15 Μs-ms 타임스케일에 단백질 형성 역학의 조사를 위한 N CPMG 이완 분산
Summary
여기서, 솔루션 NMR 분광법에 의한 15N이완 분산 프로파일의 수집 및 분석을 위해 실험실에서 구현된 프로토콜에 대한 자세한 설명이 제공된다.
Abstract
단백질 형성 역학은 중요한 생물학적 과정인 효소 촉매, 리간드 결합, 알로스터리 및 시그널링의 조절에 근본적인 역할을 합니다. 구조와 역학 사이의 균형이 생물학적 기능을 어떻게 지배하는지 이해하는 것은 현대 구조 생물학의 새로운 개척지이며 몇 가지 기술적 및 방법론적 발전에 불을 붙였습니다. 이들 중, CPMG 이완 분산 용NMR 방법은 μs-ms 타임스케일에서 발생하는 단백질 형태 평형의 구조, 운동학 및 열역학에 대한 고유하고 원자분해능적인 정보를 제공한다. 여기서, 연구 결과는 15N 이완 분산 실험의 취득 그리고 분석을 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 예를 들어, 박테리아 효소의 C-말단 도메인에서 μs-ms 역학의 분석을 위한 파이프라인이 나타난다.
Introduction
Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) 이완 분산 (RD) 실험은 용액 NMR분광법 1,2,3,4,5에의해 μs-ms 시간 척도에서 발생하는 형태 평형을 특성화하기 위해 일상적인 베이스에 사용된다. 균역학을 조사하는 다른 방법에 비해 CPMG 기술은 현대 NMR 분광계에서 비교적 구현하기 쉽고, 특수 시료 준비 단계(즉, 결정화, 샘플 동결 또는 정렬 및/또는 형광 또는 파라마그네틱 태그와 함께 동월 결합)을 필요로 하지 않으며, 구조적, 역학적 재형성, 역학적 재형성, 역학적 재해석, 동역학적 재보행의 포괄적인 특성화를 제공한다. CPMG 실험이 형태 평형에 대해 보고하기 위해서는, 두 가지 조건이 적용되어야 한다: (i) 관찰된 NMR 스핀은 형태 교환(microstates)을 겪고 있는 상태에서 다른 화학적 변화를 가져야 하며 (ii) 교환은 ~50 μs에서 ~10ms에 이르는 시간 척도로 이루어져야 한다. 이러한 조건하에서, 관찰된 횡방향 이완속도()는 
본질R2(μs-ms 역학의 부재하에서 측정된R2)의 
합이며, 횡방향 이완(Rex)에대한 교환 기여도이다. R2obs에 대한 R전 기여도는 펄스 서열의 CPMG 블록을 구성하는 180° 펄스 사이의 간격을 감소시킴으로써 점진적으로 담금질될 수 있으며, 그 결과 RD 곡선은 블로흐-맥코넬 이론을 이용하여 마이크로스테이트 간의 화학적 변화 차이, 각 마이크로스테이트의 분수 인구, 및 소행성 간 교환속도(도1)중 의 화학적 변화 차이를 얻을 수있다.
15NCPMG 실험에 대한 문헌에서 여러 가지 상이한 펄스 서열 및 분석 프로토콜이 보고되었다. 본원에서, 실험실에서 구현된 프로토콜은 기술된다. 특히 NMR 샘플의 제조, NMR 실험의 설정 및 획득, NMR 데이터의 처리 및 분석을 위한 중요한 단계가 도입될것이다(그림 2). 프로토콜을 다른 실험실로 쉽게 전송하기 위해 펄스 프로그램, 처리 및 분석 스크립트 및 하나의 예제 데이터 집합은 보충 파일로 제공되며(https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html)에서 다운로드할 수 있습니다. 제공된 펄스 서열은 오프셋 종속 아티팩트6의 억제를 위해 CPMG 블록에 4단계 위상 주기를 통합하고 여러 인터리브 된 실험을 수집하기 위해 코딩됩니다. 이러한 인터리브 된 실험은 동일한 휴식 기간을 가지고 있지만 다른 CPMG 필드7을달성하기 위해 펄스를 다시 초점을 맞추는 다른 수. 또한 기술된 펄스 프로그램이 NMR 신호8의TROSY 성분의 15N R2를 측정한다는 것을 통지하는 것도 중요하다. 전반적으로, 프로토콜은 중형 및 대형단백질4,5,9,10에서형성 교류의 특성화를 성공적으로 적용하였다. 소형 시스템(<20 kDa)의 경우, 이종핵 단일 양자 일관성(HSQC)-기반 펄스 서열11,12의 사용은 바람직하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고는 단백질에 대한 15NRD 데이터를 수집 및 분석을 위해 실험실에서 구현된 프로토콜을 설명합니다. 특히 NMR 샘플 의 준비, NMR 데이터 측정 및 RD 프로파일 분석을 위한 중요한 단계가 다룹니다. Rd 실험의 인수 및 분석에 관한 몇 가지 중요한 측면에 대해 논의됩니다. 그러나, 실험 및 데이터 분석에 대한 보다 심층적인 설명을 위해, 본문문헌을 주의 깊게 공부하는 것이</s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIGMS R35GM133488의 자금과 로이 J. 카버 자선 신탁에서 V.V.V.에 이르기까지 자금으로 지원되었습니다.
Materials
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
| Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
| High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | acquisition of the NMR data |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
| NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
| NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
| Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | acquisition software |
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