Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

חסימה מיקרוכירורגית של היתוך האשכים בספודופטרה ליטורה

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62524
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1South China Normal University-Shipai Campus: South China Normal University, 2Southwest University
* These authors contributed equally

Summary

רדיד אלומיניום הוכנס מיקרוכירורגי בין האשכים של Spodoptera litura כדי לחסום את ההיתוך של האשכים. ההליך כולל הקפאה, תיקון, חיטוי, חתך, הצבת המכשול, תפירה, האכלה לאחר הניתוח ובדיקה. גישה זו מספקת שיטה להפריע להיווצרות רקמות.

Abstract

במקום להשתמש בשיטות גנטיות כמו הפרעות RNA (RNAi) ומקובצים באופן קבוע בין-מרחבי של חזרות פלינדרומיות קצרות (CRISPR)/CRISPR הקשורים לאנדונוקלאז Cas9, מחסום פיזי הוכנס מיקרו-כירורגית בין האשכים של Spodoptera litura כדי לחקור את ההשפעה של מיקרו-כירורגיה זו על צמיחתה ורבייתה. לאחר החדרת רדיד אלומיניום בין האשכים, חרקים מותכים במהלך מטמורפוזה המשיך כרגיל. צמיחת חרקים והתפתחותם לא שונו להפליא; עם זאת, מספר חבילות הזרע השתנה אם היתוך האשכים נעצר על ידי המיקרוכירורגיה. ממצאים אלה מרמזים כי חסימת היתוך האשכים יכולה להשפיע על יכולת הרבייה הגברית. השיטה יכולה להיות מיושמת עוד יותר כדי להפריע תקשורת בין איברים כדי ללמוד את הפונקציה של מסלולי איתות ספציפיים. בהשוואה לניתוח קונבנציונלי, מיקרוכירורגיה דורשת רק הרדמה הקפאה, אשר עדיף על פחמן דו חמצני מרדים. מיקרוכירורגיה גם ממזערת את אזור אתר הניתוח ומאפשרת ריפוי פצעים. עם זאת, בחירת חומרים עם פונקציות ספציפיות דורשת חקירה נוספת. הימנעות פגיעה ברקמות היא קריטית בעת ביצוע חתכים במהלך הניתוח.

Introduction

היתוך הוא תופעה נפוצה בהתפתחות רקמות או איברים. דוגמאות כוללות סגירת גב וסגירת בית החזה ב Drosophila1 ומורפוגנזה חיך, מורפוגנזה צינור עצבי, מורפוגנזה לב, מורפוגנזה לב בעכברים ועוף2. CRISPR ו- RNAi יושמו לחקור את תפקידי הגנים בתהליך ההיתוך2,3,4.

ספודופטרה ליטורה (באנגלית: Spodoptera litura; S. litura, Lepidoptera: Noctuidae) הוא מזיק פוליפגוס מזיק המופץ באופן נרחב באזורים טרופיים וסובטרופיים באסיה, כולל סין4,5,6. ההפצה הרחבה של S. litura מיוחסת בחלקה ליכולת הרבייה החזקה שלה, שרלוונטית להתפתחות גונדו. אי פוריות הגבר היא גישה אחת לשלוט במזיק זה. כפי שניתן לראות בדמות הסכמטית של מבנה האשכים, האשכים מוקפים במעטפת האשכים, כולל הנדן החיצוני (נדן הצפק) ולאמינה הבסיסית הפנימית. הלמינה הבסיסית משתרעת באופן פנימי ויוצרת את האפיתל הזקיקי ומפרידה את האזור הפנימי של האשכים לארבעה תאים הנקראים זקיקים (איור 1).

בזקיקים, זרעונים מתפתחים לזרעונים לאחר מיטוזה ומיוזה, ואז הזרעון בשקי הזרע מתיישר באותו כיוון כדי ליצור חבילות זרע7. במהלך spermatogenesis, הזרעונים העיקריים להבדיל לתוך זרעים eupyrene או זרע apyrene. זרעונים בשלב הזחל מתפתחים לזרע אופירין עם זנב ארוך המחובר לראש של גרעין מוארך; אלה יכולים להפרות ביצים. לעומת זאת, זרעונים בשלב אמצע הגולם מתפתחים לזרע apyrene עם גרעין שהושלך; זרעים אלה מסייעים להישרדות, תנועה והפריה של זרע אופירין9,10. היום השישי של הגולם הוא התקופה שבמהלכה האשכים יש חבילות זרע אופירין ו apyrene בשפע.

