Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs). פרוטוקול זה מייצר אורגנואידים בכליות תוך שבועיים. האורגנואידים של הכליות המתקבלים יכולים להיות מתורבתים בבקבוקי ספינר בקנה מידה גדול או בלוחות ערבוב מגנטיים מרובי בארות עבור גישות מקבילות לבדיקת סמים.
Abstract
אורגנואידים של כליות שנוצרו מ-hPSCs סיפקו מקור בלתי מוגבל של רקמת כליה. אורגנואידים של כליות אנושיות הם כלי רב ערך לחקר מחלות כליות ופציעות, לפיתוח טיפולים מבוססי תאים ולבדיקת טיפולים חדשים. עבור יישומים כאלה, יש צורך במספר רב של אורגנואידים אחידים ומבחנים הניתנים לשחזור. בנינו על פרוטוקול האורגנואידים הכליתי שפורסם בעבר כדי לשפר את הבריאות הכללית של האורגנואידים. פרוטוקול תלת-ממדי פשוט וחזק זה כולל היווצרות של גופים עובריים אחידים במדיום רכיב מינימלי המכיל שומנים, תוסף אינסולין-טרנספרין-סלניום-אתנולמין ואלכוהול פוליוויניל עם מעכב GSK3 (CHIR99021) למשך 3 ימים, ולאחר מכן תרבית במדיום המכיל תחליף סרום נוק-אאוט (KOSR). בנוסף, בדיקות תסיסה מאפשרות הפחתה בהתגוששות של הגוף העוברי ושמירה על גודל אחיד, החשוב לצמצום השונות בין האורגנואידים. בסך הכל, הפרוטוקול מספק שיטה מהירה, יעילה וחסכונית ליצירת כמויות גדולות של אורגנואידים בכליות.
Introduction
בשנים האחרונות פותחו מספר פרוטוקולים להבחנה בין תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לאורגנואידים בכליות 1,2,3,4,5. אורגנואידים של כליות סיפקו כלי חשוב כדי לסייע למחקר בגישות חדשות לרפואה רגנרטיבית, מודל מחלות הקשורות לכליות, ביצוע מחקרי רעילות ופיתוח תרופות טיפוליות. למרות תחולתם הרחבה, לאורגנואידים בכליות יש מגבלות כגון חוסר התבגרות, יכולת תרבית מוגבלת לטווח ארוך במבחנה, ומחסור במספר סוגי תאים המצויים בכליה האנושית 6,7,8. העבודה האחרונה התמקדה בשיפור רמת ההבשלה האורגנואידית, הארכת תקופות התרבית והרחבת המורכבות של אוכלוסיות תאי הכליה על ידי שינוי הפרוטוקולים הקיימים 9,10,11,12. באיטרציה הנוכחית של הפרוטוקול שנקבע עלידינו 5,13, שינינו את הרכיבים הבינוניים בשלב הראשון של הפרוטוקול למדיום בסיס נטול סרום בתוספת אינסולין-טרנספרין-סלניום-אתנולמין (ITSE), שומנים, אלכוהול פוליוויניל (E5-ILP) ו-CHIR99021 (איור 1). שינויים אלה מספקים מדיום מוגדר לחלוטין, נטול סרום ודל חלבון, עם פחות רכיבים מהרכב הבינוני הקודם שלנו 5,13 וללא גורמי גדילה נוספים. כתוצאה מכך, מדיום השלב הראשון הוא פחות עתיר עבודה להכנה מאשר הגרסה שלנו שפורסמה בעבר, ועשוי להפחית את השונות בין אצווה לאצווה5. מחקרים קודמים הראו שגם אינסולין וגם טרנספרין חשובים בתרבית ללא סרום14,15, אולם רמות גבוהות של אינסולין יכולות להיות מעכבות להתמיינות מזודרם16. שמרנו על רמות האינסולין הנמוכות כפי שנקבעו בפרוטוקול המקורי, והפחתנו עוד יותר את רמות ה-KOSR (המכיל אינסולין) בשלב השני של הבדיקה. בהתאם לפרוטוקולים אחרים להיווצרות אורגנואידים בכליות, רמות נמוכות יותר של KOSR מועילות לשמירה על איזון בין התפשטות והתמיינות של רקמת הכליה17. בנוסף, הורדנו את ריכוז הגלוקוז במדיום שלב IIשלנו 13.
