Summary
उत्पादित कीट आंत में पौधे वायरस प्रोटीन और वेक्टर कीट प्रोटीन दोनों के इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग वायरस और वेक्टर कीटों, कीट प्रोटीन कार्यों और वायरस संचरण के अंतर्निहित आणविक तंत्र के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
Abstract
प्रकृति में अधिकांश पौधों के वायरस हेमिप्टेरन कीड़ों द्वारा एक पौधे से दूसरे पौधे में प्रेषित होते हैं। वेक्टर कीटों का एक उच्च जनसंख्या घनत्व जो वायरस संचरण में अत्यधिक कुशल हैं, खेतों में वायरस महामारी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। वायरस-कीट वेक्टर इंटरैक्शन का अध्ययन पौधों के वायरस और उनके वेक्टर कीटों को नियंत्रित करने के लिए नई रणनीतियों को डिजाइन करने के उद्देश्य से वायरस संचरण और महामारी की हमारी समझ को आगे बढ़ा सकता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग का व्यापक रूप से रोगजनकों और मेजबानों के बीच बातचीत का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है और इसका उपयोग यहां सफेद-समर्थित प्लांटहॉपर (डब्ल्यूबीपीएच, सोगाटेला फरसीफेरा) में किया जाता है, जो मिडगट एपिथेलियल कोशिकाओं में विषाणुओं और कीट प्रोटीन का पता लगाने के लिए दक्षिणी चावल काले लकीर वाले बौने वायरस (एसआरबीएसडीवी, जीनस फिजीवायरस, परिवार रिओविरिडे) को कुशलतापूर्वक प्रसारित करता है। लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए, हमने मिडगट उपकला कोशिकाओं की रूपात्मक विशेषताओं, कीट प्रोटीन के सेलुलर स्थानीयकरण और वायरियन और एक कीट प्रोटीन के कोलोकलाइजेशन का अध्ययन किया। इस प्रोटोकॉल का उपयोग कीड़ों में वायरस की गतिविधियों, कीट प्रोटीन के कार्यों और वायरस और वेक्टर कीट के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
अधिकांश वर्णित पौधों के वायरस हेमिप्टेरा क्रम से कीड़ों द्वारा प्रेषित होते हैं जिसमें एफिड्स, व्हाइटफ्लाइज़, लीफहॉपर, प्लांटहॉपर और थ्रिप्स 1,2 शामिल हैं। हेमिप्टेरन कीटों के भेदी-चूसने वाले मुंह के हिस्से लार को खिलाने और स्रावित करने के लिए पौधे के ऊतकों को छेदते हैं, सहवर्ती रूप से वायरस2 को कुशलतापूर्वक प्रसारित करते हैं। वेक्टर कीटों द्वारा पौधों के वायरस के विभिन्न संचरण तंत्र का वर्णन किया गया है। इनमें गैर-निरंतर, अर्ध-स्थायी और निरंतर शामिल हैं। लगातार प्रकार या तो गैर-प्रचारक याप्रचारात्मक 3,4 है, लेकिन इन दोनों प्रकारों के लिए, संचारित वायरस को कीट के पूरे शरीर में स्थानांतरित होना चाहिए। लगातार-प्रचार मोड में, वायरस शुरू में कीट की आंत के उपकला कोशिकाओं में संक्रमित और प्रतिकृति करते हैं, फिर विभिन्न ऊतकों में फैलते हैं, और अंततः लार ग्रंथियों में फैलते हैं, जहां से उन्हें कीट खिलानेके दौरान लार के माध्यम से पौधे में पेश किया जा सकता है। लगातार संचारित वायरस विभिन्न अंगों के माध्यम से चलते हैं और अपने कीट वैक्टर में प्रतिकृति करते हैं, जिसके लिए विभिन्न चरणोंमें वायरस और वेक्टर घटकों के बीच विशिष्ट बातचीत की आवश्यकता होती है।