Figure 1
איור 1: דיאגרמה סכמטית של מבנה האשכים של חרקי לפידופטרה11. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

היתוך האשכים מתרחש ברוב החרקים של סדר לפידופטרה 11,12, במיוחד באותם מינים שהם מזיקים חקלאיים. היתוך האשכים מתייחס זוג האשכים גדל דו צדדי בשלב הזחל, מתקרב ודבק זה בזה, בסופו של דבר משתלב לתוך gonad11 יחיד. ב Spodoptera litura, זה קורה במהלך מטמורפוזה מן הזחל לשלב pupal. מהיום הראשון של האינסטאר החמישי (L5D1) ועד היום הרביעי של האינסטאר השישי (L6D4), זוג האשכים גדל בהדרגה בגודלו, והצבע הופך לצהוב בהיר מלבן שנהב. זה הופך להיות אדום קלוש כפי שהוא מגיע לשלב prepupal (L6D5 כדי L6D6). שני אשכים סימטריים דו-צדדיים מתקרבים זה לזה בשלב שלפני ההשמדה, מתמזגים לאחד, ומעוותים את כיוון השעון (תצוגת דוראל) כדי לייצר אשכים בודדים בשלבי הגולם והמבוגרים11. תופעה זו אינה מתרחשת בתולעי משי, אשר יש חשיבות כלכלית ניכרת כבר מבויתים במשך 5000 שנים13. לכן, ההנחה היא כי ההיתוך של האשכים משפר את יכולת הרבייה.

כדי לקבוע את המשמעות של היתוך האשכים Spodoptera litura , חשוב לחקור את ההשפעות של חסימת התהליך. בפרוטוקול זה, רדיד אלומיניום הוכנס מיקרוכירורגי בין האשכים כדי להפריד ביניהם, ואת השינויים הנובעים מכך בהתפתחות החרקים ואת האשכים שלהם נחקרו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. גידול ותחזוקה של חרקים

  1. תרבות זחלי Spodoptera litura בתאי סימולציה סביבתיים עם דיאטה מלאכותית עד שהם מגיעים ליום 4 של כוכב 6 ( L6D4). בחר זחלים זכריים כאשר התולעים נכנסות ליום הראשון של האינסטאר השישי (L6D0) בהתבסס על המבנה ההפוך בצורת משולש על הבטן השמינית14.
    הערה: טכניקות גידול ותחזוקה של זחלים פורסמו בעבר 4,14.

2. הכנה טרום-כירורגית

  1. חותכים את רדיד האלומיניום לחתיכות מלבניות עם פינות מעוגלות (1 מ"מ x 2 מ"מ, איור 2).
  2. לעקר את פלטפורמת הניתוח ואת הפריטים הקשורים (משטח השולחן, מיקרוסקופ, מקרר, קופסת חרקים, מגש שעווה, סיכות, חוט) על ידי ריסוס 75% אלכוהול על פני השטח שלהם וניגוב אותם.
  3. לחטא כלים כירורגיים (כולל רדיד אלומיניום) עם עיקור קיטור בלחץ גבוה במשך 30 דקות, ולהניח אותם בתנור חימום וייבוש ב 120 °C (50 °F).
  4. ודא שהמפעילים לובשים בגדי מעבדה נקיים, מסכות כירורגיות וכפפות סטריליות.

3. מיקום מיקרו-כירורגי של מחסום בין האשכים

הערה: זרימת העבודה הכללית היא כדלקמן: הקפאת → תיקון → חיטוי → חתך → מיקום מחסום → תפירה→ האכלה ובדיקה לאחר הניתוח

