Ruimtelijke profilering van eiwit- en RNA-expressie in weefsel: een benadering om virtuele microdissectie te verfijnen
Summary
Hier beschrijven we een protocol voor het verfijnen van interessante regio’s (ROI’s) voor Spatial Omics-technologieën om de micro-omgeving van de tumor beter te karakteriseren en specifieke celpopulaties te identificeren. Voor proteomics-assays kunnen geautomatiseerde aangepaste protocollen de ROI-selectie begeleiden, terwijl transcriptomics-assays kunnen worden verfijnd met behulp van ROI’s zo klein als 50 μm.
Abstract
Multiplexing maakt de beoordeling van verschillende markers op hetzelfde weefsel mogelijk en biedt tegelijkertijd ruimtelijke context. Spatial Omics-technologieën maken zowel eiwit- als RNA-multiplexing mogelijk door gebruik te maken van respectievelijk foto-splijtbare oligo-gelabelde antilichamen en sondes. Oligo’s worden gesplitst en gekwantificeerd van specifieke regio’s in het weefsel om de onderliggende biologie op te helderen. Hier toont de studie aan dat geautomatiseerde aangepaste antilichaamvisualisatieprotocollen kunnen worden gebruikt om ROI-selectie te begeleiden in combinatie met ruimtelijke proteomics-assays. Deze specifieke methode vertoonde geen acceptabele prestaties met ruimtelijke transcriptomics-assays. Het protocol beschrijft de ontwikkeling van een 3-plex immunofluorescent (IF) assay voor markervisualisatie op een geautomatiseerd platform, met behulp van tyramide signaalversterking (TSA) om het fluorescerende signaal van een bepaald eiwitdoel te versterken en de antilichaampool te vergroten om uit te kiezen. Het visualisatieprotocol werd geautomatiseerd met behulp van een grondig gevalideerde 3-plex-test om kwaliteit en reproduceerbaarheid te garanderen. Daarnaast werd de uitwisseling van DAPI voor SYTO-kleurstoffen geëvalueerd om beeldvorming van TSA-gebaseerde IF-assays op het ruimtelijke profileringsplatform mogelijk te maken. Daarnaast hebben we het vermogen getest om kleine ROI’s te selecteren met behulp van de ruimtelijke transcriptomics-test om het onderzoek van zeer specifieke interessegebieden mogelijk te maken (bijvoorbeeld gebieden die zijn verrijkt voor een bepaald celtype). ROIs van 50 μm en 300 μm diameter werden verzameld, wat overeenkomt met respectievelijk ongeveer 15 cellen en 100 cellen. Monsters werden gemaakt in bibliotheken en gesequenced om het vermogen te onderzoeken om signalen van kleine ROI’s en profielspecifieke gebieden van het weefsel te detecteren. We hebben vastgesteld dat ruimtelijke proteomics-technologieën zeer profiteren van geautomatiseerde, gestandaardiseerde protocollen om ROI-selectie te begeleiden. Hoewel dit geautomatiseerde visualisatieprotocol niet compatibel was met ruimtelijke transcriptomics-assays, konden we testen en bevestigen dat specifieke celpopulaties met succes kunnen worden gedetecteerd, zelfs in kleine ROI’s met het standaard handmatige visualisatieprotocol.
Introduction
Vooruitgang in multiplexingtechnieken blijft betere karakteriseringsinstrumenten bieden voor doelen die aanwezig zijn in tumoren. De tumormicro-omgeving (TME) is een complex systeem van tumorcellen, infiltrerende immuuncellen en stroma, waarbij ruimtelijke informatie van cruciaal belang is om mechanismen van interactie tussen biomarkers van belang beter te begrijpen en te interpreteren1. Met opkomende technieken zoals de GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) en 10x Visium kunnen meerdere doelen tegelijkertijd worden gedetecteerd en gekwantificeerd binnen hun ruimtelijke context. Het gebruik van immunofluorescentieprotocollen die weefselvisualisatie vergemakkelijken, kan de ruimtelijke profileringsmogelijkheden van deze technologieën verder verbeteren.
De Spatial Omics-technologie waarop we ons voor deze methodeontwikkeling hebben gericht, bestaat uit ruimtelijke proteomics en transcriptomics-assays waarbij oligonucleotiden via een UV-gevoelige fotocleavable linker aan antilichamen of RNA-sondes worden bevestigd. Histologische dia’s worden gelabeld met deze oligo-geconjugeerde antilichamen of sondes en vervolgens afgebeeld op het ruimtelijke profileringsplatform. Vervolgens worden ROIs van verschillende groottes en vormen geselecteerd voor verlichting en worden de fotocleaved oligonucleotiden geaspireerd en verzameld in een 96-well plaat. De fotocleaved oligonucleotiden worden bereid om te worden gekwantificeerd met het Nanostring nCounter-systeem of Next Generation Sequencing (NGS)2,3 (Figuur 1)4,5.