वायरल प्रोटीन और कीट प्रोटीन को वेक्टरकीटों में वायरस की पहचान, संक्रमण, प्रतिकृति या प्रसार के लिए महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं को सुविधाजनक बनाने के लिए बातचीत करनी चाहिए। यद्यपि ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कीड़ों में सेलुलर संरचनाओं का निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, यह वायरल प्रोटीन और कीट प्रोटीन के वायरियन वितरण, सेलुलर स्थानीयकरण या कोलोकलाइजेशन, या कीट ऊतकों और कोशिकाओं की अल्ट्रास्ट्रक्चर को नहीं दिखा सकता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग पहली बार कून्स एट अल द्वारा माउस की फागोसाइटिक कोशिकाओं में विशिष्ट फ्लोरेसिन एंटीबॉडी को लेबल करने केमाध्यम से की गई थी, और अब इसका व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक, जिसे फ्लोरेसेंस एंटीबॉडी तकनीक के रूप में भी जाना जाता है, विकसित शुरुआती इम्यूनोलॉजिकल लेबलिंग तकनीकों में से एक है और एंटीजन और एंटीबॉडी11,12 के बीच विशिष्ट बाध्यकारी प्रतिक्रिया पर आधारित है। ज्ञात एंटीबॉडी को पहले फ्लोरेसिन के साथ लेबल किया जाता है, जिसका उपयोग कोशिकाओं या ऊतकों13,14 में संबंधित एंटीजन का पता लगाने के लिए एक जांच के रूप में किया जाता है। फ्लोरेसिन-लेबल एंटीबॉडी कोशिकाओं या ऊतकों में संबंधित एंटीजन को बांधने के बाद, जांच उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ विकिरणित होने पर उज्ज्वल प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करेगी और एंटीजन15 को स्थानीयकृत करने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ देखी जाएगी।
पौधों के वायरस के अधिकांश वेक्टर कीड़े हेमिप्टेरान्स हैं। वेक्टर कीटों का एक उच्च जनसंख्या घनत्व जिसमें पौधे के वायरस के लिए उच्च संचरणदक्षता है, वायरस महामारी का कारण बन सकता है। दक्षिणी चावल की काली लकीर वाले बौने वायरस (एसआरबीएसडीवी, जीनस फिजीवायरस, परिवार रिओविरिडे), चावल के सबसे गंभीर रोगजनकों में से एक, तेजी से पूर्व और दक्षिण पूर्व एशिया में चावल उगाने वाले क्षेत्रों में फैल गया है, और 201016,17 के बाद से गंभीर उपज नुकसान का कारण बना है। सफेद समर्थित प्लांटहॉपर (डब्ल्यूबीपीएच, सोगाटेला फरसिफेरा हॉर्वथ) के वयस्क और अप्सरा उच्च दक्षता के साथ लगातार-प्रचारित तरीके से एसआरबीएसडीवी को चावल में संचारित करते हैं। फील्ड अध्ययनों से पता चला है कि एसआरबीएसडीवी-प्रेरित चावल की काली लकीर वाली बौनी बीमारी का प्रकोप आमतौर पर डब्ल्यूबीपीएच के बड़े पैमाने पर लंबी दूरी के प्रवास के साथ मेल खाता है, जो एसआरबीएसडीवी महामारी 7,8,18 में एक महत्वपूर्ण कारक है। पुटिका से जुड़े झिल्ली प्रोटीन 7 (वीएएमपी 7) एक घुलनशील एन-एथिलमलीमाइड-संवेदनशील कारक अनुलग्नक प्रोटीन रिसेप्टर (एसएनएआरई) है, जो पुटिका संलयन के माध्यम से पदार्थों के परिवहन को मध्यस्थ कर सकता है। वीएएमपी 7 विट्रो में एसआरबीएसडीवी के बाहरी प्रमुख कैप्सिड प्रोटीन के साथ बातचीत करता है, जो इंगित करता है कि वीएएमपी 7 वायरस ट्रांसमिशन16 के साथ निकटता से जुड़ा हो सकता है।