השיטה שלנו מתארת התקנה לבדיקת תרחיף של אורגנואידים בכליות, המניבה עד כ-1,000 אורגנואידים מלוח תרבית ראשוני של כ-60% hPSC 100 מ"מ, כפי שתואר בפרסום המקורי 5,13. ניתן לשנות את קנה המידה של פרוטוקול זה בקלות עד כדי התחלה עם מספר לוחות 100 מ"מ או 150 מ"מ כדי להגדיל עוד יותר את מספר האורגנואידים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים באמצעות hPSCs בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, ובוצעו במכסה בטיחות ביולוגית מדרגה II עם ציוד מגן אישי מתאים. כל הריאגנטים הם ברמת תרבית תאים, אלא אם כן צוין אחרת. כל התרבויות מודגרות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% אטמוספירה של אוויר CO2 . בכל שלבי הבדיקה ניתן לאסוף גופים עובריים או אורגנואידים בכליות, ולתקן או להכין לניתוח. קווי hPSC ששימשו להפקת נתונים אלה אופיינו במלואם ופורסמו18.
1. הכנת צלחות תרבות
הערה: כשעה אחת לפני פיצול hPSCs, יש לצפות 2 x 100 מ"מ לוחות תרבית רקמה של 2 x 100 מ"מ עם תמצית מטריצת ממברנת מרתף מוסמכת של תאי גזע (BME). אפשר לצפות מראש את הצלחות, לאטום אותן עם סרט פרפין ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על פי הוראות היצרנים.
- הכינו 2 x 100 מ"מ צלחות שטופלו בתרבית רקמה (1 לבדיקה אורגנואידית של הכליה, 1 לשמירה על קו התא) וצינורית חרוטית של 15 מ"ל במכסה המנוע של בטיחות ביולוגית Class II.
- Aliquot 8 מ"ל של Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) קר ונטול סרום לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל וכ-4 מ"ל לתוך כל אחת מצלחות ה-100 מ"מ, מספיק כדי לכסות את החלק התחתון של כל צלחת עם בינוני.
- הוציאו מהמקפיא 100 μL aliquot של BME (-20 מעלות צלזיוס). באמצעות פיפטה סרולוגית של 2 מ"ל, קח ~ 1 מ"ל של DMEM קר מהצינור החרוטי 15 מ"ל. להפשיר באיטיות את ה-BME aliquot על ידי צניחה עדינה למעלה ולמטה עם ה-DMEM הקר, תוך הימנעות מהכנת בועות.
הערה: אל תיתן ל- BME aliquot לשבת בטמפרטורת החדר. השתמש באופן מיידי. - העבר את ה-DMEM/BME המופשר בחזרה לצינור החרוטי של 15 מ"ל עם ה-DMEM הנותר. עם פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, ערבבו בעדינות את ה-BME המדולל על ידי צנרת למעלה ולמטה לפחות 8 פעמים כדי לפזר את ה-BME באופן שווה, תוך הימנעות מייצור בועות.
- מעבירים 4 מ"ל של ה-BME המדולל לכל צלחת עם DMEM ומסובבים בעדינות את הצלחת כך שה-BME מופץ באופן שווה. דגירה של הצלחת המצופה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר או 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
הערה: השתמש ב- 50 μL של BME לכל לוחית 100 מ"מ. שימוש במדיה אחרת של תרביות hPSC ובקווי תאים עשוי לדרוש ריכוזים שונים של BME.
2. מעבר hPSCs
הערה: עבור תרבית hPSC שגרתית, מעבר קווי תאים במפגש של 70-80%.
- שאפו למדיום התרבות מלוחית ה-hPSC כדי לעבור. הוסיפו כ-8 מ"ל של מלח בעל מאגר פוספט (DPBS) של Dulbecco לצלחת ה-hPSC והסתובבו בעדינות כדי לשטוף את התאים.
- שאפו ל-DBPS והוסיפו 2 מ"ל של מגיב דיסוציאציה עדין של תאים (GCDR) ללוחית ה-100 מ"מ, טיפה אחר טיפה למעלה כדי לכסות את התאים.
הערה: ניתן להשתמש גם בריאגנטים אחרים של דיסוציאציה. התאם בהתאם. - דגירה בטמפרטורת החדר במשך כ-6-8 דקות עד שהמושבות מתפרקות והתאים מתפרקים ותאים מתפרקים תחת ניגודיות פאזה (איור 2A).
