ऊतक में प्रोटीन और आरएनए अभिव्यक्ति की स्थानिक प्रोफाइलिंग: वर्चुअल माइक्रोडिसेक्शन को ठीक करने के लिए एक दृष्टिकोण
Summary
यहां, हम ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को बेहतर ढंग से चिह्नित करने और विशिष्ट सेल आबादी की पहचान करने के लिए स्थानिक ओमिक्स प्रौद्योगिकियों के लिए रुचि के क्षेत्रों (आरओआई) को ठीक करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। प्रोटिओमिक्स परख के लिए, स्वचालित अनुकूलित प्रोटोकॉल आरओआई चयन का मार्गदर्शन कर सकते हैं, जबकि ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख को 50 μm जितना छोटा ROIs का उपयोग करके ठीक किया जा सकता है।
Abstract
मल्टीप्लेक्सिंग स्थानिक संदर्भ प्रदान करते हुए एक ही ऊतक पर कई मार्करों के मूल्यांकन को सक्षम बनाता है। स्थानिक ओमिक्स प्रौद्योगिकियां क्रमशः फोटो-क्लीवर ओलिगो-टैग एंटीबॉडी और जांच का लाभ उठाकर प्रोटीन और आरएनए मल्टीप्लेक्सिंग दोनों की अनुमति देती हैं। अंतर्निहित जीव विज्ञान को स्पष्ट करने के लिए ऊतक भर में विशिष्ट क्षेत्रों से ओलिगोस को अलग और परिमाणित किया जाता है। यहां, अध्ययन दर्शाता है कि स्थानिक प्रोटिओमिक्स परख के साथ संयोजन में आरओआई चयन का मार्गदर्शन करने के लिए स्वचालित कस्टम एंटीबॉडी विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है। इस विशिष्ट विधि ने स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख के साथ स्वीकार्य प्रदर्शन नहीं दिखाया। प्रोटोकॉल एक स्वचालित मंच पर मार्कर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए 3-प्लेक्स इम्यूनोफ्लोरोसेंट (आईएफ) परख के विकास का वर्णन करता है, जो किसी दिए गए प्रोटीन लक्ष्य से फ्लोरोसेंट सिग्नल को बढ़ाने और एंटीबॉडी पूल को चुनने के लिए एंटीबॉडी पूल को बढ़ाने के लिए टायरामाइड सिग्नल प्रवर्धन (टीएसए) का उपयोग करता है। विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल को गुणवत्ता और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए पूरी तरह से मान्य 3-प्लेक्स परख का उपयोग करके स्वचालित किया गया था। इसके अलावा, स्थानिक प्रोफाइलिंग प्लेटफॉर्म पर टीएसए-आधारित आईएफ परख की इमेजिंग की अनुमति देने के लिए एसवाईटीओ रंगों के लिए डीएपीआई के आदान-प्रदान का मूल्यांकन किया गया था। इसके अतिरिक्त, हमने स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख का उपयोग करके छोटे आरओआई का चयन करने की क्षमता का परीक्षण किया ताकि रुचि के अत्यधिक विशिष्ट क्षेत्रों (जैसे, किसी दिए गए सेल प्रकार के लिए समृद्ध क्षेत्र) की जांच की जा सके। 50 μm और 300 μm व्यास के ROIs एकत्र किए गए थे, जो क्रमशः लगभग 15 कोशिकाओं और 100 कोशिकाओं से मेल खाती हैं। नमूने पुस्तकालयों में बनाए गए थे और ऊतक के छोटे आरओआई और प्रोफ़ाइल-विशिष्ट क्षेत्रों से संकेतों का पता लगाने की क्षमता की जांच करने के लिए अनुक्रमित किए गए थे। हमने निर्धारित किया कि स्थानिक प्रोटिओमिक्स प्रौद्योगिकियां आरओआई चयन का मार्गदर्शन करने के लिए स्वचालित, मानकीकृत प्रोटोकॉल से अत्यधिक लाभान्वित होती हैं। जबकि यह स्वचालित विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख के साथ संगत नहीं था, हम परीक्षण और पुष्टि करने में सक्षम थे कि मानक मैनुअल विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल के साथ छोटे आरओआई में भी विशिष्ट सेल आबादी का सफलतापूर्वक पता लगाया जा सकता है।
Introduction