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, हमने मिडगट एपिथेलियल कोशिकाओं16 में एसआरबीएसडीवी वायरियन और वीएएमपी 7 को लेबल करने के लिए एक उदाहरण के रूप में वायरल डब्ल्यूबीपीएच से आंत का उत्पादन किया। वायरस के प्रारंभिक आक्रमण स्थल के रूप में, मिडगट एपिथेलियम वायरस संक्रमण, प्रतिकृति और संचरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। सबसे पहले, हमने डब्ल्यूबीपीएच के अप्सराओं और वयस्कों से आंत को आबकारी करने के चरणों का विवरण दिया। दूसरा, हमने आंत उपकला कोशिकाओं में एसआरबीएसडीवी वायरियन और वीएएमपी 7 को लेबल करने के लिए विशिष्ट फ्लोरेसिन-लेबल एंटीबॉडी का उपयोग किया। फिर हमने एक लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के माध्यम से उपकला कोशिकाओं और वायरियन और वीएएमपी 7 के सेलुलर स्थान को देखा। परिणामों से पता चला है कि एसआरबीएसडीवी वायरियन और वीएएमपी 7 मिडगट एपिथेलियल कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में सह-स्थानीयकरण कर सकते हैं, यह सुझाव देते हुए कि वीएएमपी 7 का विशिष्ट कार्य मिडगट एपिथेलियल कोशिकाओं से विषाणुओं के प्रसार से संबंधित हो सकता है।
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Protocol
1. गैर विषैले कीट पालन
- चावल के खेतों से डब्ल्यूबीपीएच एकत्र करें और 16 घंटे प्रकाश और 8 घंटे अंधेरे के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में कीट-प्रूफ नेट से ढके 1 एल ग्लास बीकर में चावल के पौधों के साथ पीछे करें। क्योंकि एसआरबीएसडीवी अंडे के माध्यम से प्रेषित नहीं होता है, इसलिए नई हैच की गई अप्सराएं वायरल नहीं होती हैं।
- ब्रश पेन के साथ, धीरे-धीरे बीकर पालन करने वाले कीड़ों से कीड़ों को हर हफ्ते ताजा चावल के अंकुरों के एक नए बीकर में ब्रश करें जब तक कि डब्ल्यूबीपीएच अप्सराएं बाहर न निकल जाएं। इन हैच किए गए नॉनवायरुलिफेरस अप्सराओं को 2- या 3-इनस्टार तक पालना जारी रखें।
नोट: बीकर से उड़ने वाले या उन्हें नुकसान पहुंचाने वाले डब्ल्यूबीपीएच से बचने के लिए सावधानी से ब्रश करें।
2. वायरस अधिग्रहण और विषाणुभक्षी कीटों का संग्रह
- कांच के बीकर से नॉनवायरुलिफेरस कीड़ों को ताजा एसआरबीएसडीवी-संक्रमित चावल के पौधों पर स्थानांतरित करें, जो पौधों पर भोजन करके 2 डी वायरस-अधिग्रहण पहुंच अवधि (एएपी) के लिए कीट-प्रूफ नेट से ढके हुए हैं। फिर, कीड़ों को कांच के बीकर में इकट्ठा करें जिसमें ताजा चावल के अंकुर होते हैं।
- 2 डी के बाद, आंत के विच्छेदन और छांटने के लिए एक मैनुअल एस्पिरेटर के साथ ग्लास बीकर से कीड़े इकट्ठा करें।
नोट: एसआरबीएसडीवी का न्यूनतम एएपी डब्ल्यूबीपीएच अप्सराओं और वयस्कों दोनों के लिए 5 मिनट है, लेकिन कीड़ों को 80% तक की अधिग्रहण दक्षता प्राप्त करने के लिए 2 डी के लिए ताजा एसआरबीएसडीवी-संक्रमित चावल के पौधों पर खिलाने की अनुमति दी जानी चाहिए।
3. अभिकर्मक तैयारी
- फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 0.01 एम घोल को तैयार करने के लिए डीडीएच 2ओ के 1 एमएल मेंएनएसीएल के 8.5 ग्राम, एनए 2 एचपीओ4.12 एच 2 ओ के 3.5 ग्राम और एनएएच 2 पीओ 4 के0.25ग्राम को भंग करें।
- पीबीएस में 4% (एम / वी) पैराफॉर्मलडिहाइड तैयार करने के लिए पीबीएस के 100 एमएल में 4 ग्राम पैराफॉर्मलडिहाइड जोड़ें।