  1. מניחים זחלים זכריים (L6D4) על קרח במשך 10-30 דקות כדי לשמור אותם מורדמים במהלך הניתוח.
  2. מניחים זחל על מגש השעווה עם הצד הגבי למעלה, ולאחר מכן מתקנים את הראש והזנב של הזחל עם סיכות וחוטים, ומציגים את האזור הניתוחי שהוא משטח הגב בקטע הגוף התשיעי (איור 3A).
  3. לחטא את האזור הניתוחי על ידי החלת תמיסת יוד 3% עם צמר גפן על האפידרמיס (קטע הגוף התשיעי ), ואחריו 70% אלכוהול כדי להסיר את היוד (איור 3B).
    הערה: התמקדו בזחל באמצעות התאמה גסה ועדינה של המיקרוסקופ הכירורגי (איור 3C). מניחים את מגש השעווה על צלחת תרבות גדולה יותר מלאה בקרח כדי לשמור על ההרדמה.
  4. בצע חתך באורך 2 מ"מ על האפידרמיס הגבי של קטע הגוף התשיעי . לאחר מכן, השתמש ספוגית כותנה סטרילית כדי להסיר כל המולימפה דולפת וגופי שומן ולקבל תצוגה ברורה של האזור הניתוחי.
    הערה: חשוב להימנע מהלב במהלך ההליך. זה יכול להיעשות על ידי ביצוע החתך מעט ליד קו האמצע בקטע הגוף ה - 9 או במפרק בין מקטעי הגוף ה - 9 וה - 10 כדי למנוע מהאשכים לצאת בגלל הלחץ הפנימי הזחלי. בעת השימוש באזמל, בצעו תחילה חריץ אנכי עם הלהב (איור 4A), ולאחר מכן סובבו אותו ב-45° לכיוון האפידרמיס לפני חיתוך אחיד ורציף של האפידרמיס (איור 4B).
  5. השתמשו בפינצטה כירורגית כדי להכניס פיסת רדיד אלומיניום בין האשכים (איור 5).
  6. בסוף הניתוח, לסגור את החתך כדי למנוע זיהום, ולאפשר לזחלים להתאושש מהניתוח.
    1. סגרו את האפידרמיס עם תפר פועל (איור 6).
    2. השתמשו במחזיק מחטים ובפינצטה כירורגית כדי לקשור קשר מרובע כירורגי, הדורש שני קשרים פשוטים מנוגדים של תמונת מראה (איור 6D, E).
    3. השתמש במספריים כדי לחתוך את התפר העודף מזנבות הלולאה, משאיר חוט 2 מ"מ מאחור.
  7. לאחר התפירה, מניחים בעדינות את הזחל בקופסת הגידול ושומרים עליהם בתא סימולציה סביבתי נקי. המשך להתבונן בזחלים.
    הערה: הפצע מפסיק לדלוף המולימפה, והזחלים מתאוששים בהדרגה לאחר הניתוח. התולעים ממשיכות להשלים את המטמורפוזה שלהן.

Figure 2
איור 2: מחסום פיזי שהוכן באמצעות רדיד אלומיניום (1 מ"מ x 2 מ"מ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: לפני החתך. (א) תיקון הזחל. (ב) חיטוי האפידרמיס של האזור הכירורגי. (ג) ביצוע ניתוח תחת המיקרוסקופ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: חתך. (א) חתך את הזחלים אנכית עם הלהב. (B) סובב את הלהב 45° לכיוון האפידרמיס לפני חיתוך דרך. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: החדרת המחסום הפיזי (רדיד אלומיניום) בין האשכים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: תפירה. (א) הכנס את המחט. (ב) למשוך את המחט. (ג) לסגת ולהדק את המחט. (ד) לקשור את הקשר הפשוט הראשון. (ה) קשרו את הקשר הפשוט הנגדי בתמונה במראה. (F) לחתוך חוט תפר עודף. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ההשפעות של מיקרוכירורגיה על Spodoptera ליטורה צמיחה ופיתוח
המיקרוכירורגיה הותירה פצע באורך 2 מ"מ על אפידרמיס זחל הגב שבסופו של דבר הפסיק לדלוף המולימפה ונרפא. הזחלים עברו שלבים מוקדמים וגולם ועיקלו, מה שמצביע על כך שלמיקרוכירורגיה לא הייתה השפעה משמעותית על הצמיחה וההתפתחות. כאשר הזחלים התמזגו לתוך גולם, חוטי התפר הושלכו יחד עם האפידרמיס. לא היו הבדלים ברורים במראה של הגולם שעשה ולא עבר ניתוח. לאחר העיקול, נקבות בוגרות הזדווגו בהצלחה עם הזכרים הבוגרים שניתחו בעבר, וכתוצאה מכך ביציות מופרות וזחלים בוקעים (איור 7).

Figure 7
איור 7: פיתוח ליטורה ספופטרה לאחר מיקרו-כירורגיה. (א) זחל זכר ב- L6D4. (B) L6D4 זחל מיד לאחר הניתוח. (ג) טרום גולם (L6D6). (ד) P0, החץ האדום מציין את מיקום הניתוח; החץ הצהוב מראה את האפידרמיס שהושלך עם חוט תפר. (ה) זיווג מבוגרים. (ו) ביצים וזחלים בקעו מנקבה בוגרת המזדווגת עם זכר שעבר ניתוח. סרגלי קנה מידה = 1 ס"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הזחלים עברו את שלב הגולם והתעללו לאחר המיקום המיקרוכירורגי של רדיד אלומיניום בין האשכים. תוצאות מפורטות לאחר פעולה זו פורסמו בעבר11. למרות שהמחסום מנע מהאשכים להתמזג בחלק מהזחלים, רוב הזחלים עברו היתוך אשכים במהלך מטמורפוזה של זחלים עד גומות.

