15 N CPMG التشتت الاسترخاء للتحقيق في ديناميات تشكيل البروتين على مقياس زمني μs-ms
Summary
هنا، يتم توفير وصف مفصل للبروتوكول المنفذ في المختبر للحصول على وتحليل 15N ملامح التشتت الاسترخاء عن طريق التحليل الطيفي NMR الحل.
Abstract
تلعب الديناميكيات التوافقية للبروتين أدوارا أساسية في تنظيم الحفز الأنزيمي ، وربط الليغند ، والتستوستيرون ، والإشارات ، وهي عمليات بيولوجية مهمة. إن فهم كيفية تحكم التوازن بين البنية والديناميكيات للوظيفة البيولوجية هو حدود جديدة في البيولوجيا الهيكلية الحديثة وأشعل العديد من التطورات التقنية والمنهجية. من بين هذه, CPMG الاسترخاء حل التشتت أساليب NMR توفير فريدة من نوعها, معلومات الدقة الذرية على هيكل, الحركية, والديناميكا الحرارية من البروتين تشكيلية التوازنات التي تحدث على مقياس زمني μs-ms. هنا ، تقدم الدراسة بروتوكولات مفصلة للحصول على وتحليل تجربة تشتت الاسترخاء 15N. على سبيل المثال ، يظهر خط أنابيب لتحليل ديناميات μs-ms في المجال C-terminal من البكتيريا Enzyme I.
Introduction
كار بورسيل ميبوم جيل (CPMG) يتم استخدام تجارب تشتت الاسترخاء (RD) على قاعدة روتينية لتوصيف التوازنات التوافقية التي تحدث على مقياس الوقت μs-ms عن طريق التحليل الطيفي NMR الحل1،2،3،4،5. بالمقارنة مع الطرق الأخرى للتحقيق في الديناميات التوافقية ، فإن تقنيات CPMG سهلة التنفيذ نسبيا على مطياف NMR الحديث ، ولا تتطلب خطوات إعداد عينات متخصصة (أي التبلور أو تجميد العينة أو المحاذاة ، و / أو اقتران التكافؤ مع علامة فلورية أو مغناطيسية) ، وتوفر وصفا شاملا للتوازنات التركيبية العائدة للمعلومات الهيكلية والحركية والدينامية الحرارية حول عمليات التبادل. ولكي تقدم تجربة CPMG تقريرا عن التوازن التوافقي، يجب تطبيق شرطين: ‘1’ يجب أن تكون للدورات المعدلة بالرنين المغناطيسي الملاحظة تحولات كيميائية مختلفة في الولايات التي تخضع لتبادل تشكيلي (حالات صغرى) و’2′ يجب أن يحدث التبادل في مقياس زمني يتراوح بين ~ 50 ميكروس إلى ~ 10 مللي ثانية. في ظل هذه الظروف، ومعدل الاسترخاء العرضي الملاحظ 
() هو مجموع R2 الجوهرية (R2 تقاس في غياب ديناميات ميكروس مللي ثانية، 
) ومساهمة الصرف إلى الاسترخاء العرضي (Rex). يمكن إخمادمساهمة R ex إلى R2obs تدريجيا عن طريق تقليل التباعد بين النبضات 180 درجة التي تشكل كتلة CPMG من تسلسل النبض ، ويمكن تصميم منحنيات RD الناتجة باستخدام نظرية Bloch-McConnell للحصول على الفرق في التحول الكيميائي بين الدول الصغيرة ، والسكان الكسور في كل ولاية صغيرة ، ومعدلات التبادل بين الدول الصغيرة (الشكل 1)1،2،3.
وقد تم الإبلاغ عن عدة تسلسلات نبض مختلفة وبروتوكولات التحليل في الأدبيات ل15تجارب N CPMG. هنا، يتم وصف البروتوكول المنفذ في المختبر. وعلى وجه الخصوص، سيتم إدخال الخطوات الحاسمة لإعداد عينة NMR، وإعداد واكتساب تجارب NMR، ومعالجة وتحليل بيانات NMR(الشكل 2). لتسهيل نقل البروتوكول إلى مختبرات أخرى، يتم توفير برنامج النبض، ومخطوطات المعالجة والتحليل، وإحدى مجموعات البيانات على سبيل المثال كملفات تكميلية وهي متاحة للتنزيل في (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). يتضمن تسلسل النبض المقدم دورة مرحلية من أربع خطوات في كتلة CPMG لقمع القطع الأثرية المعتمدة على الإزاحة6 ويتم ترميزها للحصول على العديد من التجارب المتشابكة. هذه التجارب interleaved لها فترة استرخاء متطابقة ولكن أعداد مختلفة من نبضات إعادة التركيز من أجل تحقيق مختلف الحقول CPMG7. من المهم أيضا ملاحظة أن برنامج النبض الموصوف يقيس 15N R2 من مكون TROSY لإشارة NMR8. عموما، تم تطبيق البروتوكول بنجاح لتوصيف التبادل التوافقي في البروتينات متوسطة وكبيرة الحجم4،5،9،10. بالنسبة للأنظمة الأصغر (<20 كيلودا)، ينصح باستخدام تسلسل النبض الذبذبي الأحادي الترونو نووي (HSQC)11و12.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه المخطوطة البروتوكول المنفذ في المختبر للحصول على 15N RD من البيانات المتعلقة بالبروتينات وتحليلها. وعلى وجه الخصوص، يتم تغطية الخطوات الحاسمة لإعداد عينة NMR، وقياس بيانات NMR، وتحليل ملامح RD. وفيما يلي بعض الجوانب الهامة المتعلقة باقتناء وتحليل تجارب RD. ومع ذلك ، للحصول على وصف ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل بأموال من NIGMS R35GM133488 ومن صندوق روي ج. كارفر الخيري إلى V.V.
Materials
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
| Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
| High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | acquisition of the NMR data |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
| NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
| NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
| Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | acquisition software |
Riferimenti
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).
- Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
- Venditti, V., Clore, G. M. Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).
- Venditti, V., et al. Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I. Nature Communications. 6, 5960 (2015).
- Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment. Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).
- Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme. Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins. Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).
- Dotas, R. R., et al. Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I. Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).
- Purslow, J. A., et al. Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics. Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).
- Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins. Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).
- Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy. Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).
- Niklasson, M., et al. Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting. Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).
- Palmer, A. G., Kroenke, C. D., Loria, J. P. Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules. Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).
- Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain. Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).
- Carver, J. P., Richards, R. E. A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation. Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).
- Egner, T. K., et al. Surface Contrast’ NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation. ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).
- Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel. Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).
- Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy. Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).
- Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).
- Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution. Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).
- Pritchard, R. B., Hansen, D. F. Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy. Nature Communications. 10, 1747 (2019).