- 2% (v/v) ट्राइटन X-100 तैयार करने के लिए 98 mL PBS में Triton X-100 के 2 mL जोड़ें।
4. वयस्कों का विच्छेदन और हिम्मत का छांटना
- ग्लास स्लाइड पर पीबीएस के 100 μL रखने के लिए एक पिपेटर का उपयोग करें। स्लाइड को ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के मंच पर रखें।
- एसआरबीएसडीवी संक्रमित वयस्कों को एक मैनुअल एस्पिरेटर के साथ ग्लास बीकर से इकट्ठा करें और उन्हें 1.5 एमएल ट्यूबों में रखें। कीड़ों को लकवाग्रस्त करने के लिए ट्यूबों को बर्फ पर रखें, और फिर एक लकवाग्रस्त वयस्क को पेट के साथ स्लाइड पर पीबीएस के 100 μL में स्थानांतरित करें।
नोट: बर्फ पर 5 मिनट के बाद कीड़े पूरी तरह से लकवाग्रस्त हो जाएंगे। - शरीर को दबाने के लिए एक हाथ में चिमटी का उपयोग करें, और फिर दूसरे हाथ में चिमटी के दूसरे सेट के साथ सिर को हटा दें।
- चिमटी के एक सेट के साथ पेट के किनारों को दबाएं और दूसरे सेट के साथ ओविपोजिटर या पूंछ के संभोग अंग को दबाएं। फिर एक पेट खंड के अंतर-खंड झिल्ली को सावधानी से खींचें और धीरे-धीरे पेट में आंत को उजागर करें।
- झिल्ली को फाड़ना जारी रखें और धीरे-धीरे पेट से पूरी आंत को बाहर निकालें। धीरे से पूंछ को खींचें, जो आंत के अंत से जुड़ा हुआ है, ताकि पूरी आंत को हटाया जा सके।
नोट: बहुत सावधानी से खींचें या आंत क्षतिग्रस्त हो जाएगी। - एक्साइज्ड पेट को 200 μL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें, ट्यूब में 200 μL पीबीएस जोड़ें, और धीरे से पेट को अच्छी तरह से धोने के लिए पिपेट के साथ घोल को चूसें-छोड़ दें।
5. अप्सराओं का विच्छेदन और हिम्मत का छांटना
नोट: अप्सरा शरीर वयस्क शरीर की तुलना में अधिक नाजुक होते हैं, और पूंछ से खींचने पर आंत आसानी से क्षतिग्रस्त हो जाती है। इसलिए, अप्सरा आंत को उत्पादित करने का सबसे विश्वसनीय तरीका सिर से खींचना है।
- ग्लास स्लाइड पर पीबीएस के 100 μL रखने के लिए एक पिपेटर का उपयोग करें। स्लाइड को ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के मंच पर रखें।
- एक मैनुअल एस्पिरेटर के साथ ग्लास बीकर से एसआरबीएसडीवी-संक्रमित अप्सराओं को इकट्ठा करें और उन्हें 1.5 एमएल ट्यूबों में रखें। कीड़ों को लकवाग्रस्त करने के लिए ट्यूबों को बर्फ पर रखें। फिर, एक लकवाग्रस्त अप्सरा को पेट के सामने स्लाइड पर बफर के 100 μL में स्थानांतरित करें।
- अप्सरा की पूंछ को अलग करने के लिए चिमटी का उपयोग करें। फिर कीट शरीर को धीरे से ठीक करने के लिए दबाएं और सिर को दबाने के लिए दूसरे सेट का उपयोग करें। धीरे से सिर को शरीर से दूर खींचें, जबकि अभी भी आंत से इसके लगाव को बनाए रखें ताकि सिर शरीर से अलग हो जाए, लेकिन आंत अभी भी वक्ष और पेट से जुड़ी हुई है।
नोट: सिर अलग होने के बाद, अप्सरा का कॉर्पस एडिपोसम बाहर बह जाएगा, जिससे पीबीएस टर्बिड हो जाएगा। टर्बिड पीबीएस समाधान को हटा दें और ताजा पीबीएस के 100 μL के साथ बदलें। - चिमटी अभी भी शरीर को दबा रहे हैं, सिर को सावधानी से स्थानांतरित करने के लिए दूसरे सेट का उपयोग करें, और धीरे-धीरे आंत को बाहर निकालें।
- धीरे से चिमटी के साथ सिर से आंत को अलग करें, और अंततः प्लांटहॉपर के शरीर को नुकसान पहुंचाए बिना एक बरकरार आंत प्राप्त करें।