במחקר זה, אנשים קובצו על ידי שלושה טיפולים: ניסיוני (Exp), Sham-operation (Ctl-sham), ולא ניתוח (CTL). אנשים מקבוצת Exp עברו מיקרוכירורגיה כדי להכניס מחסום פיזי, והאשכים שלהם נותרו מופרדים בשלבי הגולם והמבוגרים. יחידים מקבוצת CTL-sham עברו את אותה מיקרו-כירורגיה; עם זאת, האשכים שלהם לא נחסמו והתמזגו מסיבות לא ידועות. קבוצת CTL הכילה את הזחלים שגדלו באופן טבעי ללא ניתוח; שני האשכים שלהם התמזגו בדרך כלל במהלך השלב הטרום-גופני.

קבוצת המיקרו-כירורגיה הכילה שתי תת-קבוצות: זחלים שעברו מיקרו-כירורגיה כדי להציב מחסום בין שני האשכים (קבוצה A) ואלה שעברו מיקרו-כירורגיה כדי להסיר אשכים אחד (קבוצה ב': האשכים השמאליים הוסרו בקבוצה B-1; האשכים הימניים הוסרו בקבוצה B-2). טבלה 1 מציגה את מספרי הזחלים המבצעיים, שיעורי התמותה של הזחלים, מספרי הגלמים, אחוזי הגור, מספר המבוגרים, אחוזי הופעת המבוגרים, אחוזי ההזדווגות המוצלחת ואחוזים של פעולות מוצלחות בקבוצות שונות. קבוצה א' כוללת זחלים שעברו מיקרו-כירורגיה כדי להכניס מחסום בין האשכים. ההצלחה של הליך זה יכולה להיקבע רק לאחר ניתוח, אשר כאשר הם חולקו עוד יותר לקבוצות Exp ו- Ctl-sham.

כפי שניתן לראות באיור 8, שיעור התמותה מהזחלים היה מעט גבוה יותר בקבוצה הכירורגית, בעוד שאחוזי הגור, הופעת המבוגרים וההזדווגות המוצלחת היו מעט נמוכים יותר בקבוצה הכירורגית מאשר בקבוצת הביקורת. עם זאת, אף אחד מההבדלים לא היה שונה באופן משמעותי, מה שמצביע על כך שהמיקרוכירורגיה לא השפיעה באופן משמעותי על הצמיחה וההתפתחות של זחלי Spodoptera litura .

קבוצה מספר זחלים שיעור תמותת זחלים/% מספר גולם אחוז הגור/% מספר מבוגר אחוז הופעת מבוגרים/% אחוז ההזדווגות המוצלחת/% אחוז הפעולה המוצלחת/%
קבוצת מיקרו-כירורגיה A-1* 79 35.4 39 76.5 N N N 10.3
קבוצת מיקרו-כירורגיה A-2* 117 12.8 102 100 N N N 11.8
קבוצת מיקרו-כירורגיה A-3* 73 13.7 57 90.5 N N N 10.5
קבוצת מיקרו-כירורגיה A-4 101 4 97 96 29 29.9 N 26.9
קבוצת מיקרו-כירורגיה A-5 176 20.1 140 79.5 28 20 44.4 25
קבוצת מיקרו-כירורגיה A-6 434 12.4 376 98.9 209 55.6 26.8 14.3
קבוצת מיקרוכירורגיה A-7 260 10.8 135 58.2 66 48.9 47 48.4
קבוצת מיקרו-כירורגיה A-8 49 24.5 37 100 21 56.8 81 58.8
קבוצת מיקרו-כירורגיה B-1 117 29.1 71 85.5 30 42.3 23.3 N
קבוצת מיקרו-כירורגיה B-2 188 6.9 172 98.3 115 66.9 35.7 N
ממוצע קבוצת מיקרו-כירורגיה (ממוצע± SD) 159 17±10.1 123 88.3±13.7 71 45.8±16.3 43±20.8 25.8±18.5
קבוצת בקרה 1* 40 17 37 100 N N N N
קבוצת בקרה 2 300 0 281 93.7 184 65.5 N N
קבוצת בקרה 3 354 11 305 96.8 127 41.6 N N
קבוצת בקרה 4 679 2.7 638 96.5 534 83.7 41.2 N
קבוצת בקרה 5 448 4.2 399 93 232 58.1 60 N
קבוצת בקרה 6 490 7.1 448 98.5 355 79.2 48 N
ממוצע קבוצת בקרה (ממוצע± SD) 385 5.4±6.2 351 96.4±2.7 286 65.6±15.1 50±9.5 N