הערה: התזמון עשוי להשתנות בין שורות התא. התאם בהתאם. - תוך כדי דגירה, להכין צינור חרוטי 50 מ"ל. הוסיפו 16 מ"ל של מדיום hPSC (8 מ"ל לצלחת של 100 מ"מ) והוסיפו מעכב קינאז הקשור ל-Rho (ROCKi) לריכוז סופי של 5 מיקרומטר.
- שאפו ל-DMEM מהלוחות המצופה ב-BME, והוסיפו 8 מ"ל של מדיום hPSC בתוספת ROCKi לכל צלחת.
- כאשר התאים מוכנים (כפי שמתואר בנקודה 2.3, איור 2A), שואפים ל-GCDR ומטים את הצלחת כ-45° לכיוון הנסיין ומגרדים את התאים באמצעות מרים תאים.
הערה: אם התאים מתפרקים, השמט GCDR שואף והמשך. - סובבו את הצלחת ~90° ושפשפו שוב כדי להרים את התאים הנותרים. שמור על הצלחת ~ 45 ° ושטף את התאים עם 3 מ"ל של מדיום hPSC באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל.
- פיפט בעדינות למעלה ולמטה כדי לפרק גושים גדולים (לא יותר מ 2-3 פעמים) ולזרוע את התאים ביחס המתאים עבור קו התאים של עניין על הלוחות המוכנים. מניחים את הצלחת עם התאים באינקובטור ומזיזים את הצלחת בעדינות באיור שמונה תנועות כדי לפזר את התאים באופן שווה.
הערה: בניסוי זה קווי hPSC פוצלו ביחס של 1:5, הדבר עשוי להשתנות עבור קווי תאים ותנאים אחרים. השאירו את הצלחת ללא הפרעה במשך הלילה. - לאחר כ-24 שעות, בדקו את התאים להצמדה. חפשו מושבות בודדות קטנות המחוברות. לשאוף את המדיום המושקע ולחדש עם 8 מ"ל של מדיום hPSC טרי (ללא תוספת ROCKi).
- ממשיכים לצפות ולהאכיל מדי יום עד שהתאים מגיעים למפגש של כ-60% כדי להתחיל את בדיקת האורגנואידים של הכליה (בדרך כלל מגיעים ל-48 עד 72 שעות לאחר המעבר). באופן אידיאלי המושבות יהיו נפרדות ולא מתמזגות (איור 2B).
הערה: חשוב מאוד להגביל את התאים ללא יותר מ-80% מפגש על מנת לשמור על מצב הפלוריפוטנטיות שלהם. תרביות מפגש, טיפול גס או מעברים גבוהים יותר עלולים להוביל להתמיינות ספונטנית לא רצויה או ליעילות נמוכה של היווצרות אורגנואידים בכליות.
3. יום 0 - הגדרת הבדיקה האורגנואידית של הכליה
- לפני שתתחיל, הכן הן את המדיה E5-ILP והן את שלב II בהתאם לניסוחים (טבלה 1 וטבלה 2).
הערה: ניתן לאחסן את המדיה למשך עד 14 יום בטמפרטורה של 4 °C (7 °F). - עבור בדיקה אורגנואידית כליה אחת (יש צורך בצלחת תרבית אחת של 100 מ"מ לצלחת אחת של 6 בארות), הכן מדיום E5-ILP שלם בצינור חרוטי של 50 מ"ל: 18 מ"ל של E5-ILP בתוספת 8 μM CHIR99021 (14.4 μL), 3.3 μM ROCKi (6 μL), 0.1 mM בטא-מרקפטואתנול (32.7 μL).
- מקם 2 מ"ל של מדיום E5-ILP שלם בכל באר של 6 לוחות חיבור נמוכים במיוחד.
- שטפו את ה-hPSCs במפגש של כ-60% (איור 2B) פעמיים עם כ-8 מ"ל של DPBS. לשאוף DPBS לאחר מכן להוסיף 2 מ"ל של dispase לכל צלחת 100 מ"מ, טיפה אחר טיפה כדי לכסות את התאים ודגירה במשך 6 דקות ב 37 °C (6 °F).
הערה: לאחר 6 דקות, הקצוות של המושבות יתחילו להתכרבל (איור 2C, חצים אדומים) בעוד שאר המושבה נשארת מחוברת. אם זה לא מתקבל לאחר 6 דקות, החזירו את התאים לחממה למשך 30 שניות נוספות. ייתכן שמדיה ומטריצה אחרות של hPSC לא יהיו תואמות לתזמון זה. ציפוי BME על בסיס למינין אינו תואם לדיספוזה. אם BME מבוסס למינין הם מטריצת hPSC הסטנדרטית, ציפו את אחת הלוחות בסעיף 1 עם ה-BME המתואר בשיטה זו כדי לשמש לבדיקת האורגנואידים של הכליה. - לשטוף תאים 3x עם ~ 10 מ"ל של DPBS. לשאוף DPBS ואז להטות את הצלחת ~ 45° ולגרד למטה עם מרים תאים.