- एक्साइज्ड पेट को 200 μL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें, ट्यूब में 200 μL पीबीएस जोड़ें, और धीरे से पेट को अच्छी तरह से धोने के लिए पिपेट के साथ घोल को चूसें-छोड़ दें।
नोट: पेट की गुहा से किसी भी दूषित वसा शरीर को हटाने के लिए एक्साइज्ड पेट को पीबीएस के साथ अच्छी तरह से साफ किया जाना चाहिए; वे धुंधला प्रोटोकॉल में हस्तक्षेप कर सकते हैं।
6. एसआरबीएसडीवी वायरियन और एक कीट प्रोटीन के लिए लेबलिंग प्रोटोकॉल
- इस परख में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी और माउंटिंग माध्यम तैयार करें। एंटीबॉडी एंटी-एसआरबीएसडीवी एंटीबॉडी हैं जिन्हें एसआरबीएसडीवी वायरियन18 के खिलाफ डायलाइट 549 (लाल) के साथ लेबल किया गया है, कीट प्रोटीन वीएएमपी 716,19 के खिलाफ डायलाइट 488 (हरे) के साथ लेबल किए गए एंटी-वीएएमपी 7 एंटीबॉडी, डायलाइट 633 फेलोइडिन (नीला), और 4,6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई, ब्लू) युक्त माउंटिंग माध्यम हैं।
- ताजा उत्पादित और पीबीएस-धोए गए डब्ल्यूबीपीएच को तुरंत 200 μL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 4% (m / v) पैराफॉर्मलडिहाइड के 100 μL में रखें और कमरे के तापमान पर 2 घंटे तक रखें।
नोट: ताजा उत्पादित डब्ल्यूबीपीएच आंत को लंबी अवधि के लिए पीबीएस में भिगोया नहीं जाना चाहिए, या उपकला कोशिकाओं को क्षतिग्रस्त कर दिया जाएगा। - एक पिपेटर के साथ 4% (एम / वी) पैराफॉर्मलडिहाइड निकालें, और फिर 200 μL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 200 μL PBS जोड़ें। 10 मिनट के बाद, किसी भी पैराफॉर्मलडिहाइड को खत्म करने के लिए पिपेटर का उपयोग करके पीबीएस को हटा दें।
- इस पीबीएस वॉश स्टेप को दो बार दोहराएं।
- पीबीएस को हटा दें और 200 μL नॉनियोनिक डिटर्जेंट ट्राइटन एक्स -100 (2%, v / v) जोड़ें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए नॉनियोनिक डिटर्जेंट में नमूने को स्थिर करें।
- 2% (v/v) ट्राइटन X-100 को पिपेटर से निकालें, और फिर किसी भी शेष डिटर्जेंट को 200 μL PBS के साथ तीन 10 मिनट के धोने के साथ धो लें (चरण 6.3 और 6.4 देखें)।
- डाइलाइट 549 (लाल) द्वारा लेबल किए गए एंटी-एसआरबीएसडीवी एंटीबॉडी और डायलाइट 488 (हरे) 1:50 द्वारा लेबल किए गए एंटी-वीएएमपी 7 एंटीबॉडी को बुल सीरम एल्ब्यूमिन (3%, एम / वी) के 50 μL के साथ लेबल किया गया है।
- ट्यूब में पतला एंटीबॉडी जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नमूने इनक्यूबेट करें।
- एक पिपेटर के साथ एंटीबॉडी डिल्यूएंट को हटा दें, और फिर शेष एंटीबॉडी डिल्यूएंट को 200 μL PBS के साथ तीन 10 मिनट के धोने के साथ धो लें।
- 50 μL PBS के साथ Dylight 633 phalloidin के 1 μL को पतला करें।
- ट्यूब में पतला फेलोइडिन का 50 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए नमूने इनक्यूबेट करें।
- एक पिपेटर के साथ फेलोइडिन डिल्यूएंट को हटा दें, और फिर शेष फेलोइडिन को 200 μL PBS के साथ तीन 10 मिनट के धोने के साथ धो लें।
