Perfil espacial da expressão de proteínas e RNA em tecidos: uma abordagem para ajustar a microdissecção virtual
Summary
Aqui, descrevemos um protocolo para ajuste fino de regiões de interesse (ROIs) para tecnologias de Ômica Espacial para melhor caracterizar o microambiente tumoral e identificar populações celulares específicas. Para ensaios proteômicos, protocolos personalizados automatizados podem orientar a seleção de ROI, enquanto os ensaios transcriptômicos podem ser ajustados utilizando ROIs tão pequenos quanto 50 μm.
Abstract
A multiplexação permite a avaliação de vários marcadores no mesmo tecido, proporcionando contexto espacial. As tecnologias Spatial Omics permitem a multiplexação de proteínas e RNA, alavancando anticorpos e sondas oligo-marcados foto-cliváveis, respectivamente. Os oligos são clivados e quantificados a partir de regiões específicas em todo o tecido para elucidar a biologia subjacente. Aqui, o estudo demonstra que protocolos automatizados de visualização de anticorpos personalizados podem ser utilizados para orientar a seleção de ROI em conjunto com ensaios de proteômica espacial. Este método específico não mostrou desempenho aceitável com ensaios de transcriptômica espacial. O protocolo descreve o desenvolvimento de um ensaio de imunofluorescência (FI) de 3 plexos para visualização de marcadores em uma plataforma automatizada, usando amplificação de sinal de tiramida (TSA) para amplificar o sinal fluorescente de um determinado alvo de proteína e aumentar o pool de anticorpos para escolher. O protocolo de visualização foi automatizado usando um ensaio de 3 plexos completamente validado para garantir a qualidade e a reprodutibilidade. Além disso, a troca de DAPI por corantes SYTO foi avaliada para permitir a obtenção de imagens de ensaios de FI baseados em TSA na plataforma de perfil espacial. Além disso, testamos a capacidade de selecionar pequenas ROIs usando o ensaio de transcriptômica espacial para permitir a investigação de áreas de interesse altamente específicas (por exemplo, áreas enriquecidas para um determinado tipo de célula). Foram coletadas ROIs de 50 μm e 300 μm de diâmetro, o que corresponde a aproximadamente 15 células e 100 células, respectivamente. As amostras foram transformadas em bibliotecas e sequenciadas para investigar a capacidade de detectar sinais de pequenas ROIs e regiões específicas do perfil do tecido. Determinamos que as tecnologias de proteômica espacial se beneficiam altamente de protocolos automatizados e padronizados para orientar a seleção de ROI. Embora esse protocolo de visualização automatizada não fosse compatível com ensaios de transcriptômica espacial, pudemos testar e confirmar que populações celulares específicas podem ser detectadas com sucesso mesmo em pequenas ROIs com o protocolo de visualização manual padrão.
Introduction
Os avanços nas técnicas de multiplexação continuam a fornecer melhores ferramentas de caracterização para alvos presentes em tumores. O microambiente tumoral (EMT) é um sistema complexo de células tumorais, infiltrando células imunes e estroma, onde a informação espacial é fundamental para melhor compreender e interpretar os mecanismos de interação entre biomarcadores de interesse1. Com técnicas emergentes, como o GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) e o 10x Visium, vários alvos podem ser detectados e quantificados simultaneamente dentro de seu contexto espacial. O uso de protocolos de imunofluorescência que facilitam a visualização tecidual pode melhorar ainda mais as capacidades de perfil espacial dessas tecnologias.
A tecnologia Spatial Omics em que nos concentramos para o desenvolvimento deste método consiste em ensaios espaciais de proteômica e transcriptômica onde oligonucleotídeos são ligados a anticorpos ou sondas de RNA através de um ligador fotoclivista sensível a UV. As lâminas histológicas são marcadas com esses anticorpos ou sondas oligoconjugados e, em seguida, fotografadas na plataforma de perfil espacial. Em seguida, ROIs de diferentes tamanhos e formas são selecionados para iluminação, e os oligonucleotídeos fotoclivados são aspirados e coletados em uma placa de 96 poços. Os oligonucleotídeos fotoclivados são preparados para serem quantificados com o sistema Nanostring nCounter ou o Next Generation Sequencing (NGS)2,3 (Figura 1)4,5.