הערה: Dispase אינו מושבת, ולכן יש לשטוף אותו ביסודיות. אין להפחית את מספר השטיפות. - שטפו את המושבות מלמעלה עם 6 מ"ל של מדיום E5-ILP שלם באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל. פיפטה למעלה ולמטה בעדינות כדי לפרק מושבות גדולות (2 או 3 פעמים זה בדרך כלל מספיק).
- פזרו את אשכולות המושבה באופן שווה על ידי הוספת 1 מ"ל לבאר לתוך לוחית 6 הבארות. הניחו את הצלחת על שייקר מסלולי (הגדרות: מסלול = 30, הדדי = 330°, רטט = 5° - 2 שניות) הממוקם באינקובטור של 37 °C (איור 2D).
הערה: תכונת הרטט חשובה להפצה נאותה של אורגנואידים ולמניעת גושים.
4. יום 2 - האכלה על ידי שינוי חצי בינוני
הערה: בתוך 48 השעות, אשכולות המושבה ייצרו גופים עובריים.
- הכן את המדיום השלם: עבור צלחת אחת של 6 בארות הכן 12 מ"ל של מדיום E5-ILP + 8 μM CHIR99021 בצינור חרוטי 15 מ"ל.
הערה: בטא-מרקפטואתנול ו- ROCKi אינם נדרשים. - תנו לגופים העובריים להתיישב בתחתית הצלחת, הטו את הצלחת ~45° ואז שאפו את התווך באיטיות מלמעלה, השאירו כ-1 מ"ל לבאר.
הערה: גופים עובריים בשלב זה מתגבשים במהירות. אל תשאירו אותם להסתפק > 5 דקות. - הוסף 2 מ"ל של מדיום שלם מוכן (סעיף 4.1) לכל באר. החזירו את הצלחת בחזרה אל השייקר.
5. יום 3 - העברת גופות עובריות למדיום שלב II
- מכינים צינורית חרוטית של 50 מ"ל ו-DMEM (רמת גלוקוז נמוכה). תנו לגופים העובריים להתיישב בתחתית הצלחת. הטו את הצלחת ~45° ושאפו את המדיום מלמעלה באיטיות, השאירו כ-1 מ"ל לבאר.
- אספו את כל הגופים העובריים בזהירות מכל באר באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל והעבירו אותם לצינור החרוטי של 50 מ"ל.
- לשטוף כל באר כדי לאסוף את כל הגופים העובריים הנותרים עם ~ 1 מ"ל של DMEM (גלוקוז נמוך) ולהוסיף אותם לאותו צינור חרוטי 50 מ"ל.
- השאירו את הגופים העובריים להתיישב לתחתית הצינור, כ-5 דקות. בזמן ההמתנה, הוסיפו 2 מ"ל של מדיום שלב II לכל באר של צלחת 6 הבארות. הוציאו החוצה גופים עובריים גדולים (>300 מיקרומטר) באמצעות מסננת של 200 מיקרומטר (איור 2E).
- השתמשו בצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל והניחו את מסננת התאים 200 מיקרומטר למעלה. פיפט את כל הגופים העובריים באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל בזהירות מעל מסננת התאים.
- יש לשטוף את מסננת התאים עם תוספת של כ-5 מ"ל של DMEM (גלוקוז נמוך) כדי לאסוף את כל הגופים העובריים התקועים במסננת התאים. אפשרו לגופים העובריים להתיישב לתחתית הצינור החרוטי.
- כאשר הגופים העובריים מתיישבים, שואפים את ה-supernatant ושוטפים עם כ-10 מ"ל של DMEM (גלוקוז נמוך).
- שאפו ל-DMEM והשעו מחדש את הגופים העובריים ב-6 מ"ל של מדיום שלב II.
- מעבירים את הגופות העובריות בחזרה לתוך 6 לוחות החיבור האולטרה-נמוכים, ומפיצים אותם באופן שווה בין 6 הבארות.
- בצע חצי שינויים בינוניים כמתואר בשלבים 4.2 ו- 4.3 כל יומיים.