טבלה 1: ההשפעות של מיקרוכירורגיה על פיתוח Spodoptera litura. קבוצות מיקרו-כירורגיה B-1 ו-B-2 עברו מיקרו-כירורגיה להסרת אשכים חד-צדדיים (משמאל בקבוצת מיקרו-כירורגיה B-1 ומימין בקבוצת מיקרו-כירורגיה B-2). הערה: קבוצות מיקרוכירורגיה A-1 עד A-8 עברו מיקרוכירורגיה כדי להכניס מחסום בין האשכים; קבוצות מיקרו-כירורגיה B-1 ו-B-2 עברו מיקרו-כירורגיה להסרת אשכים חד-צדדיים (משמאל בקבוצת המיקרו-כירורגיה B-1 ומימין בקבוצת מיקרוכירורגיה B-2); השיעורים והאחוזים ניתנים כ- Mean ± SD. כוכביות מצביעות על כך שהאנשים בקבוצה נותחו בשלב הגולם, ולא היו נתונים סטטיסטיים על מספר המבוגרים, אחוז הופעת המבוגרים או אחוז ההזדווגות המוצלחת; N מציין שאין נתונים.

Figure 8
איור 8: השפעת המיקרו-כירורגיה על הצמיחה וההתפתחות של Spodoptera litura של (n ≥ 6). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

השפעת המיקרו-כירורגיה על מספר חבילות הזרע של ספודופטרה ליטורה
מיקרוכירורגיה בוצעה כדי להכניס מחסום פיזי כדי לעצור את היתוך האשכים או להסיר אשכים חד צדדיים Spodoptera litura. חבילות זרע Eupyrene ו apyrene נספרו כדי לחשב את האחוז של חבילות זרע eupyrene ביום השישי של שלב הגולם. האנשים קובצו לפי טיפול, כמתואר לעיל. המספרים של חבילות זרע (חבילות זרע eupyrene, חבילות זרע apyrene, וסה"כ) היו נמוכים באופן משמעותי בקבוצת Exp מאשר בקבוצות CTL-sham ו- CTL. המספר הממוצע של חבילות זרע eupyrene משני אשכים מופרדים בקבוצת Exp היה 2082 ± 599. בקבוצות CTL-sham ו- CTL עם אשכים מותכים, מספר חבילות הזרע של אופירין נע בין 4652 ל -6200.

מספר חבילות הזרע של Apyrene בקבוצת Exp היה 1602 ± 703, בעוד שהוא נע בין 3299 ל 4632 בקבוצות CTL-Sham ו- CTL. סך חבילות הזרע בקבוצת Exp היה 3684 ± 985; הוא נע בין 9284 ל-10832 בקבוצות CTL-Sham ו-CTL. לכן, האחוזים של חבילות זרע eupyrene נע בין 50% ל 60%, ללא הבדלים משמעותיים בין כל שלוש הקבוצות. איור 9 מראה כי כאשר נמנע היתוך, כמות חבילות הזרע של אופירין ואפירין ירדה, ואילו אחוז חבילות הזרע של אופירין לא השתנה.

Figure 9
איור 9: מספר חבילות הזרע והאחוזים של חבילות הזרע של אופירין בקבוצות שונות. (א) מספר חבילות הזרע בקבוצת Exp היה נמוך משמעותית מאשר בקבוצות CTL-sham ו- CTL. (ב) אחוזי חבילות הזרע של אופירין לא היו שונים באופן משמעותי בין שלוש הקבוצות. כוכבית מצביעה על הבדל משמעותי בהשוואה ל- Ctl. P < 0.05, ממוצע ± SD (n ≥5). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

לאחר הסרת אשכים חד צדדיים של הזחלים, המספרים של חבילות זרע eupyrene ו apyrene נספרו כדי לחשב את האחוז של חבילות זרע eupyrene ביום השישי של שלב הגולם. מספר חבילות הזרע eupyrene ו apyrene נע בין 1286 ל 1638 ו 720 עד 850, בהתאמה, כלומר המספר הכולל נע בין 2006 ל 2488, המקביל לאחוז חבילת זרע eupyrene של 63% עד 65%. איור 10 מראה כי מספר חבילות הזרע ירד באופן משמעותי לאחר הסרת האשכים החד-צדדית (הופחת ב-60% ל-70%), ללא השפעה רבה על אחוז חבילות הזרע של אופירין.

