Dokuda Protein ve RNA Ekspresyonunun Uzamsal Profillemesi: Sanal Mikrodiseksiyona İnce Ayar Yapmaya Bir Yaklaşım
Summary
Burada, tümör mikro ortamını daha iyi karakterize etmek ve spesifik hücre popülasyonlarını tanımlamak için Spatial Omics teknolojileri için ilgi çekici bölgelere (ROI’ler) ince ayar yapmak için bir protokol açıklıyoruz. Proteomik testler için, otomatik özelleştirilmiş protokoller ROI seçimine rehberlik edebilirken, transkriptomik tahliller 50 μm kadar küçük ROI’ler kullanılarak ince ayarlanabilir.
Abstract
Çoklama, uzamsal bağlam sağlarken aynı doku üzerindeki birkaç belirtecin değerlendirilmesini sağlar. Uzamsal Omik teknolojileri, sırasıyla foto-bölünebilir oligo etiketli antikorlardan ve problardan yararlanarak hem protein hem de RNA çoklamasına izin verir. Oligolar, altta yatan biyolojiyi aydınlatmak için doku boyunca belirli bölgelerden ayrılır ve nicelleştirilir. Burada, çalışma, mekansal proteomik tahlillerle birlikte ROI seçimini yönlendirmek için otomatik özel antikor görselleştirme protokollerinin kullanılabileceğini göstermektedir. Bu spesifik yöntem, uzamsal transkriptomik tahlillerle kabul edilebilir bir performans göstermedi. Protokol, belirli bir protein hedefinden floresan sinyalini yükseltmek ve aralarından seçim yapabileceğiniz antikor havuzunu artırmak için tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) kullanarak, otomatik bir platformda belirteç görselleştirmesi için 3 pleks immünofloresan (IF) testinin geliştirilmesini açıklamaktadır. Görselleştirme protokolü, kalite ve tekrarlanabilirliği sağlamak için tamamen doğrulanmış bir 3-plex testi kullanılarak otomatikleştirildi. Ek olarak, DAPI’nin SYTO boyaları ile değişimi, mekansal profilleme platformunda TSA tabanlı IF tahlillerinin görüntülenmesine izin vermek için değerlendirilmiştir. Ek olarak, son derece spesifik ilgi alanlarının (örneğin, belirli bir hücre tipi için zenginleştirilmiş alanlar) araştırılmasına izin vermek için mekansal transkriptomik tahlilini kullanarak küçük ROI’leri seçme yeteneğini test ettik. Sırasıyla yaklaşık 15 hücre ve 100 hücreye karşılık gelen 50 μm ve 300 μm çapındaki ROI’ler toplandı. Örnekler kütüphaneler halinde yapıldı ve küçük ROI’lerden ve dokunun profile özgü bölgelerinden gelen sinyalleri tespit etme yeteneğini araştırmak için sıralandı. Uzamsal proteomik teknolojilerinin, yatırım getirisi seçimine rehberlik etmek için otomatik, standartlaştırılmış protokollerden yüksek oranda yararlandığını belirledik. Bu otomatik görselleştirme protokolü uzamsal transkriptomik tahlillerle uyumlu olmasa da, standart manuel görselleştirme protokolü ile belirli hücre popülasyonlarının küçük ROI’lerde bile başarıyla tespit edilebileceğini test edebildik ve doğrulayabildik.
Introduction
Çoklama tekniklerindeki ilerlemeler, tümörlerde mevcut hedefler için daha iyi karakterizasyon araçları sağlamaya devam etmektedir. Tümör mikroçevresi (TME), immün hücrelere sızan tümör hücreleri ve stromadan oluşan karmaşık bir sistemdir ve mekansal bilginin, ilgilenilen biyobelirteçler arasındaki etkileşim mekanizmalarını daha iyi anlamak ve yorumlamak için kritik öneme sahip olduğu1. GeoMx Dijital Uzamsal Profil Oluşturucu (DSP) ve 10x Visium gibi gelişmekte olan tekniklerle, birden fazla hedef uzamsal bağlamlarında aynı anda tespit edilebilir ve ölçülebilir. Doku görselleştirmeyi kolaylaştıran immünofloresan protokollerinin kullanılması, bu teknolojilerin mekansal profilleme yeteneklerini daha da geliştirebilir.
Bu yöntem geliştirme için odaklandığımız Uzamsal Omik teknolojisi, oligonükleotidlerin UV’ye duyarlı bir fotobölünebilir bağlayıcı aracılığıyla antikorlara veya RNA problarına bağlandığı mekansal proteomik ve transkriptomik tahlillerden oluşur. Histolojik slaytlar bu oligo konjuge antikorlar veya problarla etiketlenir ve daha sonra uzamsal profil oluşturma platformunda görüntülenir. Daha sonra, aydınlatma için farklı boyut ve şekillerde ROI’ler seçilir ve fotokparçalanmış oligonükleotidler aspire edilir ve 96 delikli bir plakada toplanır. Fotoyarıklanmış oligonükleotidler, Nanostring nCounter sistemi veya Yeni Nesil Dizileme (NGS)2,3 (Şekil 1)4,5 ile ölçülmek üzere hazırlanmıştır.