As distribuições celulares variam dentro dos tecidos, e a capacidade de caracterizar locais específicos das células usando marcadores selecionados e diferentes tamanhos de ROI é de grande importância para entender completamente o ambiente tecidual e identificar características específicas. Na tecnologia Spatial Omics mencionada aqui, o protocolo de visualização padrão usa anticorpos diretamente conjugados e é um protocolo manual. Os marcadores padrão para distinguir entre tumor e estroma são pancitoqueratina (panCK) e CD456,7, mas marcadores adicionais são necessários para atingir populações celulares específicas de interesse. Além disso, o uso de anticorpos fluorescentes diretamente conjugados carece de amplificação, o que limita a seleção de anticorpos a marcadores abundantes. Além disso, os ensaios manuais estão sujeitos a mais variabilidade do que os fluxos de trabalho automatizados8. Portanto, é desejável ter um protocolo de visualização personalizável, automatizado e amplificado para a seleção de ROI.
Aqui, o estudo demonstra que, para ensaios de proteômica espacial, a tecnologia TSA pode ser usada para protocolos de visualização em uma plataforma automatizada, resultando em um ensaio mais direcionado e padronizado. Além disso, os ensaios baseados em TSA permitem o uso de marcadores de baixa expressão, aumentando a gama de alvos que podem ser selecionados para visualização. Um ensaio de 3 plexos para panCK, PAF e Anticorpo X foi desenvolvido usando uma plataforma automatizada onde panCK e PAF foram usados para diferenciar entre tumor e estroma, respectivamente. O anticorpo X é uma proteína estromal frequentemente encontrada em tumores, mas sua biologia e impacto na imunidade antitumoral não são totalmente compreendidos. Caracterizar o contexto imunológico em áreas ricas em anticorpos X pode elucidar seu papel na imunidade antitumoral e na resposta terapêutica, bem como seu potencial como alvo de medicamentos.
Embora os painéis automatizados personalizados de visualização TSA tenham se mostrado bem-sucedidos para ensaios de proteômica espacial, a aplicação desses ensaios para ensaios de transcriptômica espacial não pôde ser confirmada. Isso provavelmente se deve aos reagentes e ao protocolo utilizado para os protocolos de visualização automatizada, que parecem comprometer a integridade do RNA. Reconhecer que um protocolo de rotulagem automatizado para marcadores de visualização pode ser usado para ensaios de proteômica espacial, mas não para ensaios de transcriptômica espacial, fornece orientação importante sobre os projetos de ensaios da tecnologia Spatial Omics.
Além disso, o estudo demonstra que o ensaio de transcriptômica espacial pode ser usado para traçar o perfil de alvos em regiões tão pequenas quanto 50 μm de diâmetro, ou aproximadamente 15 células. Duas ROIs de tamanhos diferentes foram selecionadas para testar a capacidade do ensaio de também detectar transcritos em pequenas ROIs. Para cada região de interesse, oligos correspondentes a 1.800 alvos de mRNA foram coletados e transformados em bibliotecas de acordo com o protocolo da plataforma de perfil espacial. As bibliotecas foram indexadas individualmente, posteriormente agrupadas e sequenciadas. Isso permitiu a avaliação da eficiência do agrupamento e da capacidade de identificar populações celulares específicas em pequenas ROIs.
Este trabalho mostra que, para ensaios de proteômica espacial, um protocolo automatizado para orientar a seleção de ROI em marcadores específicos de interesse pode ser usado para direcionar seletivamente a interrogação de áreas teciduais relevantes e caracterizar o ambiente espacial do tecido. Além disso, demonstramos que ROIs menores podem ser usadas para ensaios transcriptômicos espaciais para detectar e caracterizar populações celulares específicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Até o momento, anticorpos fluorescentes diretamente conjugados em um protocolo manual são mais comumente utilizados como painéis de visualização para ensaios de proteômica espacial ou transcriptômica espacial 9,10. No entanto, o uso de anticorpos fluorescentes diretamente conjugados pode ser um desafio para marcadores menos abundantes, limitando a seleção de anticorpos adequados. Este protocolo mostra que a marcação de marcadores de visualização pode…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem Thomas Wu por processar arquivos NGS. Agradecemos a James Ziai pelas discussões dos resultados e revisão do manuscrito e Meredith Triplet e Rachel Taylor pela revisão interna do manuscrito.
Materials
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
Riferimenti
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