नोट: पृष्ठभूमि और निरर्थक बंधन को कम करने के लिए पूरी तरह से धोना महत्वपूर्ण है। - माइक्रोस्कोप स्लाइड पर DAPI युक्त माउंटिंग माध्यम की एक बूंद रखें और आंत को माध्यम में स्थानांतरित करें।
नोट: धीरे से प्रत्येक आंत को चिमटी के साथ फैलाएं और बुलबुले बनाने से बचें। प्रति स्लाइड लगभग 15 हिम्मत हैं। - बुलबुले बनाए बिना नमूनों पर धीरे से एक कवरग्लास रखें।
नोट: लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ अवलोकन से पहले प्रतिदीप्ति शमन को रोकने के लिए स्लाइड को अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए। - एक लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ सभी नमूने देखें। नीली रोशनी का उपयोग करके छवियों को कैप्चर करें और फ़ाइलों को कंप्यूटर पर सहेजें।
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Representative Results
चित्रा 1 इस प्रोटोकॉल में सभी चरणों को दर्शाता है: कीट पालन, वायरस अधिग्रहण, आंत का छांटना, इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग, और स्लाइड बनाना।
वयस्कों से उत्पादित डब्ल्यूबीपीएच को 4% (एम / वी) पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किया गया था, 2% (वी / वी) ट्राइटन एक्स -100 के साथ प्रतिरक्षित किया गया था, और फिर डायलाइट 633 फेलोइडिन10,18 के साथ इनक्यूबेट किया गया था। चित्रा 2 में लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोग्राफ फेलोइडिन के साथ लेबलिंग के बाद उत्पादित आंत के तीन हिस्सों को दर्शाता है, और वे क्रमशः फोरगट, मिडगट और हिंडगट हैं। इन तीन भागों में, मिडगट एसआरबीएसडीवी की प्रारंभिक संक्रमण साइट है। आंत की मोनोलेयर उपकला कोशिका संरचना कीट प्रोटीन के सेलुलर स्थानीयकरण और वायरस और कीट प्रोटीन के कोलोकलाइजेशन के अध्ययन की सुविधा प्रदान करती है।
हमने डब्ल्यूबीपीएच आंतों का भी उत्पादन किया और उन्हें डायलाइट 488 (हरे) लेबल वाले एंटी-वीएएमपी 7 एंटीबॉडी और एसआरबीएसडीवी वायरियन के साथ क्रमशः17,18,19 एंटी-एसआरबीएसडीवी एंटीबॉडी के साथ डायलाइट 549 (लाल) लेबल के साथ इनक्यूबेट किया। चित्रा 3 डब्ल्यूबीपीएच मिडगट एपिथेलियल कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में वीएएमपी 7 दिखाता है। वीएएमपी 7 और एसआरबीएसडीवी वायरियन को लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ साइटोप्लाज्म में कोलोकलाइज करने के लिए दिखाया गया है, यह सुझाव देते हुए कि वीएएमपी 7 विवो में वायरस संचरण में भूमिका निभा सकता है।
चित्र 1: कीड़ों को पालने, पेट को बाहर निकालने और प्रोटीन को लेबल करने के चरणों का अवलोकन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: डब्ल्यूबीपीएच आंत की आकृति विज्ञान। डायलाइट 633 फेलोइडिन (नीला, लेबलिंग एक्टिन) से प्रतिदीप्ति को लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ देखा गया था। स्केल बार, 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3: डब्ल्यूबीपीएच मिडगट एपिथेलियल कोशिकाओं में एसआरबीएसडीवी वायरियन और वीएएमपी 7 की फ्लोरेसेंस लेबलिंग को लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ देखा गया। आंतों को एंटी-एसआरबीएसडीवी एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया था, जिसे डायलाइट 549 (लाल) और एंटी-वीएएमपी 7 एंटीबॉडी के साथ डायलाइट 488 (हरे) के साथ लेबल किया गया था। स्केल बार, 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
