Räumliches Profiling der Protein- und RNA-Expression im Gewebe: Ein Ansatz zur Feinabstimmung der virtuellen Mikrodissektion
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Feinabstimmung von Regions of Interest (ROIs) für Spatial Omics-Technologien, um die Tumormikroumgebung besser zu charakterisieren und spezifische Zellpopulationen zu identifizieren. Für Proteomik-Assays können automatisierte, angepasste Protokolle die ROI-Auswahl leiten, während Transkriptomik-Assays mit ROIs von nur 50 μm fein abgestimmt werden können.
Abstract
Multiplexing ermöglicht die Beurteilung mehrerer Marker auf demselben Gewebe bei gleichzeitiger Bereitstellung eines räumlichen Kontextes. Spatial Omics-Technologien ermöglichen sowohl Protein- als auch RNA-Multiplexing, indem sie photospaltbare oligomarkierte Antikörper bzw. Sonden nutzen. Oligos werden aus bestimmten Regionen des Gewebes gespalten und quantifiziert, um die zugrunde liegende Biologie aufzuklären. Hier zeigt die Studie, dass automatisierte benutzerdefinierte Antikörper-Visualisierungsprotokolle verwendet werden können, um die ROI-Auswahl in Verbindung mit räumlichen Proteomik-Assays zu steuern. Diese spezifische Methode zeigte keine akzeptable Leistung bei räumlichen Transkriptomik-Assays. Das Protokoll beschreibt die Entwicklung eines 3-Plex-Immunfluoreszenz-Assays (IF) für die Markervisualisierung auf einer automatisierten Plattform unter Verwendung von Tyramid-Signalamplifikation (TSA), um das Fluoreszenzsignal von einem bestimmten Proteinziel zu verstärken und den Antikörperpool zur Auswahl zu erhöhen. Das Visualisierungsprotokoll wurde mit einem gründlich validierten 3-Plex-Assay automatisiert, um Qualität und Reproduzierbarkeit sicherzustellen. Darüber hinaus wurde der Austausch von DAPI gegen SYTO-Farbstoffe evaluiert, um die Bildgebung von TSA-basierten IF-Assays auf der räumlichen Profilierungsplattform zu ermöglichen. Darüber hinaus testeten wir die Fähigkeit, kleine ROIs mit dem räumlichen Transkriptomik-Assay auszuwählen, um die Untersuchung hochspezifischer Interessengebiete zu ermöglichen (z. B. Bereiche, die für einen bestimmten Zelltyp angereichert sind). Es wurden ROIs von 50 μm und 300 μm Durchmesser gesammelt, was etwa 15 Zellen bzw. 100 Zellen entspricht. Die Proben wurden in Bibliotheken umgewandelt und sequenziert, um die Fähigkeit zu untersuchen, Signale von kleinen ROIs und profilspezifischen Regionen des Gewebes zu erkennen. Wir haben festgestellt, dass räumliche Proteomik-Technologien stark von automatisierten, standardisierten Protokollen profitieren, um die ROI-Auswahl zu steuern. Obwohl dieses automatisierte Visualisierungsprotokoll nicht mit räumlichen Transkriptomik-Assays kompatibel war, konnten wir testen und bestätigen, dass bestimmte Zellpopulationen auch bei kleinen ROIs mit dem standardmäßigen manuellen Visualisierungsprotokoll erfolgreich nachgewiesen werden können.
Introduction
Fortschritte in Multiplexing-Techniken bieten weiterhin bessere Charakterisierungswerkzeuge für Targets in Tumoren. Die Tumormikroumgebung (TME) ist ein komplexes System aus Tumorzellen, infiltrierenden Immunzellen und Stroma, in dem räumliche Informationen entscheidend sind, um die Interaktionsmechanismen zwischen Biomarkern von Interesse besser zu verstehen und zu interpretieren1. Mit neuen Techniken wie dem GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) und 10x Visium können mehrere Ziele gleichzeitig in ihrem räumlichen Kontext erkannt und quantifiziert werden. Die Verwendung von Immunfluoreszenzprotokollen, die die Visualisierung von Gewebe erleichtern, kann die räumlichen Profilierungsfähigkeiten dieser Technologien weiter verbessern.
Die Spatial Omics-Technologie, auf die wir uns für diese Methodenentwicklung konzentriert haben, besteht aus räumlichen Proteomik- und Transkriptomik-Assays, bei denen Oligonukleotide über einen UV-empfindlichen photospaltbaren Linker an Antikörper oder RNA-Sonden gebunden werden. Histologische Objektträger werden mit diesen oligokonjugierten Antikörpern oder Sonden markiert und dann auf der räumlichen Profilierungsplattform abgebildet. Als nächstes werden ROIs unterschiedlicher Größe und Form für die Beleuchtung ausgewählt, und die photogespaltenen Oligonukleotide werden abgesaugt und in einer 96-Well-Platte gesammelt. Die photogespaltenen Oligonukleotide können entweder mit dem Nanostring nCounter-System oder mit Next Generation Sequencing (NGS)2,3 quantifiziert werden (Abbildung 1)4,5.