הערה: מהיום השלישי ואילך, הגופים העובריים יהיו בעלי מראה 'זהוב' וחלק וכדורי (איור 2F). החל מהיום ה-6~ תתברר היווצרות צינוריות בגופים עובריים בודדים, כאשר בימים הבאים המספרים הולכים וגדלים יגיעו למספרים אופטימליים ולצמיחה עד היום ה-14 (איור 2G,H). כדי למנוע היווצרות גושים מזדמנת, לאחר התבוננות חזותית באורגנואידים של הכליות, או בגופים עובריים קטנים מאוד ללא צינוריות, מסננים את האורגנואידים <200 והגדולים >500 מיקרומטר עם מסנני תאים של 500 ו-200 מיקרומטר כמתואר בשלבים 5.4.1 ו-5.4.2.
6. העברה לבקבוקון ספינר והאכלה
הערה: ניתן להשתמש בבקבוקון ספינר בכל עת מהיום השלישי ואילך לניסויים הדורשים מספר גדול של אורגנואידים. העברה שגרתית של אורגנואידים מתרחשת במעבדה שלנו בין הימים 6-8. אנא עיין בסעיף דיון לקבלת חלופות אם הציוד אינו זמין.
- מעבירים גופים עובריים לבקבוקון ספינר של 125 מ"ל עם 45 מ"ל של מדיום שלב II. קבעו את מהירות המערבל המגנטי ל-120 סל"ד והכניסו לאינקובטור (איור 2I).
- כדי להזין גופים עובריים או אורגנואידים של כליות, תן לאורגנואידים של הכליות להתיישב לזמן קצר לתחתית בקבוקון הספינר. הרימו את המכסה מזרוע צד אחת של הבקבוקון והניחו את הפיפטה השואפת פנימה, כשהקצה נוגע בקיר הפנימי הנגדי.
- לאט לאט מסובבים את הפיפטה השואפת כלפי מטה ושואפים לכמחצית מהמדיום. חידוש עם 20 מ"ל של מדיום שלב II טרי על ידי צנרת אותו דרך אותו פתח.
7. הגדרת צלחת ערבוב מגנטית בעלת 6 בארות (6MSP)
הערה: ניתן להשתמש בתבנית 6MSP במקום צלוחיות ספינר אם יש צורך בבדיקה של מספר תנאים. השתמש ב- 6MSP לטיפולים מורכבים או נפרוטוקסין. זה חוסך את כמות המדיום שנעשה בו שימוש בשלב השני תוך שמירה על זמינות החומרים המזינים באמצעות דיפוזיה.
- נקו את מוטות הערבוב המגנטיים הסגלגלים בצינור חרוטי של 50 מ"ל על ידי שטיפה בתרבית רקמה המתאימה לחומר ניקוי מתאים לזמן קצר (אם מעולם לא נעשה בו שימוש) או השרו במשך > שעה אחת אם נעשה בהם שימוש בעבר.
- לשטוף בקצרה 3x ב DPBS סטרילי.
- יש לשטוף 1x במשך 5 דקות ב-70% אתנול, פי 1 ב-DPBS סטרילי.
- יש לשטוף בתמיסה נגד הדבקה ולשטוף פי 1 ב-DPBS סטרילי ולשאוף.
- בזהירות, באמצעות מלקחיים סטריליים ארוכים מניחים מוט ערבוב מגנטי אחד לתוך כל באר של צלחת 6 הבארות עם גופים עובריים או אורגנואידים של כליות.
- הניחו את הצלחת על ה-6MSP והגדירו את המהירות ל-120 סל"ד (איור 2J). לשמור על אורגנואידים של כליות עם שינוי חצי בינוני לפי סעיף 4.2 ו-4.3.