सर्वोत्तम परिणामों के लिए, कुछ प्रमुख बिंदुओं पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, कुल आबादी के बीच विषाणुभक्षी कीड़ों का एक उच्च अनुपात आवश्यक है। यद्यपि डब्ल्यूबीपीएच अप्सराओं और वयस्कों द्वारा एसआरबीएसडीवी के लिए न्यूनतम एएपी 5 मिनट17 है, कीटों को 80% तक की अधिग्रहण दक्षता प्राप्त करने के लिए 2 डी के लिए ताजा एसआरबीएसडीवी-संक्रमित चावल के पौधों पर खिलाने की अनुमति दी जानी चाहिए। चूंकि एसआरबीएसडीवी विषाणुओं का पता18 के 80% में लगाया जा सकता है, इसलिए हमने इस प्रोटोकॉल में 2 डी एएपी के बाद 2 डी पर वायरलिफेरस कीड़ों को एक्साइज और लेबल किया। दूसरा, वयस्कों और अप्सराओं की हिम्मत सिर में लार ग्रंथियों और पूंछ में अंडाकार या संभोग अंग से जुड़ी होती है। इस प्रकार, सिर या पूंछ से खींचने के माध्यम से आंत को सावधानीपूर्वक उत्पादित किया जा सकता है। हालांकि, तकनीशियन को कीट के आकार के आधार पर खींचने के लिए एक उपयुक्त विधि चुनने की आवश्यकता है। वयस्क आंत को उसके सिर को हटाने के बाद पूंछ से एक बरकरार टुकड़े में खींचा जा सकता है, जबकि पूंछ20 से खींचने पर अधिक नाजुक अप्सरा की आंत आसानी से टूट जाती है। अधिक विश्वसनीय रूप से, अप्सरा आंत को उसकी पूंछ से अलग करने के बाद सिर को धीरे से खींचकर हटाया जा सकता है। इन विच्छेदन / छांटने के तरीकों का उपयोग करके, हम जल्दी से बरकरार आंत प्राप्त कर सकते हैं और आंत उपकला कोशिकाओं के मूल अल्ट्रास्ट्रक्चर को संरक्षित कर सकते हैं। इसके अलावा, अन्य अंग और पौधों के बाहरी शरीर के खोल नष्ट नहीं होते हैं, इस प्रकार वायरस गतिविधियों और इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए लार ग्रंथियों और हेमोलिम्फ जैसे अन्य ऊतकों और अंगों की अखंडता को बनाएरखते हैं।
भले ही इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, लेकिन उचित लेबलिंग प्रोटोकॉल के बिना मजबूत फ्लोरोसेंट सिग्नल प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रयोगात्मक सामग्री और समय22,23 की महंगी बर्बादी होती है। लेबलिंग से पहले, पेट की गुहा से दूषित वसा निकायों को बाहर करने के लिए पीबीएस के साथ एक्साइज्ड पेट को अच्छी तरह से साफ किया जाना चाहिए। दूषित वसा शरीर एंटीबॉडी को कोशिका में प्रवेश करने से रोक सकते हैं और लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ देखे जाने पर दृष्टि के क्षेत्र को अस्पष्ट बना सकते हैं। इस सफाई के बाद, कोशिका संरचना को संरक्षित करने के लिए हिम्मत को तुरंत ठीक किया जाना चाहिए। सुनिश्चित करें कि एंटीजन अतिप्रवाह को रोकने के लिए परमेबिलाइजेशन उपचार का समय बहुत लंबा नहीं है। इसके अलावा, पृष्ठभूमि और निरर्थक बंधन को कम करने के लिए ल्यूसिफेरिन-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन के बाद परमेबिलाइज्ड आंत को अच्छी तरह से साफ किया जाना चाहिए। कवरग्लास दबाने से पहले, धीरे से प्रत्येक आंत को चिमटी के साथ खोलें और बुलबुले से बचने की कोशिश करें। जब स्लाइड तैयार हो जाती है, तो इसे लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप24,25 के साथ अवलोकन से पहले प्रतिदीप्ति शमन को रोकने के लिए प्रकाश के बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।