Figure 10
איור 10: מספרי חבילות הזרע והאחוזים של חבילות הזרע של אופירן לאחר הסרת האשכים החד- צדדיים. (A) מספרי חבילות הזרע בגופים שעברו הסרת אשכים חד צדדית היו שונים באופן משמעותי בין שלוש הקבוצות (אשכים שמאליים וימניים הוסרו בקבוצת מיקרו-כירורגיה B-1 וקבוצת מיקרוכירורגיה B-2, בהתאמה) (B ) אחוז חבילות הזרע eupyrene בגולם שעברו הסרת אשכים חד צדדית לא היה שונה באופן משמעותי לעומת Ctl. הכוכבית מצביעה על הבדל משמעותי בהשוואה ל- Ctl. P < 0.05, ממוצע ± SD (n ≥8). קבוצת בקרה = ללא ניתוח, האשכים התמזגו באופן טבעי במהלך השלב שלפני הגוף; קבוצת CTL-Sham = פעולה לא מוצלחת ואשכים התמזגו לאחר מיקרו-כירורגיה; Exp. Group = מיקרו-כירורגיה שבוצעה כדי להכניס מחסום פיזי בין שני האשכים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לאחר הפרעה מיקרוכירורגית היתוך האשכים Spodoptera litura, מספר חבילות הזרע ירד, אשר תמך בהשערה כי היתוך זה מועיל ליכולת הרבייה. מניפולציה כירורגית שימשה לחקר ההתפתחות הפיזיולוגית של חרקים מאז תחילת המאה ה -20. כדי לקבוע אם עצב הגולגולת מוסדר על ידי מטמורפוזה חרקים, כמה חוקרים ביצעו הליכים כגון קשירה ועריפה על חרקים שונים (כולל רודניוס פרוליקסוס של המיפטרה, לימנטריה dispar של Lepidoptera)15,16. תהליך עריפת הראש כרוך בהסרת הראש עם אזמל, חיטוי עם אנטיביוטיקה, ואיטום שעוות פרפין של הפצע לאחר ניתוח17. לאחר מיצוי והשתלה של בלוטות פרותורקה של בומביקס מורי, הפצע היה חתום עם שעוות פרפין18. עם זאת, ההשלכות הבלתי נמנעות של טיפולים קונבנציונליים אלה הן זיהום ושיעור תמותה גבוה, מה שמקשה על ניתוח המצב הפיזיולוגי בשלבים המאוחרים של התפתחות החרק.

לכן, פרוטוקול זה נועד להבטיח ניתוח זעיר פולשני שנעשה תחת המיקרוסקופ כדי למזער את הפצע. יתר על כן, בהשוואה להרדמה של פחמן דו חמצני, הקפאת מרדים היא ריאלית ונוחה יותר. רדיד אלומיניום, המשמש כחוסם, נחתך לגודל של 1 מ"מ x 2 מ"מ, שטח שווה ערך למרווח שבין האשכים. בעקבות מיקרוכירורגיה, חוטי התפר נופלים עם האפידרמיס המוקדם במהלך מותך, ומאפשר מטמורפוזה ופיתוח להמשיך כרגיל. תוצאות הרבייה מצביעות על כך שמיקרו-כירורגיה מוצלחת לא השפיעה באופן משמעותי על התפתחות החרקים. כאשר האשכים לא התמזגו, המספרים של סך, eupyrene, וחבילות זרע apyrene היו נמוכים באופן משמעותי מאלה בקבוצת CTL. תוצאות אלה מצביעות על כך שיכולת הרבייה הגברית מושפעת מהיתוך האשכים. להערכת איכות וחיוניות תאי הזרע יש אינדקסים ושיטות שונות בבעלי חיים שונים, כולל מצב אקרוזומלי זרע ביונקים19, תנועתיות זרע20, פעילות מיטוכונדריאלית21, שלמות קרום פלזמה22, וסמנים אחרים23,24 . בשל התפתחות תאי הזרע הייחודית של החרקים, מחקרים עתידיים צריכים לבחון שינויים ביכולת הרבייה (הזדווגות, דגירה25).

