולת ההתפתחותית של ביציות טרום-דוקטורט נמוכה יותר בהשוואה למקבילם הבוגר.
מחקר בסיסי ויישומים מסחריים יקודמו על ידי האפשרות של cryopreserving בהצלחה ביציות vitrified שהושגו מתורמים מבוגרים וקדם-פתורליים כאחד. הוויטריפיקציה של ביצית שנאספה מתורמים טרום-פתריאליים תאפשר גם לקצר את מרווח הייצור ובכך להגדיל את הרווח הגנטי בתוכניות הרבייה. עם זאת, אובדן הפוטנציאל ההתפתחותי לאחר cryopreservation עושה ביציות יונקים כנראה אחד מסוגי התאים הקשים ביותר cryopreserve. בין טכניקות ההקפאה הזמינות, רטט מוחל באופן נרחב על ביציות בעלי חיים ובני אדם. למרות ההתקדמות האחרונה בטכניקה, חשיפות לריכוזים גבוהים של סוכנים קריופרוטקטיביים, כמו גם פציעה מצמררת ומתח אוסמוטי עדיין גורמים למספר שינויים מבניים ומולקולריים ומפחיתים את הפוטנציאל ההתפתחותי של ביציות יונקים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להסתבכות של ביציות כבשים שנאספו מתורמים צעירים ובוגרים והתבגרו במבחנה לפני ההקפאה. הפרוטוקול כולל את כל ההליכים החל מהבשלת ביצית במבחנה ועד תקופת ההזדווגות, ההתחממות והדגירה שלאחר ההתחממות. אוציטים הנבטים בשלב MII אכן יכולים להיות מופרים לאחר ההתחממות, אך הם זקוקים לזמן נוסף לפני ההפריה כדי לשחזר נזק עקב הליכי cryopreservation ולהגדיל את הפוטנציאל ההתפתחותי שלהם. לכן, תנאי תרבות שלאחר ההתחממות ותזמון הם צעדים חיוניים לשיקום הפוטנציאל ההתפתחותי ביצית, במיוחד כאשר ביצית נאספים מתורמים צעירים.
אחסון ארוך טווח של הגמטות הנשיות יכול להציע מגוון רחב של יישומים, כגון שיפור הרבייה של בעלי חיים ביתיים על ידי תוכניות בחירה גנטית, תרומה לשימור המגוון הביולוגי באמצעות תוכנית שימור מינים לשעבר של חיות בר, וחיזוק המחקר והיישומים הביוטכנולוגיים במבחנה הודות לזמינות של ביציות מאוחסנות שישולבו בייצור עוברי במבחנה או בתוכניות השתלה גרעינית1,2,3. ויטריפיקציה של ביציות לנוער גם תגדיל את הרווח הגנטי על ידי קיצור מרווח הייצור בתוכניות הרבייה4. רטט על ידי קירור מהיר במיוחד והתחממות של ביציות נחשב כיום גישה סטנדרטית עבור הקפאה ביציות בעלי חיים5. ב הרהורים, לפני vitrification, ביציות הם בדרך כלל התבגרו במבחנה, לאחר אחזור זקיקיים המתקבלים שחלות נגזר בית מטבחיים2. מבוגרים, ובמיוחד השחלות prepubertal4,6, אכן יכול לספק מספר כמעט בלתי מוגבל של ביציות להיות cryopreserved.
בבקר, לאחר ויטריפיקציה של ביציות והתחממות, יבולי בלסטוציסט ב ->10% דווחו בדרך כלל על ידי מספר מעבדות במהלך העשור האחרון3. עם זאת, בהרהורים קטנים oocyte vitrification עדיין נחשב חדש יחסית עבור ביציות נוער ומבוגרים כאחד, שיטה סטנדרטית עבור ויטריפיקציה ביצית כבשים נשאר להקים2,5. למרות ההתקדמות האחרונה, ביצית מחוממת ואכן מציגה מספר שינויים פונקציונליים ומבניים המגבילים את הפוטנציאל ההתפתחותי שלהם7,8,9. לפיכך, מאמרים מעטים דיווחו על התפתחות בלסטוציסט ב 10% או יותר ביציות כבשים מחוממים / מחוממים2. מספר גישות נחקרו כדי להפחית את השינויים שהוזכרו לעיל: אופטימיזציה של הרכב פתרונות vitrification והפשרה10,11; ניסויים בשימוש במכשירי קריו שונים8,12,13; והחלת טיפולים ספציפיים במהלך התבגרות במבחנה (IVM)4,14,15 ו / או במהלך זמן ההחלמה לאחר התחממות6.
כאן אנו מתארים פרוטוקול לרטט של ביציות כבשים שנאספו מתורמים צעירים ובוגרים והתבגרו במבחנה לפני ההקפאה. הפרוטוקול כולל את כל ההליכים החל מהתבגרות ביצית במבחנה ועד לתרבות של ויטריפיקציה, התחממות ותרבות לאחר התחממות.
הקפאה של ביציות במשפחה יכולה לאפשר לא רק שימור ארוך טווח של משאבים גנטיים נשיים, אלא גם לקדם את הפיתוח של ביוטכנולוגיה עוברית. לפיכך, פיתוח שיטה סטנדרטית עבור ויטריפיקציה ביצית ינצל הן את בעלי החיים והן את מגזר המחקר. בפרוטוקול זה, מוצגת שיטה מלאה להסתערות ביציות כבשים למבוגרים ויכולה להוו…
The authors have nothing to disclose.
המחברים לא קיבלו מימון ספציפי לעבודה זו. פרופסור מריה גרציה Cappai וד”ר ולריה Pasciu הם הודה בהכרת תודה על קריינות וידאו ועל הקמת המעבדה במהלך עשיית וידאו.
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |