15N CPMG 放松分散，用于研究 μs-ms 时间尺度上的蛋白质符合性动力学

Summary

在这里，详细描述了在实验室中实施的协议，通过解决方案 NMR 光谱学获取和分析 ¹⁵个 N 放松分散配置文件。

Abstract

蛋白质构象动力学在调节酶催化、配体结合、异质和信号方面起着基础性作用，这些都是重要的生物过程。了解结构与动力学之间的平衡如何支配生物功能是现代结构生物学的一个新领域，并引发了多项技术和方法学的发展。其中，CPMG放松分散溶液NMR方法提供了关于在μs-ms时间尺度上发生的蛋白质相符合均衡的结构、动力学和热力学的独特原子分辨率信息。在这里，该研究提出了获取和分析¹⁵N放松分散实验的详细协议。例如，显示了用于分析细菌酶 I C 端域的 μs-ms 动力学的管道。

Introduction

卡尔-珀塞尔·梅布姆-吉尔（CPMG）放松分散（RD）实验用于常规基础，通过溶液NMR光谱^{学1、2、3、4、5}来描述在μs-ms时间尺度上发生的象形平衡。与其他构象动力学调查方法相比， CPMG 技术在现代 NMR 光谱仪上相对容易实现，不需要专门的样品制备步骤（即结晶、样品冻结或对齐、和/或与荧光或参数标记共价），并提供关于交换过程的构象平衡返回结构、动能和热力学信息的综合特征。为了让 CPMG 实验报告构象平衡，必须适用两个条件：（i） 观察到的 NMR 自旋必须在进行构象交换（微状态）的状态中具有不同的化学变化：（ii） 交换必须在从 ~50μs 到 ~10ms 的时间尺度上发生。在这些条件下，观察到的横向放松率 （） 是内在 R_2（在没有 μs-ms 动态的情况下测量的 R_2） 和对横向放松 （R_ex）的交换贡献的总和。通过减少构成脉冲序列CPMG块的180°脉冲之间的间距，可以逐步消除对R₂^的_研发贡献，并利用Bloch-McConnell理论对由此产生的RD曲线进行建模，以获得微态、每个微状态的微量人口和微状态之间的交换率（图^1），2，3之间的化学移位差异。

^在15项N CPMG实验的文献中，报告了几个不同的脉冲序列和分析方案。本文介绍了在实验室中实施的协议。特别是，将采用关键步骤，准备NMR样本，建立和获取NMR实验，以及处理和分析NMR数据（图2）。为了便于将协议传输到其他实验室，脉冲程序、处理和分析脚本以及一个示例数据集作为补充文件提供，可在 （https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html） 下载。所提供的脉冲序列在 CPMG 块中包含一个四步相周期，用于抑制偏移依赖物^{件 6，}并编码用于获取多个交错实验。这些交错的实验有一个相同的放松期，但不同数量的重新聚焦脉冲，以实现不同的CPMG领域^7。同样重要的是要注意，所述脉冲程序测量了NMR信号8的TROSY组件的¹⁵N R_2。 总体而言，该议定书已成功应用于大中型蛋白质^{4、5、9、10}的构象交换定性。对于较小的系统（<20 kDa），建议使用基于异核单量子一致性（HSQC）的脉冲序列^11，12。

Protocol

1. 准备NMR样本 表达并净化2H，15N-实验室的感兴趣的蛋白质样本。注：虽然 15个 N 标记蛋白质样本可用于获取 CPMG RD 实验，但渗透（在可能的情况下）可显著提高获得数据的质量。文献13提供了生产渗透蛋白的协议。 缓冲区将纯化蛋白样品交换成脱气 NMR 缓冲器。 将 NMR 样本传输到 NMR 管中。注：NMR样本的浓度需要仔细优化，以…

Representative Results

此处描述的协议导致在 1 H- 15N TROSY频谱（图 3A）中为每个峰值获取 RD 配置文件。从收购的RD配置文件，可以估计交换贡献的15N横向放松每个骨干阿米德组（图3A，3B）。通过绘制被调查蛋白质的3D结构的R前图，可以识别在μs-ms时间尺度（图3C）上进行构造交换的结构区域。使用卡弗-里?…

Discussion

本手稿描述了在实验室中实施的协议，用于获取和分析¹⁵种 N RD 蛋白质数据。特别是，包括准备 NMR 样本、测量 NMR 数据和分析 RD 配置文件的关键步骤。下面讨论了有关研发实验的获取和分析的一些重要方面。然而，为了更深入地描述实验和数据分析，对原著文学的认真研究是强烈推荐的^{3、8、11、15、16。</s…}

Materials

Cryoprobe	Bruker	5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe	Improve sensitivity
Deuterium Oxide	Sigma Aldrich	756822-1	>99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures
Hand driven centrifuge	United Scientific supply	CENTFG1	Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube.
High Field NMR spectrometer	Bruker	Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800	acquisition of the NMR data
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html	Modeling of the NMR data
NMR pasteur Pipette	Corning Incorporation	7095D-NMR	Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube
NMR tube	Willmad Precision	535-PP-7	5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube
NMRPipe	Institute of Biosciences and Biotechnology research	https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html	NMR data processing
SPARKY	University of California, San Francisco	https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/	Analysis of the NMR data
Tospin 3.2 (or newer)	Bruker	https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html	acquisition software