मल्टीप्लेक्सिंग तकनीकों में प्रगति ट्यूमर में मौजूद लक्ष्यों के लिए बेहतर लक्षण वर्णन उपकरण प्रदान करना जारी रखती है। ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) ट्यूमर कोशिकाओं की एक जटिल प्रणाली है, जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं और स्ट्रोमा में घुसपैठ करती है, जहां स्थानिकजानकारी रुचि के बायोमाकर्स के बीच बातचीत के तंत्र को बेहतर ढंग से समझने और व्याख्या करने के लिए महत्वपूर्ण है। जियोएमएक्स डिजिटल स्पैटियल प्रोफाइलर (डीएसपी) और 10एक्स विज़ियम जैसी उभरती तकनीकों के साथ, कई लक्ष्यों का पता लगाया जा सकता है और उनके स्थानिक संदर्भ में एक साथ मात्रा निर्धारित की जा सकती है। ऊतक विज़ुअलाइज़ेशन की सुविधा प्रदान करने वाले इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल का उपयोग इन प्रौद्योगिकियों की स्थानिक प्रोफाइलिंग क्षमताओं में और सुधार कर सकता है।
इस विधि के विकास के लिए हमने जिस स्थानिक ओमिक्स तकनीक पर ध्यान केंद्रित किया है, उसमें स्थानिक प्रोटिओमिक्स और ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख शामिल हैं जहां ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स यूवी-संवेदनशील फोटोक्लिवेबल लिंकर के माध्यम से एंटीबॉडी या आरएनए जांच से जुड़े होते हैं। हिस्टोलॉजिकल स्लाइड्स को इन ऑलिगो-संयुग्मित एंटीबॉडी या जांच के साथ लेबल किया जाता है और फिर स्थानिक प्रोफाइलिंग प्लेटफॉर्म पर चित्रित किया जाता है। इसके बाद, रोशनी के लिए विभिन्न आकारों और आकृतियों के आरओआई का चयन किया जाता है, और फोटोक्लीवर ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को एस्पिरेटेड किया जाता है और 96-वेल प्लेट में एकत्र किया जाता है। फोटोक्लीवर ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को या तो नैनोस्ट्रिंग एनकाउंटर सिस्टम या नेक्स्ट जनरेशन सीक्वेंसिंग (एनजीएस) 2,3 (चित्रा 1)4,5) के साथ परिमाणित करने के लिए तैयार किया जाता है।
कोशिका वितरण ऊतकों के भीतर भिन्न होता है, और चयनित मार्करों और विभिन्न आरओआई आकारों का उपयोग करके कोशिकाओं के विशिष्ट स्थानों को चिह्नित करने की क्षमता ऊतक वातावरण को पूरी तरह से समझने और विशिष्ट विशेषताओं की पहचान करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। यहां उल्लिखित स्थानिक ओमिक्स तकनीक में, मानक विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल सीधे संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करता है और एक मैनुअल प्रोटोकॉल है। ट्यूमर और स्ट्रोमा के बीच अंतर करने के लिए मानक मार्कर पैनसाइटोकेराटिन (पैनसीके) और सीडी 45 6,7 हैं, लेकिन रुचि की विशिष्ट सेल आबादी को लक्षित करने के लिए अतिरिक्त मार्कर आवश्यक हैं। इसके अलावा, सीधे संयुग्मित फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के उपयोग में प्रवर्धन की कमी होती है, जो एंटीबॉडी चयन को प्रचुर मात्रा में मार्करों तक सीमित करती है। इसके अतिरिक्त, मैन्युअल परख स्वचालित वर्कफ़्लो8 की तुलना में अधिक परिवर्तनशीलता के अधीन हैं। इसलिए, आरओआई चयन के लिए एक अनुकूलन योग्य, स्वचालित और प्रवर्धित विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल होना वांछनीय है।