הערה: על מנת שפסי ההתעוררות המגנטיים ייצמדו למקומם ויתחילו להסתובב, ייתכן שיהיה עליך להעלות תחילה את רמת ההספק ל-100 לזמן קצר, ולאחר מכן, ברגע שכולם מסתובבים, להוריד את רמת ההספק ל-25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בגרסה עדכנית זו של הפרוטוקול שלנו, התמיינות אורגנואידית של הכליה מתחילה במדיום מוגדר ודל בחלבון. הבדיקות מבוצעות אך ורק בהשעיה ומסתמכות על היכולת המולדת של התמיינות וארגון hPSCs לייזום טובולוגנזה. בדיקה בודדת שמקורה בצלחת תרבית hPSC של 100 מ"מ כ-60% מניבה באופן שגרתי 500-1,000 אורגנואידים של הכליות, כפי שניתן לראות בפרסום הקודם שלנו5. בשל מספר כה גבוה של אורגנואידים שנוצרו, פרוטוקול זה מתאים היטב לבדיקות מורכבות. אנו משתמשים באופן שגרתי בפורמט 6-well לבדיקות מורכבות עם זאת, ניתן לשנות את קנה המידה של פרוטוקול זה בקלות בשלב השני (יום 3 ואילך) לפורמטים אחרים מרובי בארות לבדיקות תרכובות בתפוקה גבוהה יותר. אימונופלואורסצנציה של מקטעי פרפין מראה נוכחות של מקטעי נפרון באורגנואידים, כלומר צינוריות כלייתיות המבטאות בטא של גורם גרעיני הפטוציטים -1 (HNF1B) ולוטוס טטרגונולובוס לקטין (LTL) (איור 3A - HNF1B, LTL), וצבירי פודוציטים המבטאים V-maf שריר שריר-1 בטא (HNF1B) ונפרין (MAFB) ונפרין (NPHS1) (איור 3A - MAFB, איור 3B, איור 3B - NPHS1). יתר על כן, השינויים בפרוטוקול זה יכולים לתמוך בהרחבה של תאי אנדותל כפי שניתן לראות באיור 3B המציגים צביעה באמצעות טסיות דם ומולקולת הידבקות של תאי אנדותל 1 (PECAM1) ביום ה-26 של התרבית.
| מגיב | מניות conc. | עבודה conc. | סכום ל-250 מ"ל |
| TeSR-E5 | n/a | n/a | 238.48 מ"ל |
| PVA | 10% | 0.25% | 6.25 מ"ל |
| עט-סטרפ | 100x | 1x | 2.5 מ"ל |
| איטה | 100x | 0.1x | 250 μL |
| ליפידים מוגדרים כימית | 100x | 1x | 2.5 מ"ל |
| פלסמוצין | 25 מ"ג/מ"ל | 2.5 מיקרוגרם/מ"ל | 25 μL |
טבלה 1: הרכב בינוני E5-ILP. פיפטה את כל הריאגנטים למעט השומנים המוגדרים כימית ומגיב אנטי-מיקופלסמה ישירות לתוך החדר העליון של יחידת סינון Stericup של 0.22 מיקרומטר. לאחר הסינון, מוסיפים את השומנים ואת המגיב נגד מיקופלסמה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים.
| מגיב | מניות conc. | עבודה conc. | סכום ל-500 מ"ל |
| DMEM (גלוקוז נמוך) | n/a | n/a | 417.5 מ"ל |
| KOSR | n/a | 10% | 50 מ"ל |
| PVA | 10% | 0.25% | 12.5 מ"ל |
| עט-סטרפ | 100x | 1x | 5 מ"ל |
| מם-נאא | 100x | 1x | 5 מ"ל |
| גלוטמקס | 100x | 1x | 5 מ"ל |
| HEPES | 100x | 1x | 5 מ"ל |
| פלסמוצין | 25 מ"ג/מ"ל | 2.5 מיקרוגרם/מ"ל | 50 מיקרול |
טבלה 2: קומפוזיציה בינונית שלב II. פיפט את כל הריאגנטים למעט ומגיב אנטי-מיקופלסמה ישירות לתוך החדר העליון של יחידת סינון Stericup 0.22 μm. לאחר הסינון, הוסיפו ריאגנט אנטי-מיקופלסמה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים.
