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Biologia

Identifizierung von alternativem Spleißen und Polyadenylierung in RNA-seq-Daten

Published: June 24, 2021
doi:
10.3791/62636
, , ,
1Department of Genome Sciences, The John Curtin School of Medical Research,The Australian National University, 2Department of Biology,New York University

Summary

Alternative Spleißen (AS) und alternative Polyadenylierung (APA) erweitern die Vielfalt der Transkriptisoformen und ihrer Produkte. Hier beschreiben wir bioinformatische Protokolle zur Analyse von Bulk-RNA-seq und 3′-Endsequenzierungsassays, um AS und APA zu erkennen und zu visualisieren, die unter experimentellen Bedingungen variieren.

Abstract

Neben der typischen Analyse von RNA-Seq zur Messung der differentiellen Genexpression (DGE) unter experimentellen/biologischen Bedingungen können RNA-seq-Daten auch verwendet werden, um andere komplexe regulatorische Mechanismen auf Exon-Ebene zu erforschen. Alternative Spleißung und Polyadenylierung spielen eine entscheidende Rolle für die funktionelle Vielfalt eines Gens, indem sie verschiedene Isoformen erzeugen, um die Genexpression auf posttranskriptioneller Ebene zu regulieren, und die Beschränkung der Analysen auf die gesamte Genebene kann diese wichtige regulatorische Schicht übersehen. Hier demonstrieren wir detaillierte Schritt-für-Schritt-Analysen zur Identifizierung und Visualisierung der differentiellen Exon- und Polyadenylierungsstellennutzung über Bedingungen hinweg, wobei Bioconductor und andere Pakete und Funktionen wie DEXSeq, diffSplice aus dem Limma-Paket und rMATES verwendet werden.

Introduction

RNA-seq wurde im Laufe der Jahre häufig verwendet, typischerweise zur Schätzung der differentiellen Genexpression und Genentdeckung1. Darüber hinaus kann es auch verwendet werden, um die unterschiedliche Nutzung auf Exon-Ebene aufgrund der Genexprimierung verschiedener Isoformen abzuschätzen, was zu einem besseren Verständnis der Genregulation auf posttranskriptioneller Ebene beiträgt. Die Mehrheit der eukaryotischen Gene erzeugt verschiedene Isoformen durch alternatives Spleißen (AS), um die Vielfalt der mRNA-Expression zu erhöhen. AS-Ereignisse können in verschiedene Muster unterteilt werden: Überspringen vollständiger Exons (SE), bei denen ein (“Kassetten”) Exon zusammen mit seinen flankierenden Introns vollständig aus dem Transkript entfernt wird; alternative (Donor) 5′-Spleißstellenauswahl (A5SS) und alternative 3′ (Akzeptor) Spleißstellenauswahl (A3SS), wenn zwei oder mehr Spleißstellen an beiden Enden eines Exons vorhanden sind; Beibehaltung von Introns (RI), wenn ein Intron innerhalb des reifen mRNA-Transkripts beibehalten wird, und gegenseitiger Ausschluss der Exon-Nutzung (MXE), wobei nur eines der beiden verfügbaren Exons gleichzeitig beibehalten werden kann 2,3. Die alternative Polyadenylierung (APA) spielt auch eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Genexpression unter Verwendung alternativer Poly(A)-Stellen, um mehrere mRNA-Isoformen aus einem einzigen Transkriptzu erzeugen 4. Die meisten Polyadenylierungsstellen (pAs) befinden sich in der 3′ untranslatierten Region (3′ UTRs) und erzeugen mRNA-Isoformen mit unterschiedlichen 3′ UTR-Längen. Da die 3′ UTR die zentrale Drehscheibe für die Erkennung regulatorischer Elemente ist, können unterschiedliche 3′ UTR-Längen die mRNA-Lokalisierung, Stabilität und Translation beeinflussen5. Es gibt eine Klasse von 3′-Endsequenzierungsassays, die für den Nachweis von APA optimiert sind und sich in den Details des Protokolls6 unterscheiden. Die hier beschriebene Pipeline ist für PolyA-seq ausgelegt, kann aber wie beschrieben für andere Protokolle angepasst werden.