यहां, अध्ययन दर्शाता है कि, स्थानिक प्रोटिओमिक्स परख के लिए, टीएसए तकनीक का उपयोग स्वचालित मंच पर विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल के लिए किया जा सकता है जिसके परिणामस्वरूप अधिक लक्षित और मानकीकृत परख होती है। इसके अलावा, टीएसए आधारित परख कम-व्यक्त मार्करों के उपयोग को सक्षम करते हैं, जिससे विज़ुअलाइज़ेशन के लिए चुने जा सकने वाले लक्ष्यों की सीमा बढ़ जाती है। पैनसीके, एफएपी और एंटीबॉडी एक्स के लिए एक 3-प्लेक्स परख एक स्वचालित मंच का उपयोग करके विकसित की गई थी जहां क्रमशः ट्यूमर और स्ट्रोमा के बीच अंतर करने के लिए पैनसीके और एफएपी का उपयोग किया गया था। एंटीबॉडी एक्स एक स्ट्रोमल प्रोटीन है जो अक्सर ट्यूमर में सामने आता है, लेकिन इसकी जीव विज्ञान और एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा पर प्रभाव पूरी तरह से समझा नहीं गया है। एंटीबॉडी एक्स में समृद्ध क्षेत्रों में प्रतिरक्षा संदर्भ को चिह्नित करने से एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा और चिकित्सीय प्रतिक्रिया में इसकी भूमिका को स्पष्ट किया जा सकता है, साथ ही साथ दवा लक्ष्य के रूप में इसकी क्षमता भी स्पष्ट हो सकती है।
जबकि अनुकूलित स्वचालित टीएसए विज़ुअलाइज़ेशन पैनल स्थानिक प्रोटिओमिक्स परख के लिए सफल साबित हुए, स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख के लिए इन परखों के आवेदन की पुष्टि नहीं की जा सकी। यह अभिकर्मकों और स्वचालित विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल के कारण सबसे अधिक संभावना है, जो आरएनए अखंडता से समझौता करते हैं। यह स्वीकार करते हुए कि विज़ुअलाइज़ेशन मार्करों के लिए एक स्वचालित लेबलिंग प्रोटोकॉल का उपयोग स्थानिक प्रोटिओमिक्स परख के लिए किया जा सकता है, लेकिन स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख के लिए नहीं, स्थानिक ओमिक्स प्रौद्योगिकी परख डिजाइनों पर महत्वपूर्ण मार्गदर्शन प्रदान करता है।
इसके अतिरिक्त, अध्ययन दर्शाता है कि स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख का उपयोग 50 μm व्यास या लगभग 15 कोशिकाओं जैसे छोटे क्षेत्रों में लक्ष्यों को प्रोफाइल करने के लिए किया जा सकता है। छोटे आरओआई में प्रतिलेख का पता लगाने के लिए परख की क्षमता का परीक्षण करने के लिए दो अलग-अलग आकार के आरओआई का चयन किया गया था। रुचि के प्रत्येक क्षेत्र के लिए, 1,800 एमआरएनए लक्ष्यों के अनुरूप ऑलिगोस एकत्र किए गए थे और स्थानिक प्रोफाइलिंग प्लेटफॉर्म प्रोटोकॉल के अनुसार पुस्तकालयों में बनाए गए थे। पुस्तकालयों को व्यक्तिगत रूप से अनुक्रमित किया गया, बाद में पूल किया गया, और अनुक्रमित किया गया। इसने पूलिंग दक्षता और छोटे आरओआई में विशिष्ट सेल आबादी की पहचान करने की क्षमता दोनों के मूल्यांकन की अनुमति दी।
इस पेपर से पता चलता है कि स्थानिक प्रोटिओमिक्स परख के लिए, रुचि के विशिष्ट मार्करों पर आरओआई चयन का मार्गदर्शन करने के लिए एक स्वचालित प्रोटोकॉल का उपयोग प्रासंगिक ऊतक क्षेत्रों की पूछताछ को चुनिंदा रूप से लक्षित करने और ऊतक के स्थानिक वातावरण को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, हम प्रदर्शित करते हैं कि विशिष्ट सेल आबादी का पता लगाने और चिह्नित करने के लिए स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक परख के लिए छोटे आरओआई का उपयोग किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
आज तक, एक मैनुअल प्रोटोकॉल में सीधे संयुग्मित फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उपयोग आमतौर पर स्थानिक प्रोटिओमिक्स या स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्सपरख 9,10 के लिए विज़ुअलाइज़ेशन पैनलों …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक एनजीएस फाइलों को संसाधित करने के लिए थॉमस वू को स्वीकार करते हैं। हम परिणाम चर्चाओं और पांडुलिपि समीक्षा के लिए जेम्स ज़ियाई और आंतरिक पांडुलिपि संशोधन के लिए मेरेडिथ ट्रिपल और राहेल टेलर को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
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