איור 1: סקירת פרוטוקול. סקירה סכמטית של הפרוטוקול המציגה תזמון של שני השלבים ושימוש בבקבוקי ספינר ו- 6MSP. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: שלבי הפרוטוקול. (A) תמונת שדה בהיר של מושבת hPSC שטופלה ב-GCDR. (B) מפגש אופטימלי, וגודל המושבה כדי להתחיל בבדיקה אורגנואידית של הכליה. (C) hPSCs שטופלו בהתנתקות למשך 6 דקות. חיצים אדומים מצביעים על קצוות המושבות המסתלסלים. (D) בדיקות אורגנואידיות על שייקר מסלולי. (E) שימוש במסננת של 200 מיקרומטר כדי לסנן גופים עובריים גדולים. (ו) גופים עובריים ביום 3 (D3) לפני המעבר למדיום שלב II. (G) ניתן לראות את הופעת היווצרות הצינוריות ביום 8 (D8) ו-(H) נקודת זמן אופטימלית לקצירת אורגנואידים ולטיפול בהם ביום 14 (D14). (I) בקבוקון ספינר המשמש לתרבית בתפזורת על לוח מגנטי רב-מצבי. (J) בדיקה על לוח ערבוב מגנטי רב-באר. סרגלי קנה מידה, 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: תוצאות צפויות. (A) תמונות קונפוקליות מייצגות של מקטעי פרפין מסומנים באופן אימונופלואורסצנטי של מקטעי פרפין מסומנים באופן אימונופלואורסצנטי של אורגנואידים בכליות ביום ה-14, המראים כתמים חיוביים לאפיתליה של צינוריות (HNF1B ו-LTL) ולאשכולות פודוציטים (MAFB). (B) יום 26 מקטעי אורגנואידים של כליות המסומנים עבור אשכולות פודוציטים (NPHS1) ותאי אנדותל (PECAM1). מוטות קנה מידה, 100 מיקרומטר (A); 200 מיקרומטר (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקרים קודמים הראו כי שלבי הפרוטוקול הראשוניים הם קריטיים עבורהתמיינות מזודרם ביניים 5,19,20, ולכן חיוני ליישם הרכב בינוני מחמיר בשלב זה. הסרת רכיבים לא מוגדרים כגון סרום, אלבומין, הכלאה נטולת חלבון מדיום II מהשלב הראשון של הפרוטוקול עשויה לסייע בשיפור יעילות ההבחנה העקבית בין בדיקות21.
המצב המטבולי של תאי הכליה הוא קריטי לתפקודם, ושינויים בגלוקוז יכולים להוביל לשינוי במצב מטבולי22. מחקרים קודמים תיארו כי רמות גבוהות של גלוקוז (עד 25 mM) יכולות לגרום לתפקוד לקוי של תאי האנדותל ולשנות את הגדילה ואת יכולת החמצון של תאי הכליה 22,23,24. רמות גבוהות של גלוקוז תוארו גם כדי לשנות את תפקוד המיטוכונדריה24, אשר עשוי להיות שלילי כאשר חוקרים מחלת כליות ונפרוטוקסיות או מבצעים גילוי תרופות באמצעות אורגנואידים של כליות. לכן, הפחתנו את רמת הגלוקוז בפרוטוקול שלנו כדי לקדם מצב מטבולי דמוי in vivo יותר של תאי הכליה האורגנואידים. כתוצאה מכך, השינויים בבדיקה האורגנואידית של הכליה מספקים פרוטוקול עקבי וחזק, תוך שמירה על פשטותו.
אורגנואידים של כליות אינם בשלים, ותרבית ממושכת (>20 יום) עלולה להוביל לשכיחות של סוגי תאים פרו-פיברוטיים ולא כלייתיים כפי שתואר קודם לכן 5,25, ולהשאיר את האורגנואידים פחות מייצגים רקמת כליה אנושית בריאה. בהתבסס על הניסיון שלנו, חלון הטיפול האופטימלי, שבו האורגנואידים של הכליות נמצאים במצב הבריא ביותר שלהם הוא בין הימים 14-18. שימוש בצלוחיות ספינר ובמערבבים מגנטיים מרובי בארות כפי שתואר לעיל ישפר את הזמינות האחידה של חומרים מזינים לעומת תרבית סטטית21,26. אם הציוד לתרבית המתלים כגון השייקר או המערבלים המגנטיים אינו זמין, פרוטוקול זה עדיין יכול להתבצע לחלוטין בלוחות החיבור הנמוכים במיוחד בתרבית הסטטית. עם זאת, תיתכן שכיחות מוגברת של גופים עובריים/מיזוג אורגנואידים, מה שמוביל לדגימות גדולות עם ליבות נמקיות עקב היפוקסיה. כל אורגנואידים הגדולים מ-500 מיקרומטר ניתנים להסרה באמצעות מסנני התאים שתוארו. כדי להפחית את הסיכוי למיזוג האורגנואידים במקרים אלה, אנו ממליצים לא לזרוע יותר מ -100 אורגנואידים לכל 6-well. בנוסף, לאחר האכלה, האורגנואידים צריכים להיות מופצים באופן שווה על ידי ביצוע תנועות איור שמונה עם הצלחת.