שלבים קריטיים בפרוטוקול זה דורשים תשומת לב מיוחדת כדי להבטיח תוצאות אמינות. הימנעות מפגיעה ברקמות אחרות חשובה בעת ביצוע החתכים. שנית, בחירת חומר המכשול חייבת להתבסס על תכונותיו הלא רעילות והסטריליות והיעדר גבולות חדים. לבסוף, החתך נסגר עם תפר ריצה וקשר מרובע כירורגי, ואחריו איטום באזור הניתוח כדי למנוע ביעילות זיהום לאחר הניתוח. ניתוחים על המבנה הפנימי של החרק כגון השתלה, מיצוי ויישום של תרופות עדיין יכולים להתבצע, ואחריו איטום באזור הניתוח.

שיעורי הצלחה גבוהים דורשים כישורים מיומנים, ולטכניקה זו יש כמה חסרונות. ראשית, זה לא יעיל, כמו הפעולות נעשות אחד אחד, בשל אשר וריאציה בודדת היא בלתי נמנעת. מחקרים ראשוניים הראו כי בעת שימוש בצינורות עירוי ורידים רפואיים, דיאפרגמות גומי, חרוזים סופגים וחומרים דנטליים כדי להפריד את האשכים, התוצאות לא היו מוצלחות כצפוי. יתר על כן, הטכניקה אינה מצליחה כאשר המכשיל נסחף. סיבות אפשריות לירידה בשיעור ההצלחה הכירורגית כוללות את המחסום מחליק כאשר החרקים זזים, מתכווצים, מכווצים, molt, ומארגנים מחדש איברים במהלך השלב הטרום-גופני. לחלופין, ניתן להכניס את רדיד האלומיניום קרוב מדי למעי הסיכה, מה שגורם למחסום לצוף משם. לכן, חומר מתאים צריך להיות אופטימיזציה נוספת.

