Koyunlarda Erişkin ve Prepubertal Yumurtalıklardan Toplanan In Vitro Olgunlaşmış Oositlerin Vitrifikasyonu
Summary
Protokol, yetişkin ve yavru koyun oositlerinin vitrifikasyonu için standart bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır. Tüp bebek medyasının hazırlanmasından ısınma sonrası kültüre kadar tüm adımları içerir. Oositler, minimum temel hacmi sağlamak için Cryotop kullanılarak MII aşamasında vitrifiye edilir.
Abstract
Hayvancılıkta, bir mezbahadan kolayca elde edilebilen çok sayıda yumurtalık ve oosit sayesinde in vitro embriyo üretim sistemleri geliştirilebilir ve sürdürülebilir. Yetişkin yumurtalıklar her zaman birkaç antral folikül taşırken, pubertal öncesi donörlerde, yumurtalıkların antral foliküllerin en yüksek sayılarını taşıdığı 4 haftalıkken maksimum sayıda oosit mevcuttur. Bu nedenle, 4 haftalık kuzular, prepubertal oositlerin gelişimsel yeterliliği yetişkin meslektaşlarına kıyasla daha düşük olsa bile iyi donör olarak kabul edilir.
Temel araştırmalar ve ticari uygulamalar, hem yetişkin hem de prepubertal donörlerden elde edilen vitrifiye oositlerin başarıyla kriyoprezer tasarrufu olasılığı ile artırılacaktır. Prepubertal donörlerden toplanan oositlerin vitrifikasyonu da üretim aralığının kısaltılmasına ve böylece üreme programlarındaki genetik kazancın artırılmasına olanak sağlayacaktır. Bununla birlikte, kriyoprezervasyondan sonra gelişimsel potansiyelin kaybı, memeli oositleri muhtemelen kriyoprezervasyonu en zor hücre türlerinden biri haline getirir. Mevcut kriyoprezervasyon teknikleri arasında vitrifikasyon hayvan ve insan oositlerine yaygın olarak uygulanmaktadır. Teknikteki son gelişmelere rağmen, yüksek konsantrasyonlarda kriyoprotektif ajanların yanı sıra ürpertici yaralanma ve ozmotik strese maruz kalmak hala birkaç yapısal ve moleküler değişikliğe neden olmakta ve memeli oositlerin gelişim potansiyelini azaltmaktadır. Burada, çocuk ve yetişkin donörlerden toplanan ve kriyoprezervasyondan önce olgunlaşmış in vitro koyun oositlerinin vitrifikasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, oosit in vitro olgunlaşmadan vitrifikasyona, ısınma ve ısınma sonrası kuluçka dönemine kadar tüm prosedürleri içerir. MII aşamasında vitrifiye edilen oositler ısınmadan sonra gerçekten döllenebilir, ancak kriyoprezervasyon prosedürleri nedeniyle hasarı geri yüklemek ve gelişim potansiyellerini artırmak için döllenmeden önce ekstra zamana ihtiyaçları vardır. Bu nedenle, ısınma sonrası kültür koşulları ve zamanlama, özellikle oositler genç donörlerden toplandığında, oosit gelişim potansiyelinin restorasyonu için çok önemli adımlardır.
Introduction
Dişi gametlerin uzun süreli depolanmasının, genetik seçim programlarıyla evcil hayvan yetiştiriciliğinin iyileştirilmesi, ex-situ yaban hayatı türlerinin korunması programı ile biyoçeşitliliğin korunmasına katkıda bulunması ve in vitro embriyo üretimi veya nükleer transplantasyon programlarına dahil edilecek depolanmış oositlerin mevcudiyeti sayesinde in vitro biyoteknoloji araştırma ve uygulamalarının artırılması gibi çok çeşitli uygulamalar sunabilir1,2,3. Juvenil oosit vitrifikasyonu da üreme programlarında üretim aralığını kısaltarak genetik kazancı artıracaktır4. Oositlerin ultra hızlı soğutulması ve ısıtılması ile vitrifikasyon şu anda hayvancılık oositleri kriyoprezervasyonu için standart bir yaklaşım olarak kabul edilir5. Ruminantlarda, vitrifikasyondan önce, oositler genellikle in vitro olarak olgunlaştırılır, a sittoir türevi yumurtalıklardan elde edilen foliküllerden alındıktan sonra2. Yetişkin ve özellikle prepubertal yumurtalıklar4,6, gerçekten kriyoprezerserved için neredeyse sınırsız sayıda oosit sağlayabilir.