In dieser Studie stellen wir eine Pipeline von differentiellen Exon-Analysemethoden7,8 (Abbildung 1) vor, die in zwei große Kategorien unterteilt werden können: exon-basiert (DEXSeq9, diffSplice 10) und ereignisbasiert (replicate Multivariate Analysis of Transcript Splicing (rMATS)11). Die Exon-basierten Methoden vergleichen die Faltenänderung über die Bedingungen einzelner Exons hinweg mit einem Maß für die gesamte Genfaltenänderung, um differentiell exprimierte Exon-Nutzung zu nennen, und berechnen daraus ein Maß für die AS-Aktivität auf Genebene. Ereignisbasierte Methoden verwenden Exon-Intron-Spanning-Junction-Lesevorgänge, um bestimmte Spleißereignisse wie Exon-Skipping oder Beibehaltung von Introns zu erkennen und zu klassifizieren und diese AS-Typen in Ausgabe3 zu unterscheiden. Somit bieten diese Methoden komplementäre Sichtweisen für eine vollständige Analyse von AS12,13. Wir haben DEXSeq (basierend auf dem DESeq214 DGE-Paket) und diffSplice (basierend auf dem Limma10 DGE-Paket) für die Studie ausgewählt, da sie zu den am häufigsten verwendeten Paketen für die differentielle Spleißanalyse gehören. rMATS wurde als beliebte Methode für die ereignisbasierte Analyse ausgewählt. Eine weitere beliebte ereignisbasierte Methode ist MISO (Mixture of Isoforms)1. Für APA adaptieren wir den Exon-basierten Ansatz.

Figure 1
Abbildung 1. Analyse-Pipeline. Flussdiagramm der in der Analyse verwendeten Schritte. Zu den Schritten gehören: Abrufen der Daten, Durchführen von Qualitätsprüfungen und Leseausrichtung, gefolgt von Zählen von Lesevorgängen unter Verwendung von Anmerkungen für bekannte Exons, Introns und pA-Stellen, Filtern zur Entfernung niedriger Zählungen und Normalisierung. PolyA-seq-Daten wurden für alternative pA-Stellen mit diffSplice/DEXSeq-Methoden analysiert, Bulk-RNA-Seq wurde auf alternative Spleißung auf Exon-Ebene mit diffSplice/DEXseq-Methoden analysiert und AS-Ereignisse mit rMATS analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die in dieser Umfrage verwendeten RNA-seq-Daten stammen von Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE138691)15. Wir verwendeten Maus-RNA-seq-Daten aus dieser Studie mit zwei Bedingungsgruppen: Wildtyp (WT) und Muskelblind-ähnlicher Typ-1-Knockout (Mbnl1 KO) mit jeweils drei Replikaten. Um die Analyse der differentiellen Polyadenylierungsstandortnutzung zu demonstrieren, erhielten wir PolyA-seq-Daten von Mausembryo-Fibroblasten (MEFs) (GEO Accession GSE60487)16. Die Daten haben vier Bedingungsgruppen: Wild-Typ (WT), Muskelblind-Typ 1/Typ 2 Doppel-Knockout (Mbnl1/2 DKO), Mbnl 1/2 DKO mit Mbnl3-Knockdown (KD) und Mbnl1/2 DKO mit Mbnl3-Kontrolle (Strg). Jede Bedingungsgruppe besteht aus zwei Replikaten.