Celverdelingen variëren binnen weefsels en het vermogen om specifieke locaties van cellen te karakteriseren met behulp van geselecteerde markers en verschillende ROI-groottes is van groot belang om de weefselomgeving volledig te begrijpen en specifieke kenmerken te identificeren. In de hier genoemde Spatial Omics-technologie maakt het standaard visualisatieprotocol gebruik van direct geconjugeerde antilichamen en is het een handmatig protocol. De standaardmarkers om onderscheid te maken tussen tumor en stroma zijn panCytokeratine (panCK) en CD45 6,7, maar aanvullende markers zijn nodig om specifieke celpopulaties van belang te targeten. Bovendien mist het gebruik van direct geconjugeerde fluorescerende antilichamen amplificatie, wat de selectie van antilichamen beperkt tot overvloedige markers. Bovendien zijn handmatige testen onderhevig aan meer variabiliteit dan geautomatiseerde workflows8. Daarom is het wenselijk om een aanpasbaar, geautomatiseerd en versterkt visualisatieprotocol te hebben voor ROI-selectie.
Hier toont de studie aan dat, voor ruimtelijke proteomics-assays, TSA-technologie kan worden gebruikt voor visualisatieprotocollen op een geautomatiseerd platform, wat resulteert in een meer gerichte en gestandaardiseerde test. Bovendien maken op TSA gebaseerde assays het gebruik van low-expressing markers mogelijk, waardoor het bereik van doelen die kunnen worden geselecteerd voor visualisatie wordt vergroot. Een 3-plex assay voor panCK, FAP en Antibody X werd ontwikkeld met behulp van een geautomatiseerd platform waar panCK en FAP werden gebruikt om onderscheid te maken tussen respectievelijk tumor en stroma. Antilichaam X is een stromaal eiwit dat vaak voorkomt in tumoren, maar de biologie en impact ervan op de immuniteit tegen tumoren zijn niet volledig begrepen. Het karakteriseren van de immuuncontextuur in gebieden die rijk zijn aan antilichaam X kan zijn rol in antitumorimuniteit en therapeutische respons ophelderen, evenals het potentieel als medicijndoelwit.
Hoewel aangepaste geautomatiseerde TSA-visualisatiepanelen succesvol bleken te zijn voor ruimtelijke proteomics-assays, kon de toepassing van deze assays voor ruimtelijke transcriptomics-assays niet worden bevestigd. Dit is hoogstwaarschijnlijk te wijten aan de reagentia en het protocol dat wordt gebruikt voor de geautomatiseerde visualisatieprotocollen, die de RNA-integriteit in gevaar lijken te brengen. Erkennen dat een geautomatiseerd etiketteringsprotocol voor visualisatiemarkers kan worden gebruikt voor ruimtelijke proteomics-assays, maar niet voor ruimtelijke transcriptomics-assays, biedt belangrijke richtlijnen voor Spatial Omics-technologietestontwerpen.
Bovendien toont de studie aan dat de ruimtelijke transcriptomics-test kan worden gebruikt om doelen te profileren in regio’s met een diameter van slechts 50 μm, of ongeveer 15 cellen. Twee ROIs van verschillende grootte werden geselecteerd om het vermogen van de test te testen om ook transcripties in kleine ROI’s te detecteren. Voor elke interesseregio werden oligo’s die overeenkomen met 1.800 mRNA-doelen verzameld en in bibliotheken gemaakt volgens het protocol van het spatial profiling platform. Bibliotheken werden individueel geïndexeerd, vervolgens gepoold en gesequenced. Dit maakte de evaluatie mogelijk van zowel de pooling-efficiëntie als het vermogen om specifieke celpopulaties in kleine ROI’s te identificeren.
Dit artikel toont aan dat voor ruimtelijke proteomics-assays een geautomatiseerd protocol om ROI-selectie op specifieke markers van belang te begeleiden, kan worden gebruikt om selectief de ondervraging van relevante weefselgebieden te richten en de ruimtelijke omgeving van het weefsel te karakteriseren. Verder tonen we aan dat kleinere ROIs kunnen worden gebruikt voor ruimtelijke transcriptomische assays om specifieke celpopulaties te detecteren en te karakteriseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tot op heden worden direct geconjugeerde fluorescerende antilichamen in een handmatig protocol het meest gebruikt als visualisatiepanelen voor ruimtelijke proteomics of ruimtelijke transcriptomics-assays 9,10. Het gebruik van direct geconjugeerde fluorescerende antilichamen kan echter een uitdaging zijn voor minder overvloedige markers, waardoor de selectie van geschikte antilichamen wordt beperkt. Dit protocol laat zien dat het labelen van visualisatiemarkers ka…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen Thomas Wu voor het verwerken van NGS-bestanden. We bedanken James Ziai voor de resultatendiscussies en manuscriptbeoordeling en Meredith Triplet en Rachel Taylor voor interne manuscriptrevisie.
Materials
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
Riferimenti
- Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572 (2020).
- Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. New tools for pathology: a user’s review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue. Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).
- McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).
- . NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler Available from: https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview (2022)
- . NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf (2022)
- McCart Reed, A. E., et al. Digital spatial profiling application in breast cancer: a user’s perspective. Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).
- McNamara, K. L., et al. Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response. Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).
- Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Muñoz, N. M., et al. Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma. Communications Biology. 3 (1), 783 (2020).
- Coleman, M., et al. Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates. mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).
- Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).
- Carter, J. M., et al. Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).
- Busse, A., et al. Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment. Cancers. 12 (11), 3448 (2020).
- Kulasinghe, A., et al. Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures. European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).
- Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user’s perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf (2020)
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment. BioRxiv. , (2020).
- Jerby-Arnon, L., et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).