ניתן להבחין ביעילות נמוכה (<50%) של היווצרות אורגנואידים. זה קורה בדרך כלל כאשר תרביות hPSC הגיעו למפגש גבוה (>80%) במהלך המעבר הסטנדרטי. זה קריטי שתחזוקת hPSC תהיה עקבית והתאים לא יישארו למפגש יתר על המידה. מפגש גבוה וטכניקת מעבר לא עקבית עלולים גם הם להוביל להתמיינות ספונטנית ולמוות מוגבר של תאים. אם קיימת התמיינות בתרבית hPSC, אנו ממליצים להסיר את האזורים המובחנים על ידי שאיפה עם קצה פיפטה עדין אם הוא אינו עולה על 5% מאוכלוסיית התאים, לפני תחילת הבדיקה. אם אזורי ההבחנה עולים על 5%, אנו ממליצים להפשיר אצווה חדשה של hPSCs ולפצל אותה לפחות פעם אחת לפני תחילת בדיקה חדשה.
ראינו שקווי hPSC מסוימים נוטים יותר ליצור סוגי תאים שאינם כליות, כגון לב או רקמה עצבית. אם זה קורה, סינון גודל באמצעות מסנני התאים עשוי לעזור להסיר את אותם אורגנואידים המכילים גידולים שאינם כלייתיים. לחלופין, שינוי המדיום ו/או המטריצה של hPSC עשוי לסייע בהפחתת הגידולים שאינם כלייתיים. מניסיוננו, מדיית hPSC חלופית המכילה רכיבים מינימליים, ו- BME כגון vitronectin, מספקת נישה פלוריפוטנטית מחמירה יותר ובכך מסייעת ליצור תרבויות hPSC הומוגניות יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות R01 DK069403, UC2 DK126122 ו- P30-DK079307 וקרן ASN לחקר הכליות תוכנית עמיתי המחקר של בן ג'יי ליפס ל- AP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
| Anti-adherence rinsing solution | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | 10 mM stock in DMSO |
| Corning disposable spinner flasks | Fisher Scientific | 07-201-152 | |
| Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Corning Slow-Speed Stirrers | Fisher Scientific | 11-495-03 | Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | Aliquot and freeze |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 | |
| DPBS 1x, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14-190-250 | |
| Egg / Oval Stirring Bars | 2mag | PI20106 | |
| Excelta General-Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 17-456-103 | Keep sterile in the cell culture hood |
| EZBio Single Use Media Bottle, 250mL | Foxx Life Sciences | 138-3211-FLS | Used to make PVA 10% |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher | 08-772E | |
| Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL | Fisher Scientific | 14-955-135 | |
| Fisherbrand Cell Lifters - Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| Fisherbrand Multi Function 3D Rotators | Fisher Scientific | 88-861-047 | Orbital shaker |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413302 | BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex. |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutamine supplement. |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher | 15-630-080 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Thermo Fisher | 51-500-056 | ITSE |
| KnockOut Serum Replacement - Multi-Species | Thermo Fisher | A3181502 | KOSR. Aliquot and freeze |
| Lipid Mixture 1, Chemically Defined | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL | Fisher Scientific | S2GPU05RE | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL | Fisher Scientific | S2GPU02RE | |
| MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit | 2mag | VMF 90250 U | |
| MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive | 2mag | VMF 40600 | 6MSP |
| MP Biomedicals 7X Cleaning Solution | Fisher Scientific | MP0976670A4 | Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives. |
| Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15-140-122 | Aliquot and freeze |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze |
| pluriStrainer® 200 µm | Fisher Scientific | NC0776417 | Cell strainer |
| pluriStrainer® 500 µm | Fisher Scientific | NC0822591 | Cell strainer |
| Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS |
| ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 mM stock in DPBS |
| Sterile Disposable Serological Pipets - 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Sterile Disposable Serological Pipets - 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Sterile Disposable Serological pipette - 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | |
| TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | Serum-free, low protein base medium for E5-ILP |
| Variomag distriBOX 2 Distributor | 2mag | VMF 90512 | If you use more than one MIXdrive |
References
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).
- Przepiorski, A., et al. A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communication. 6, 8715 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Taguchi, A., Nishinakamura, R. Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
- Howden, S. E., Little, M. H. Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions. Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).
- Tanigawa, S., et al. Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors. Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).
- Sander, V., et al. Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells. STAR Protocols. 1 (3), 100150 (2020).
- Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin. Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).
- Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).
- Freund, C., et al. Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells. Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).
- Nishikawa, M., et al. An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).
- Oh, J. K., et al. Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors. Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).
- Lam, A. Q., et al. Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers. Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
- Imasawa, T., et al. High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy. FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).
- Kim, K. A., et al. High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).
- Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes. Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).
- Wu, H., et al. Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics. Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).
- Lei, X., Deng, Z., Duan, E. Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2016).