Sığırlarda, oosit vitrifikasyonu ve ısınmadan sonra, son on yılda birkaç laboratuvar tarafından yaygın olarak bildirilen % 10′> blastosist verimi3. Bununla birlikte, küçük ruminantlarda oosit vitrifikasyonu hem genç hem de yetişkin oositler için hala nispeten yeni kabul edilir ve koyun oosit vitrifikasyonu için standart bir yöntem kurulmaya devam eder2,5. Son gelişmelere rağmen, vitrifiye edilmiş ve ısıtılmış oosit gerçekten de gelişim potansiyellerini sınırlayan çeşitli fonksiyonel ve yapısal değişiklikler sunar7,8,9. Bu nedenle, çok az makale% 10 veya daha fazla vitrifiye / ısıtılmış koyun oositleri2blastosist gelişimini bildirmiştir. Yukarıda belirtilen değişiklikleri azaltmak için çeşitli yaklaşımlar araştırılmıştır: vitrifikasyon ve çözülme çözeltilerinin bileşimini optimize etmek10,11; farklı kriyo cihazlarının kullanımı ile deneme8,12,13; ve in vitro olgunlaşma (IVM)4, 14,15ve/veya ısınmadan sonraki iyileşme süresi sırasında özel tedaviler uygulamak6.
Burada, çocuk ve yetişkin donörlerden toplanan ve kriyoprezervasyondan önce in vitro olarak olgunlaşan koyun oositlerinin vitrifikasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, oosit in vitro olgunlaşmadan vitrifikasyona, ısınma ve ısınma sonrası kültür dönemine kadar tüm prosedürleri içerir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Evcil hayvanlarda oosit kriyoprezervasyonu sadece dişi genetik kaynakların uzun süreli korunmasına izin vermekle kalmaz, aynı zamanda embriyonik biyoteknolojilerin gelişimini de ilerletebilir. Bu nedenle, oosit vitrifikasyonu için standart bir yöntemin geliştirilmesi hem hayvancılık hem de araştırma sektörüne avantaj sağlayacaktır. Bu protokolde, yetişkin koyun oosit vitrifikasyonu için eksiksiz bir yöntem sunulmaktadır ve juvenil oosit için etkili bir vitrifikasyon sisteminin geliştirilmesi için …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar bu çalışma için özel bir fon almadılar. Profesör Maria Grazia Cappai ve Dr. Valeria Pasciu, video seslendirmesi ve video yapımı sırasında laboratuvarı kurmaları için minnettar bir şekilde kabul edilmektedir.
Materials
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
Riferimenti
- Arav, A. Cryopreservation of oocytes and embryos. Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).
- Mullen, S. F., Fahy, G. M. A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep. Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).
- Hwang, I. S., Hochi, S. Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), (2007).
- Quan, G., Wu, G., Hong, Q. Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective. Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).
- Succu, S., et al. A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 110, (2018).
- Succu, S., et al. Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance. Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).
- Succu, S., et al. Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).
- Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes. Reproductive BioMedicine Online. , (2015).
- Succu, S., et al. Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes. Theriogenology. 75 (4), (2011).
- Sanaei, B., et al. An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator. Cryobiology. 84, 82-90 (2018).
- Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices. Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).
- Fernández-Reyez, F., et al. maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices. Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).
- Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).
- Barrera, N., et al. Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes. PLoS ONE. 13 (6), (2018).
- Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations. Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).
- Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
- Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes. Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).
- Dell’Aquila, M. E., et al. Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Gadau, S. D. Morphological and quantitative analysis on α-tubulin modifications in glioblastoma cells. Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).
- los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation. Theriogenology. , (2011).
- Leoni, G. G., et al. Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model. PLoS ONE. 10 (4), (2015).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).
- Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 148, 216-224 (2020).
- Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes. Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).
- Ciotti, P. M., et al. Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing. Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1. Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).
- Palmerini, M. G., et al. In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).
- Leoni, G. G., et al. Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).
- Succu, S., et al. Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes. Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).
- Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes. Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).
- Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution. Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- De Santis, L., et al. Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters. Placenta. 32, 280-281 (2011).
- Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification. Nanomedicine. 6 (6), 1115-1129 (2011).