GEO-Beitritt SRA-Ausführungsnummer Name des Beispiels Zustand Replizieren Gewebe Sequenzierung Leselänge
RNA-Seq GSM4116218 SRR10261601 Mbnl1KO_Thymus_1 Mbnl1 Knockout Wiederholung 1 Thymus Gepaartes Ende 100 bp
GSM4116219 SRR10261602 Mbnl1KO_Thymus_2 Mbnl1 Knockout Wiederholung 2 Thymus Gepaartes Ende 100 bp
GSM4116220 SRR10261603 Mbnl1KO_Thymus_3 Mbnl1 Knockout Wiederholung 3 Thymus Gepaartes Ende 100 bp
GSM4116221 SRR10261604 WT_Thymus_1 Wildtyp Wiederholung 1 Thymus Gepaartes Ende 100 bp
GSM4116222 SRR10261605 WT_Thymus_2 Wildtyp Wiederholung 2 Thymus Gepaartes Ende 100 bp
GSM4116223 SRR10261606 WT_Thymus_3 Wildtyp Wiederholung 3 Thymus Gepaartes Ende 100 bp
3P-Seq GSM1480973 SRR1553129 WT_1 Wildtyp (WT) Wiederholung 1 Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus Single-End 40 bp
GSM1480974 SRR1553130 WT_2 Wildtyp (WT) Wiederholung 2 Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus Single-End 40 bp
GSM1480975 SRR1553131 DKO_1 Mbnl 1/2 Doppel-Knockout (DKO) Wiederholung 1 Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus Single-End 40 bp
GSM1480976 SRR1553132 DKO_2 Mbnl 1/2 Doppel-Knockout (DKO) Wiederholung 2 Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus Single-End 40 bp
GSM1480977 SRR1553133 DKOsiRNA_1 Mbnl 1/2 Doppel-Knockout mit Mbnl 3 siRNA (KD) Wiederholung 1 Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus Single-End 40 bp
GSM1480978 SRR1553134 DKOsiRNA_2 Mbnl 1/2 Doppel-Knockout mit Mbnl 3 siRNA (KD) Wiederholung 2 Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus Single-End 36 bp
GSM1480979 SRR1553135 DKONTsiRNA_1 Mbnl 1/2 Doppel-Knockout mit nicht-targetender siRNA (Ctrl) Wiederholung 1 Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus Single-End 40 bp
GSM1480980 SRR1553136 DKONTsiRNA_2 Mbnl 1/2 Doppel-Knockout mit nicht-targetender siRNA (Ctrl) Wiederholung 2 Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus Single-End 40 bp

Tabelle 1. Zusammenfassung der RNA-Seq- und PolyA-seq-Datensätze, die für die Analyse verwendet wurden.

Protocol

1. Installation von Tools und R-Paketen, die in der Analyse verwendet werden Conda ist ein beliebter und flexibler Paketmanager, der eine komfortable Installation von Paketen mit ihren Abhängigkeiten über alle Plattformen hinweg ermöglicht. Verwenden Sie ‘Anaconda’ (conda-Paketmanager), um ‘conda’ zu installieren, mit dem die für die Analyse erforderlichen Tools/Pakete installiert werden können. Laden Sie ‘Anaconda’ gemäß den Systemanforderungen von https://www.anaconda.com/produ…

Representative Results

Nach dem Ausführen des obigen Schritt-für-Schritt-Workflows werden die AS- und APA-Analyseausgaben und repräsentativen Ergebnisse in Form von Tabellen und Datendiagrammen erstellt, die wie folgt generiert werden. WIE:Die Hauptergebnisse der AS-Analyse (Zusatztabelle 1 für diffSplice; Tabelle 2 für DEXSeq) ist eine Liste von Exons, die eine unterschiedliche Nutzung über Bedingungen hinweg zeigen, und eine Liste von Genen, die eine sig…

Discussion

In dieser Studie evaluierten wir Exon-basierte und ereignisbasierte Ansätze zum Nachweis von AS und APA in Bulk-RNA-Seq- und 3′-Endsequenzierungsdaten. Die Exon-basierten AS-Ansätze erzeugen sowohl eine Liste differentiell exprimierter Exons als auch ein Ranking auf Genebene, geordnet nach der statistischen Signifikanz der gesamten differentiellen Spleißaktivität auf Genebene (Tabellen 1-2, 4-5). Für das diffSplice-Paket wird die differentielle Nutzung bestimmt, indem gewichtete lineare Modelle auf …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde von einem Australian Research Council (ARC) Future Fellowship (FT16010043) und ANU Futures Scheme unterstützt.

Materials

Not relevent for computational study
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Riferimenti

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Keywords: Alternative SplicingPolyadenylationRNA-seqDifferential SplicingDifferential Exon ExpressionLimmaEdgeRVoomDiffSplice
check_url/it/62636?article_type=t

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Citazione di questo articolo
Dixit, G., Zheng, Y., Parker, B., Wen, J. Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data. J. Vis. Exp. (172), e62636, doi:10.3791/62636 (2021).
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