15 (på 5) N CPMG Avslappningsdispersion för undersökning av proteinkonformationsdynamik på tidsskalan μs-ms
Summary
Här ges en detaljerad beskrivning av protokollet som implementerats i laboratoriet för förvärv och analys av 15N avslappningsspridningsprofiler genom lösning NMR-spektroskopi.
Abstract
Proteinkonformationsdynamik spelar grundläggande roller vid reglering av enzymatisk katalys, ligandbindning, allostery och signalering, som är viktiga biologiska processer. Att förstå hur balansen mellan struktur och dynamik styr den biologiska funktionen är en ny gräns inom modern strukturbiologi och har antänt flera tekniska och metodologiska utvecklingar. Bland dessa ger CPMG-avslappningsdispersionslösning nmr-metoder unik atomupplösningsinformation om struktur, kinetik och termodynamik av proteinkonform ekvilibrier som förekommer på μs-ms-tidsskalan. Här presenterar studien detaljerade protokoll för förvärv och analys av ett 15 N avslappningsspridningsexperiment. Som ett exempel visas pipelinen för analys av μs-ms-dynamiken i C-terminaldomänen för bakterie enzym I.
Introduction
Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) avslappning dispersion (RD) experiment används på en rutinmässig bas för att karakterisera conformational equilibria förekommer på μs-ms tidsskalan genom lösning NMR spektroskopi1,2,3,4,5. Jämfört med andra metoder för undersökning av konformationsdynamik är CPMG-tekniker relativt lätta att genomföra på moderna NMR-spektrometrar, kräver inte specialiserade provberedningssteg (dvs. kristallisering, provfrysning eller justering och/eller kovalent konjugation med fluorescerande eller paramagnetisk tagg) och ger en omfattande karakterisering av konform balansomvandling som returnerar strukturell, kinetisk och termodynamisk information om utbytesprocesser. För att ett CPMG-experiment ska kunna rapportera om en konformationsjämvikt måste två villkor gälla: i) de observerade NMR-spinn måste ha olika kemiska förskjutningar i de stater som genomgår konformationsutbyte (mikrostater) och ii) utbytet måste ske i en tidsskala som sträcker sig från ~50 μs till ~10 ms. Under dessa förhållanden är den observerade tvärgående avslappningshastigheten ( 
) summan av den inneboende R2 (R2 mätt i avsaknad av μs-ms-dynamik) 
och utbytesbidraget till den tvärgående avslappningen (Rex). Rex-bidraget till R2obs kan gradvis släckas genom att minska avståndet mellan de 180° pulserna som utgör CPMG-blocket i pulssekvensen, och de resulterande RD-kurvorna kan modelleras med hjälp av Bloch-McConnell-teorin för att erhålla den kemiska skiftskillnaden mellan mikrostater, den fraktionerade populationen av varje mikrostat och växelkurserna mellan mikrostater (Figur 1)1,2,3.
Flera olika pulssekvenser och analysprotokoll har rapporterats i litteraturen för 15N CPMG experiment. Häri beskrivs det protokoll som implementeras i laboratoriet. I synnerhet kommer de avgörande stegen för beredning av NMR-provet, som inrättats och insamlar NMR-experimenten, och bearbetning och analys av NMR-data att införas (figur 2). För att underlätta överföringen av protokollet till andra laboratorier tillhandahålls pulsprogrammet, bearbetnings- och analysskripten och ett exempel på datauppsättning som kompletterande filer och finns tillgängliga för nedladdning på (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). Den medföljande pulssekvensen innehåller en fyrastegsfascykel i CPMG-blocket för undertryckande av offsetberoendeartefakter 6 och den är kodad för förvärv av flera interfolierade experiment. Dessa interfolierade experiment har en identisk avslappningsperiod men olika antal omfokuseringspulser för att uppnå olika CPMG-fält7. Det är också viktigt att märka att det beskrivna pulsprogrammet mäter 15N R2 av TROSY-komponenten i NMR-signalen8. Sammantaget har protokollet framgångsrikt tillämpats för karakterisering av konformationsutbyte i medelstora och stora proteiner4,5,9,10. För mindre system (<20 kDa) är det lämpligt att använda en Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC)-baseradpulssekvens 11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta manuskript beskriver det protokoll som implementerats i laboratoriet för förvärv och analys av 15N RD-data om proteiner. I synnerhet omfattas de avgörande stegen för beredning av NMR-provet, mätning av NMR-data och analys av fjärrskrivbordsprofilerna. Nedan diskuteras några viktiga aspekter kring förvärv och analys av RD-experiment. Men för en mer djupgående beskrivning av experimentet och dataanalysen rekommenderas noggrant studier av den ursprungliga litteraturenstarkt 3,<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av medel från NIGMS R35GM133488 och från Roy J. Carver Charitable Trust till V.V.
Materials
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
| Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
| High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | acquisition of the NMR data |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
| NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
| NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
| Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | acquisition software |
Riferimenti
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).
- Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
- Venditti, V., Clore, G. M. Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).
- Venditti, V., et al. Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I. Nature Communications. 6, 5960 (2015).
- Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment. Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).
- Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme. Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins. Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).
- Dotas, R. R., et al. Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I. Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).
- Purslow, J. A., et al. Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics. Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).
- Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins. Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).
- Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy. Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).
- Niklasson, M., et al. Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting. Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).
- Palmer, A. G., Kroenke, C. D., Loria, J. P. Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules. Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).
- Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain. Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).
- Carver, J. P., Richards, R. E. A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation. Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).
- Egner, T. K., et al. Surface Contrast’ NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation. ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).
- Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel. Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).
- Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy. Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).
- Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).
- Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution. Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).
- Pritchard, R. B., Hansen, D. F. Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy. Nature Communications. 10, 1747 (2019).
