在这里,详细描述了在实验室中实施的协议,通过解决方案 NMR 光谱学获取和分析 15个 N 放松分散配置文件。
蛋白质构象动力学在调节酶催化、配体结合、异质和信号方面起着基础性作用,这些都是重要的生物过程。了解结构与动力学之间的平衡如何支配生物功能是现代结构生物学的一个新领域,并引发了多项技术和方法学的发展。其中,CPMG放松分散溶液NMR方法提供了关于在μs-ms时间尺度上发生的蛋白质相符合均衡的结构、动力学和热力学的独特原子分辨率信息。在这里,该研究提出了获取和分析15N放松分散实验的详细协议。例如,显示了用于分析细菌酶 I C 端域的 μs-ms 动力学的管道。
卡尔-珀塞尔·梅布姆-吉尔(CPMG)放松分散(RD)实验用于常规基础,通过溶液NMR光谱学1、2、3、4、5来描述在μs-ms时间尺度上发生的象形平衡。与其他构象动力学调查方法相比, CPMG 技术在现代 NMR 光谱仪上相对容易实现,不需要专门的样品制备步骤(即结晶、样品冻结或对齐、和/或与荧光或参数标记共价),并提供关于交换过程的构象平衡返回结构、动能和热力学信息的综合特征。为了让 CPMG 实验报告构象平衡,必须适用两个条件:(i) 观察到的 NMR 自旋必须在进行构象交换(微状态)的状态中具有不同的化学变化:(ii) 交换必须在从 ~50μs 到 ~10ms 的时间尺度上发生。在这些条件下,观察到的横向放松率 () 是内在 R2(在没有 μs-ms 动态的情况下测量的 R2) 和对横向放松 (Rex)的交换贡献的总和。通过减少构成脉冲序列CPMG块的180°脉冲之间的间距,可以逐步消除对R2的研发贡献,并利用Bloch-McConnell理论对由此产生的RD曲线进行建模,以获得微态、每个微状态的微量人口和微状态之间的交换率(图1),2,3之间的化学移位差异。
在15项N CPMG实验的文献中,报告了几个不同的脉冲序列和分析方案。本文介绍了在实验室中实施的协议。特别是,将采用关键步骤,准备NMR样本,建立和获取NMR实验,以及处理和分析NMR数据(图2)。为了便于将协议传输到其他实验室,脉冲程序、处理和分析脚本以及一个示例数据集作为补充文件提供,可在 (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html) 下载。所提供的脉冲序列在 CPMG 块中包含一个四步相周期,用于抑制偏移依赖物件 6,并编码用于获取多个交错实验。这些交错的实验有一个相同的放松期,但不同数量的重新聚焦脉冲,以实现不同的CPMG领域7。同样重要的是要注意,所述脉冲程序测量了NMR信号8的TROSY组件的15N R2。 总体而言,该议定书已成功应用于大中型蛋白质4、5、9、10的构象交换定性。对于较小的系统(<20 kDa),建议使用基于异核单量子一致性(HSQC)的脉冲序列11,12。
本手稿描述了在实验室中实施的协议,用于获取和分析15种 N RD 蛋白质数据。特别是,包括准备 NMR 样本、测量 NMR 数据和分析 RD 配置文件的关键步骤。下面讨论了有关研发实验的获取和分析的一些重要方面。然而,为了更深入地描述实验和数据分析,对原著文学的认真研究是强烈推荐的3、8、11、15、16。</s…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了来自NIGMS R35GM133488和罗伊·卡弗慈善信托基金到V.V.的资金支持。
Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | acquisition of the NMR data |
MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | acquisition software |