Die Zellverteilungen variieren innerhalb von Geweben, und die Fähigkeit, bestimmte Positionen von Zellen mit ausgewählten Markern und unterschiedlichen ROI-Größen zu charakterisieren, ist von großer Bedeutung, um die Gewebeumgebung vollständig zu verstehen und spezifische Merkmale zu identifizieren. In der hier erwähnten Spatial Omics-Technologie verwendet das Standard-Visualisierungsprotokoll direkt konjugierte Antikörper und ist ein manuelles Protokoll. Die Standardmarker zur Unterscheidung zwischen Tumor und Stroma sind panCytokeratin (panCK) und CD456,7, aber zusätzliche Marker sind notwendig, um spezifische Zellpopulationen von Interesse anzusprechen. Darüber hinaus fehlt der Verwendung von direkt konjugierten fluoreszierenden Antikörpern die Amplifikation, was die Antikörperselektion auf reichlich vorhandene Marker beschränkt. Darüber hinaus unterliegen manuelle Assays einer größeren Variabilität als automatisierte Workflows8. Daher ist es wünschenswert, ein anpassbares, automatisiertes und erweitertes Visualisierungsprotokoll für die ROI-Auswahl zu haben.
Hier zeigt die Studie, dass die TSA-Technologie für räumliche Proteomik-Assays für Visualisierungsprotokolle auf einer automatisierten Plattform verwendet werden kann, was zu einem gezielteren und standardisierteren Assay führt. Darüber hinaus ermöglichen TSA-basierte Assays die Verwendung von Markern mit geringer Expression, wodurch der Bereich der Ziele, die für die Visualisierung ausgewählt werden können, erweitert wird. Ein 3-Plex-Assay für panCK, FAP und Antikörper X wurde unter Verwendung einer automatisierten Plattform entwickelt, auf der panCK und FAP zur Unterscheidung zwischen Tumor und Stroma verwendet wurden. Antikörper X ist ein Stromaprotein, das häufig in Tumoren vorkommt, aber seine Biologie und sein Einfluss auf die Anti-Tumor-Immunität sind nicht vollständig verstanden. Die Charakterisierung des Immunkontexts in Gebieten, die reich an Antikörper X sind, kann seine Rolle bei der Antitumorimmunität und der therapeutischen Reaktion sowie sein Potenzial als Wirkstoffziel aufklären.
Während sich kundenspezifische automatisierte TSA-Visualisierungspanels für räumliche Proteomik-Assays als erfolgreich erwiesen, konnte die Anwendung dieser Assays für räumliche Transkriptomik-Assays nicht bestätigt werden. Dies ist höchstwahrscheinlich auf die Reagenzien und das Protokoll zurückzuführen, die für die automatisierten Visualisierungsprotokolle verwendet werden, die die RNA-Integrität zu beeinträchtigen scheinen. Die Erkenntnis, dass ein automatisiertes Markierungsprotokoll für Visualisierungsmarker für räumliche Proteomik-Assays, nicht aber für räumliche Transkriptomik-Assays verwendet werden kann, bietet eine wichtige Orientierungshilfe für Assay-Designs der Spatial Omics-Technologie.
Darüber hinaus zeigt die Studie, dass der räumliche Transkriptomik-Assay verwendet werden kann, um Ziele in Regionen mit einem Durchmesser von nur 50 μm oder etwa 15 Zellen zu profilieren. Es wurden zwei unterschiedlich große ROIs ausgewählt, um die Fähigkeit des Assays zu testen, auch Transkripte in kleinen ROIs zu erkennen. Für jede Region von Interesse wurden Oligos, die 1.800 mRNA-Zielen entsprachen, gesammelt und gemäß dem Protokoll der räumlichen Profiling-Plattform in Bibliotheken umgewandelt. Bibliotheken wurden einzeln indiziert, anschließend gepoolt und sequenziert. Dies ermöglichte die Bewertung sowohl der Pooling-Effizienz als auch der Fähigkeit, spezifische Zellpopulationen in kleinen ROIs zu identifizieren.
Diese Arbeit zeigt, dass für räumliche Proteomik-Assays ein automatisiertes Protokoll zur Steuerung der ROI-Auswahl auf bestimmten Markern von Interesse verwendet werden kann, um die Abfrage relevanter Gewebebereiche selektiv zu steuern und die räumliche Umgebung des Gewebes zu charakterisieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass kleinere ROIs für räumliche transkriptomische Assays verwendet werden können, um spezifische Zellpopulationen zu detektieren und zu charakterisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bis heute werden direkt konjugierte fluoreszierende Antikörper in einem manuellen Protokoll am häufigsten als Visualisierungspanels für räumliche Proteomik oder räumliche Transkriptomik-Assaysverwendet 9,10. Die Verwendung von direkt konjugierten fluoreszierenden Antikörpern kann jedoch für weniger häufig vorkommende Marker eine Herausforderung darstellen, was die Auswahl geeigneter Antikörper einschränkt. Dieses Protokoll zeigt, dass die Markierung von…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Thomas Wu für die Bearbeitung der NGS-Dateien. Wir danken James Ziai für die Ergebnisdiskussionen und die Überprüfung des Manuskripts und Meredith Triplet und Rachel Taylor für die interne Überarbeitung des Manuskripts.
Materials
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
Riferimenti
- Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572 (2020).
- Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. New tools for pathology: a user’s review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue. Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).
- McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).
- . NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler Available from: https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview (2022)
- . NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf (2022)
- McCart Reed, A. E., et al. Digital spatial profiling application in breast cancer: a user’s perspective. Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).
- McNamara, K. L., et al. Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response. Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).
- Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Muñoz, N. M., et al. Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma. Communications Biology. 3 (1), 783 (2020).
- Coleman, M., et al. Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates. mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).
- Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).
- Carter, J. M., et al. Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).
- Busse, A., et al. Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment. Cancers. 12 (11), 3448 (2020).
- Kulasinghe, A., et al. Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures. European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).
- Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user’s perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf (2020)
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment. BioRxiv. , (2020).
- Jerby-Arnon, L., et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).