Hücre dağılımları dokular içinde değişir ve seçilen belirteçleri ve farklı ROI boyutlarını kullanarak hücrelerin belirli yerlerini karakterize etme yeteneği, doku ortamını tam olarak anlamak ve belirli özellikleri tanımlamak için büyük önem taşır. Burada bahsedilen Uzamsal Omik teknolojisinde, standart görselleştirme protokolü doğrudan konjuge antikorlar kullanır ve manuel bir protokoldür. Tümör ve stroma arasında ayrım yapmak için standart belirteçler panSitokeratin (panCK) ve CD45 6,7’dir, ancak ilgilenilen spesifik hücre popülasyonlarını hedeflemek için ek belirteçler gereklidir. Ayrıca, doğrudan konjuge floresan antikorların kullanımı, antikor seçimini bol miktarda belirteçle sınırlayan amplifikasyondan yoksundur. Ek olarak, manuel analizler otomatik iş akışlarından daha fazla değişkenliğe tabidir8. Bu nedenle, yatırım getirisi seçimi için özelleştirilebilir, otomatikleştirilmiş ve güçlendirilmiş bir görselleştirme protokolüne sahip olmak istenir.
Burada, çalışma, mekansal proteomik tahliller için, TSA teknolojisinin otomatik bir platformda görselleştirme protokolleri için kullanılabileceğini ve bunun sonucunda daha hedefli ve standartlaştırılmış bir tahlil ile sonuçlanabileceğini göstermektedir. Ek olarak, TSA tabanlı analizler, görselleştirme için seçilebilecek hedef aralığını artırarak düşük ifade eden belirteçlerin kullanılmasını sağlar. PanCK, FAP ve Antikor X için 3 pleks testi, sırasıyla tümör ve stroma arasında ayrım yapmak için panCK ve FAP’ın kullanıldığı otomatik bir platform kullanılarak geliştirilmiştir. Antikor X, tümörlerde sıklıkla karşılaşılan stromal bir proteindir, ancak biyolojisi ve anti-tümör bağışıklığı üzerindeki etkisi tam olarak anlaşılamamıştır. Antikor X bakımından zengin alanlarda immün bağlamın karakterize edilmesi, anti-tümör bağışıklığı ve terapötik yanıttaki rolünü ve ayrıca bir ilaç hedefi olarak potansiyelini açıklığa kavuşturabilir.
Özelleştirilmiş otomatik TSA görselleştirme panellerinin mekansal proteomik tahliller için başarılı olduğu kanıtlanırken, bu testlerin mekansal transkriptomik tahliller için uygulanması doğrulanamamıştır. Bu büyük olasılıkla, RNA bütünlüğünü tehlikeye atıyor gibi görünen reaktifler ve otomatik görselleştirme protokolleri için kullanılan protokolden kaynaklanmaktadır. Görselleştirme belirteçleri için otomatik bir etiketleme protokolünün uzamsal proteomik tahliller için kullanılabileceğini, ancak mekansal transkriptomik tahlilleri için kullanılamayacağını kabul etmek, Uzamsal Omik teknolojisi tahlil tasarımları hakkında önemli bir rehberlik sağlar.
Ek olarak, çalışma, uzamsal transkriptomik testinin, çapı 50 μm kadar küçük olan bölgelerdeki veya yaklaşık 15 hücredeki hedeflerin profilini çıkarmak için kullanılabileceğini göstermektedir. Tahlilin küçük yatırım getirilerindeki transkriptleri de tespit etme yeteneğini test etmek için iki farklı boyutlu yatırım getirisi seçildi. İlgilenilen her bölge için, 1.800 mRNA hedefine karşılık gelen oligolar toplandı ve mekansal profilleme platformu protokolüne göre kütüphaneler haline getirildi. Kütüphaneler ayrı ayrı dizine eklendi, daha sonra havuza alındı ve sıralandı. Bu, hem havuzlama verimliliğinin hem de küçük ROI’lerde spesifik hücre popülasyonlarını tanımlama yeteneğinin değerlendirilmesine izin verdi.
Bu makale, uzamsal proteomik tahliller için, ilgili doku alanlarının sorgulanmasını seçici olarak hedeflemek ve dokunun mekansal ortamını karakterize etmek için belirli belirteçler üzerinde ROI seçimine rehberlik etmek için otomatik bir protokolün kullanılabileceğini göstermektedir. Ayrıca, spesifik hücre popülasyonlarını tespit etmek ve karakterize etmek için mekansal transkriptomik testler için daha küçük ROI’lerin kullanılabileceğini gösteriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bugüne kadar, manuel bir protokolde doğrudan konjuge floresan antikorlar en yaygın olarak uzamsal proteomik veya uzamsal transkriptomik tahlilleri için görselleştirme panelleri olarak kullanılmaktadır 9,10. Bununla birlikte, doğrudan konjuge floresan antikorların kullanımı, daha az miktarda belirteçler için zorlayıcı olabilir ve uygun antikorların seçimini sınırlayabilir. Bu protokol, görselleştirme belirteçlerinin etiketlenmesinin, mekansa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Thomas Wu’yu NGS dosyalarını işlediği için kabul ediyor. Sonuç tartışmaları ve makale incelemesi için James Ziai’ye ve iç makale revizyonu için Meredith Triplet ve Rachel Taylor’a teşekkür ederiz.
Materials
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
Riferimenti
- Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572 (2020).
- Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. New tools for pathology: a user’s review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue. Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).
- McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).
- . NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler Available from: https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview (2022)
- . NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf (2022)
- McCart Reed, A. E., et al. Digital spatial profiling application in breast cancer: a user’s perspective. Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).
- McNamara, K. L., et al. Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response. Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).
- Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Muñoz, N. M., et al. Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma. Communications Biology. 3 (1), 783 (2020).
- Coleman, M., et al. Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates. mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).
- Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).
- Carter, J. M., et al. Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).
- Busse, A., et al. Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment. Cancers. 12 (11), 3448 (2020).
- Kulasinghe, A., et al. Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures. European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).
- Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user’s perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf (2020)
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment. BioRxiv. , (2020).
- Jerby-Arnon, L., et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).
