Här ges en detaljerad beskrivning av protokollet som implementerats i laboratoriet för förvärv och analys av 15N avslappningsspridningsprofiler genom lösning NMR-spektroskopi.
Proteinkonformationsdynamik spelar grundläggande roller vid reglering av enzymatisk katalys, ligandbindning, allostery och signalering, som är viktiga biologiska processer. Att förstå hur balansen mellan struktur och dynamik styr den biologiska funktionen är en ny gräns inom modern strukturbiologi och har antänt flera tekniska och metodologiska utvecklingar. Bland dessa ger CPMG-avslappningsdispersionslösning nmr-metoder unik atomupplösningsinformation om struktur, kinetik och termodynamik av proteinkonform ekvilibrier som förekommer på μs-ms-tidsskalan. Här presenterar studien detaljerade protokoll för förvärv och analys av ett 15 N avslappningsspridningsexperiment. Som ett exempel visas pipelinen för analys av μs-ms-dynamiken i C-terminaldomänen för bakterie enzym I.
Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) avslappning dispersion (RD) experiment används på en rutinmässig bas för att karakterisera conformational equilibria förekommer på μs-ms tidsskalan genom lösning NMR spektroskopi1,2,3,4,5. Jämfört med andra metoder för undersökning av konformationsdynamik är CPMG-tekniker relativt lätta att genomföra på moderna NMR-spektrometrar, kräver inte specialiserade provberedningssteg (dvs. kristallisering, provfrysning eller justering och/eller kovalent konjugation med fluorescerande eller paramagnetisk tagg) och ger en omfattande karakterisering av konform balansomvandling som returnerar strukturell, kinetisk och termodynamisk information om utbytesprocesser. För att ett CPMG-experiment ska kunna rapportera om en konformationsjämvikt måste två villkor gälla: i) de observerade NMR-spinn måste ha olika kemiska förskjutningar i de stater som genomgår konformationsutbyte (mikrostater) och ii) utbytet måste ske i en tidsskala som sträcker sig från ~50 μs till ~10 ms. Under dessa förhållanden är den observerade tvärgående avslappningshastigheten ( ) summan av den inneboende R2 (R2 mätt i avsaknad av μs-ms-dynamik) och utbytesbidraget till den tvärgående avslappningen (Rex). Rex-bidraget till R2obs kan gradvis släckas genom att minska avståndet mellan de 180° pulserna som utgör CPMG-blocket i pulssekvensen, och de resulterande RD-kurvorna kan modelleras med hjälp av Bloch-McConnell-teorin för att erhålla den kemiska skiftskillnaden mellan mikrostater, den fraktionerade populationen av varje mikrostat och växelkurserna mellan mikrostater (Figur 1)1,2,3.
Flera olika pulssekvenser och analysprotokoll har rapporterats i litteraturen för 15N CPMG experiment. Häri beskrivs det protokoll som implementeras i laboratoriet. I synnerhet kommer de avgörande stegen för beredning av NMR-provet, som inrättats och insamlar NMR-experimenten, och bearbetning och analys av NMR-data att införas (figur 2). För att underlätta överföringen av protokollet till andra laboratorier tillhandahålls pulsprogrammet, bearbetnings- och analysskripten och ett exempel på datauppsättning som kompletterande filer och finns tillgängliga för nedladdning på (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). Den medföljande pulssekvensen innehåller en fyrastegsfascykel i CPMG-blocket för undertryckande av offsetberoendeartefakter 6 och den är kodad för förvärv av flera interfolierade experiment. Dessa interfolierade experiment har en identisk avslappningsperiod men olika antal omfokuseringspulser för att uppnå olika CPMG-fält7. Det är också viktigt att märka att det beskrivna pulsprogrammet mäter 15N R2 av TROSY-komponenten i NMR-signalen8. Sammantaget har protokollet framgångsrikt tillämpats för karakterisering av konformationsutbyte i medelstora och stora proteiner4,5,9,10. För mindre system (<20 kDa) är det lämpligt att använda en Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC)-baseradpulssekvens 11,12.
Detta manuskript beskriver det protokoll som implementerats i laboratoriet för förvärv och analys av 15N RD-data om proteiner. I synnerhet omfattas de avgörande stegen för beredning av NMR-provet, mätning av NMR-data och analys av fjärrskrivbordsprofilerna. Nedan diskuteras några viktiga aspekter kring förvärv och analys av RD-experiment. Men för en mer djupgående beskrivning av experimentet och dataanalysen rekommenderas noggrant studier av den ursprungliga litteraturenstarkt 3,<…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av medel från NIGMS R35GM133488 och från Roy J. Carver Charitable Trust till V.V.
Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | acquisition of the NMR data |
MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | acquisition software |