15 år N CPMG Afslapning Spredning til undersøgelse af protein kropsbygning Dynamics på μs-ms Tidshorisont
Summary
Her gives en detaljeret beskrivelse af den protokol, der implementeres i laboratoriet til erhvervelse og analyse af 15N afslapningsspredningsprofiler ved løsning NMR-spektroskopi.
Abstract
Protein kropsbygning dynamik spiller grundlæggende roller i reguleringen af enzymatisk katalyse, ligand bindende, allostery, og signalering, som er vigtige biologiske processer. At forstå, hvordan balancen mellem struktur og dynamik styrer den biologiske funktion, er en ny grænse i moderne strukturbiologi og har antændt flere tekniske og metodologiske udviklinger. Blandt disse giver CPMG afslapningsspredningsopløsning NMR-metoder unikke, atomare opløsningsoplysninger om strukturen, kinetik og termodynamik af proteinformationel ligevægt, der forekommer på μs-ms-tidsskalaen. Her præsenterer undersøgelsen detaljerede protokoller for erhvervelse og analyse af et 15N afslapningsspredningseksperiment. Som et eksempel vises rørledningen til analyse af μs-ms-dynamikken i bakteriernes C-terminaldomæne Enzyme I.
Introduction
Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) afslapningsspredningseksperimenter (RD) anvendes på en rutinemæssig base til at karakterisere kropsbygningsekvilibrering, der forekommer på μs-ms-tidsskalaen ved opløsning NMR-spektroskopi1,2,3,4,5. Sammenlignet med andre metoder til undersøgelse af kropsbygningsdynamik er CPMG-teknikker relativt lette at implementere på moderne NMR-spektrometre, kræver ikke specialiserede prøveforberedelsestrin (dvs. krystallisering, prøvefrysning eller -justering og / eller kovalent bøjning med en fluorescerende eller paramagnetisk tag) og giver en omfattende karakterisering af kropsbygningsækvivalenter, der returnerer strukturelle, kinetiske og termodynamiske oplysninger om udvekslingsprocesser. For at et CPMG-forsøg kan rapportere om en kropslig ligevægt, skal der gælde to betingelser: (i) de observerede NMR-spins skal have forskellige kemiske skift i de tilstande, der undergår kropsudveksling (mikrostater), og (ii) udvekslingen skal finde sted på en tidsskala fra ~ 50 μs til ~ 10 ms. Under disse omstændigheder er den observerede tværgående afslapningsrate ( 
) summen af den iboende R2 (R2 målt i mangel af μs-ms 
dynamik) og udvekslingsbidraget til den tværgående afslapning (Rex). Rex-bidraget til R2obs kan gradvistslukkes ved at reducere afstanden mellem de 180° impulser, der udgør CPMG-blokken i pulssekvensen, og de resulterende RD-kurver kan modelleres ved hjælp af Bloch-McConnell-teorien for at opnå den kemiske skiftforskel mellem mikrostater, fraktioneret population af hver mikrostat og valutakurserne blandt mikrostater (figur 1)1,2,3.
Flere forskellige pulssekvenser og analyseprotokoller er blevet rapporteret i litteraturen for 15N CPMG eksperimenter. Heri er den protokol, der er implementeret i laboratoriet, beskrevet. Navnlig vil de afgørende skridt til udarbejdelse af NMR-stikprøven, oprettelse og erhvervelse af NMR-eksperimenterne samt behandling og analyse af NMR-dataene blive indført (figur 2). For at lette overførslen af protokollen til andre laboratorier leveres pulsprogrammet, behandlings- og analysescripts og et eksempeldatasæt som supplerende filer og kan downloades på (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). Den medfølgende pulssekvens indeholder en fasecyklus i fire trin i CPMG-blokken til undertrykkelse af offsetafhængige artefakter6, og den er kodet til erhvervelse af flere interleaved-eksperimenter. Disse interleaved eksperimenter har en identisk afslapning periode, men forskellige antal refokusering pulser for at opnå forskellige CPMG felter7. Det er også vigtigt at bemærke, at det beskrevne pulsprogram måler 15N R2 i TROSY-komponenten i NMR-signalet8. Samlet set er protokollen med succes blevet anvendt til karakterisering af kropsbygningsudveksling i mellemstore og store proteiner4,5,9,10. For mindre systemer (<20 kDa) er det tilrådeligt at bruge en heteronuklear single quantum sammenhæng (HSQC)-baseret pulssekvens11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette manuskript beskriver den protokol, der er implementeret i laboratoriet for erhvervelse og analyse af 15N RD-data om proteiner. Navnlig er de afgørende skridt til udarbejdelse af NMR-prøven, måling af NMR-data og analyse af RD-profilerne dækket. Nedenfor diskuteres nogle vigtige aspekter vedrørende erhvervelse og analyse af RD-eksperimenter. Men for en mere dybdegående beskrivelse af eksperimentet og dataanalysen anbefales omhyggelig undersøgelse af den oprindelige litteratur stærkt<sup class="xre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af midler fra NIGMS R35GM133488 og fra Roy J. Carver Charitable Trust til V.V.
Materials
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
| Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
| High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | acquisition of the NMR data |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
| NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
| NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
| Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | acquisition software |
Riferimenti
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).
- Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
- Venditti, V., Clore, G. M. Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).
- Venditti, V., et al. Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I. Nature Communications. 6, 5960 (2015).
- Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment. Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).
- Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme. Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins. Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).
- Dotas, R. R., et al. Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I. Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).
- Purslow, J. A., et al. Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics. Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).
- Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins. Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).
- Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy. Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).
- Niklasson, M., et al. Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting. Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).
- Palmer, A. G., Kroenke, C. D., Loria, J. P. Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules. Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).
- Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain. Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).
- Carver, J. P., Richards, R. E. A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation. Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).
- Egner, T. K., et al. Surface Contrast’ NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation. ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).
- Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel. Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).
- Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy. Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).
- Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).
- Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution. Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).
- Pritchard, R. B., Hansen, D. F. Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy. Nature Communications. 10, 1747 (2019).