कीट वेक्टर द्वारा वायरस संचरण कई पौधों के वायरस रोगों के महामारी विज्ञान में एक महत्वपूर्ण कदम है। इस संचरण को बाधित करना इस प्रकार वायरस रोगों 7,8 के खिलाफ एक प्रभावी रणनीति है, इसलिए इन वायरस के संचरण तंत्र को स्पष्ट करना बहुत सैद्धांतिक और व्यावहारिक महत्व का है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस इस प्रकार लगातार संचारित पौधों के वायरस को स्थानीयकृत करने और वायरस संचरण में विभिन्न चरणों को समझने की दिशा में विवो में उनके प्रोटीन के कार्य का अध्ययन करने के लिए बहुत उपयोगी है। हाल के वर्षों में, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी पौधों के वायरस के संचरण के दौरान वेक्टर कोशिकाओं और ऊतकों में वायरस इंटरैक्शन को समझने में सफलताओं के लिए जिम्मेदार महत्वपूर्ण उपकरण रहे हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम वयस्कों और अप्सराओं के मिडगट्स की उपकला कोशिकाओं में एसआरबीएसडीवी वायरियन और वीएएमपी 7 को स्थानीयकृत करने और किसी भी कोलोकलाइजेशन को निर्धारित करने में सक्षम थे। फेलोइडिन का उपयोग मिडगट उपकला कोशिका झिल्ली की रूपरेखा को देखने के लिए एक्टिन को लेबल करने के लिए किया गया था, और डीएपीआई का उपयोग नाभिक को लेबल करने के लिए किया गया था। डब्ल्यूबीपीएच आंत और मिडगट एपिथेलियल कोशिकाओं की संरचनाएं अलग-अलग होती हैं जब लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ देखा जाता है। यह प्रोटोकॉल कीड़ों के पाचन तंत्र शरीर रचना विज्ञान को देखने, विषाणुओं, अन्य रोगजनकों और कीट प्रोटीन को स्थानीयकृत करने और कीड़ों, कीट प्रोटीन कार्यों और रोगजनकों और कीट प्रोटीन के बीच बातचीत में रोगज़नक़ गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31630058 से X.W. और W.L. को 31772134) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Bull serum albumin (BSA) | Coolaber | SL1331 | Dilute antibodies |
| Cover glass | Solarbio | YA0771-18*18mm | For slide making |
| Dissecting microscope | Beitja | XTL-7045B1 | For insect dissection |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observe fluorescence signal |
| Microscope slides | Solarbio | ZBP-7105 | For slide making |
| Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Abcam | AB104139 | Label cell necleus |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For tissues fixation |
| Phalloidin | Invitrogen | A22284 | Label actin of midgut epithiels |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | For tissues permeation |
| Tweezers (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | For insect dissection |
References
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