למרות המגבלות של מיקרוכירורגיה, הוא מספק שיטה להשיג תוצאות ראשוניות על תופעות ביולוגיות לפני הקמת מערכת מודל מהונדסת. סוויני ו-ווטרסון ניתחו את התפתחות ההפטרה בעוברים של אפרוחים על ידי החדרת בלוקים של רדיד טנטלום26, בעוד שוויילד ולוגן השתמשו בנייר אלומיניום כמחסום בלתי חדיר כדי לחקור את תפקידה של חומצה רטינואית מאותתת באינדוקציה ובחניכה שלאחר מכן של קדמת הבמה וההילונדס27. ב Spodoptera litura חסר חוליות, מיקרוכירורגיה זו מאפשרת בהצלחה צמיחה והתפתחות תולעת נורמלית, מתן דרך לחקור תופעות פיזיולוגיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (Nos.:31772519, 31720103916; ) ומענק פתוח ממעבדת המפתח הממלכתית לביולוגיה של גנום תולעי משי, אוניברסיטת דרום מערב (מס ': sklsgb2013003).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
75% Rubbing alcohol Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd Q/370285HNW 001-2019
Colored Push Pins Deli Group Co.,LTD 0042
Corneal Scissors Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd MR-S221A Curved and blunt tip
Glad Aluminum Foil Clorox China(Guangzhou) Limited 831457 10 cm*2.5 cm*0.6
Medical Cotton Swabs (Sterile) Winner Medical Co., Ltd. 601-022921-01
Medical Iodine Cotton Swab Winner Medical Co., Ltd. 608-000247
Needle holder Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J32030 14 cm fine needle
Sterile surgical blade Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD #11
Suigical Blade Holder Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD K6-10 Straight 3#
Suture thread with needle Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm
Tying Forceps Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd MR-F201T-3 Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zeitlinger, J., Bohmann, D. Thorax closure in Drosophila: involvement of Fos and the JNK pathway. Development. 126 (17), 3947-3956 (1999).
  2. Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Development. 139 (10), 1701-1711 (2012).
  3. Ducuing, A., Keeley, C., Mollereau, B., Vincent, S. A. DPP-mediated feed-forward loop canalizes morphogenesis during Drosophila dorsal closure. The Journal of Cell Biology. 208 (2), 239-248 (2015).
  4. Du, Q., et al. Identification and functional characterization of doublesex gene in the testis of Spodoptera litura. Insect Science. 26 (6), 1000-1010 (2019).
  5. Qin, H. G., Ding, J., Ye, Z. X., Huang, S. J., Luo, R. H. Dynamic analysis of experimental population of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 13 (2), 45-48 (2004).
  6. Guan, B. B., et al. The research in biology and ecology of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 8 (1), 57-61 (1999).
  7. Wen, L., et al. The testis development and spermatogenesis in Spodopture litura (lepidoptera: noctuidae). Journal of South China Normal University (Natural Science Edition. 51 (4), 47-56 (2019).
  8. Friedländer, M., Seth, R. K., Reynolds, S. E. Eupyrene and apyrene sperm: dichotomous spermatogenesis in Lepidoptera. Advances in Insect Physiology. 32, 206 (2010).
  9. Cook, P. A., Wedell, N. Non-fertile sperm delay female remating. Nature. 397 (6719), 486 (1999).
  10. Iriki, S. On the function of apyrene spermatozoa in the silk worm. Zoological Magazine. 53, 123-124 (1941).
  11. Liu, L., Feng, Q. L. The study of fusion of testis in Lepidoptera insects. Journal of South China Normal University (Natural Science Edition). 46 (5), 1-7 (2014).
  12. Klowden, M. J. Physiological systems in insects. , Elsevier/Academic Press. Amsterdam, NL; Boston, MA. (2007).
  13. Xu, J., et al. Transgenic characterization of two testis-specific promoters in the silkworm, Bombyx mori. Insect Molecular Biology. 24 (2), 183-190 (2015).
  14. Guo, X. R., Zheng, S. C., Liu, L., Feng, Q. L. The sterol carrier protein 2/3-oxoacyl-CoA thiolase (SCPx) is involved in cholesterol uptake in the midgut of Spodoptera litura: gene cloning, expression, localization and functional analyses. BioMed Central Molecular Biology. 10, 102 (2009).
  15. Kopeć, S. Studies on the necessity of the brain for the inception of insect metamorphosis. Biological Bulletin. 42 (6), 323-342 (1922).
  16. Wigglesworth, V. B. Factors controlling moulting and 'metamorphosis' in an insect. Nature. 133 (5), 725-726 (1934).
  17. Williams, C. N. Physiology of insect diapause; the role of the brain in the production and termination of pupal dormancy in the giant silkworm, Platysamia cecropia. Biological Bulletin. 90 (3), 234-243 (1946).
  18. Fukuda, S. Hormonal control of molting and pupation in the silkworm. Proceedings of the Imperial Academy Tokyo. 16 (8), 417-420 (1940).
  19. Tian, H. J., Liu, Z. P., Bai, Y. Y. Common methods to detect Sperm quality of mammalian. Journal of Economic Zoology. 8 (4), 198-201 (2004).
  20. Ji, X. S., Chen, S. L., Zhao, Y., Tian, Y. S. Progress in the quality evaluation of fish sperm. Chinese Fishery Science. 14 (6), 1048-1054 (2007).
  21. Baulny, B. O. D., Vern, Y. L., Kerboeuf, D., Maisse, G. Flow cytometric evaluation of mitochondrial activity and membrane integrity in fresh and cryopreserved rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) spermatozoa. Cryobiology. 34 (2), 141-149 (1997).
  22. Krasznai, Z., Márián, T., Balkay, I., Emri, M., Trón, L. Permeabilization and structural changes in the membrane of common carp (Cyprinus carpio L.) sperm induced by hypo-osmotic shock. Aquaculture. 129 (1), 134 (1995).
  23. Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry & Physiology Toxicology & Pharmacology Cbp. 130 (4), 425-433 (2001).
  24. Rurangwa, E., Volckaert, F. A., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardized fertilization in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55 (3), 751-769 (2001).
  25. Seth, R. K., Kaur, J. J., Rao, D. K., Reynolds, S. E. Effects of larval exposure to sublethal concentrations of the ecdysteroid agonists RH-5849 and tebufenozide (RH-5992) on male reproductive physiology in Spodoptera litura. Journal of Insect Physiology. 50 (6), 505-517 (2004).
  26. Sweeney, R. M., Watterson, R. L. Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks. American Journal of Anatomy. 126 (2), 127-149 (1969).
  27. Wilde, S., Logan, M. P. Application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick. Journal of Visualized Experiments. (117), e54618 (2016).

Tags

ביולוגיה גיליון 173 היתוך של האשכים מיקרוכירורגיה חסימה ספדופטרה ליטורה
חסימה מיקרוכירורגית של היתוך האשכים <em>בספודופטרה ליטורה</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

He, X., Ma, Q., Jian, B., Liu, Y.,… More

He, X., Ma, Q., Jian, B., Liu, Y., Wu, Q., Chen, M., Feng, Q., Zhao, P., Liu, L. Microsurgical Obstruction of Testes Fusion in Spodoptera litura. J. Vis. Exp. (173), e62524, doi:10.3791/62524 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter