組織におけるタンパク質およびRNA発現の空間プロファイリング:仮想マイクロダイセクションの微調整へのアプローチ
Summary
ここでは、腫瘍微小環境をより適切に特徴付け、特定の細胞集団を特定するために、空間オミクス技術の関心領域(ROI)を微調整するためのプロトコルについて説明します。プロテオミクスアッセイでは、カスタマイズされたプロトコルを自動化してROIを選択し、トランスクリプトミクスアッセイでは50 μmのROIを利用して微調整することができます。
Abstract
多重化により、空間コンテキストを提供しながら、同じ組織上の複数のマーカーを評価できます。空間オミクス技術は、光切断可能なオリゴタグ付き抗体とプローブをそれぞれ活用することにより、タンパク質とRNAの両方のマルチプレックスを可能にします。オリゴは、組織全体の特定の領域から切断および定量化され、基礎となる生物学を解明します。ここで、この研究は、自動化されたカスタム抗体視覚化プロトコルを利用して、空間プロテオミクスアッセイと組み合わせてROI選択をガイドできることを示しています。この特定の方法は、空間トランスクリプトミクスアッセイで許容できる性能を示さなかった。このプロトコルでは、チラミドシグナル増幅(TSA)を使用して特定のタンパク質ターゲットからの蛍光シグナルを増幅し、選択する抗体プールを増やす、自動プラットフォームでマーカーを視覚化するための3-plex免疫蛍光(IF)アッセイの開発について説明しています。可視化プロトコルは、品質と再現性を確保するために、徹底的に検証された3プレックスアッセイを使用して自動化されました。さらに、DAPIとSYTO色素の交換を評価して、空間プロファイリングプラットフォームでTSAベースのIFアッセイをイメージングできるようにしました。さらに、空間トランスクリプトミクスアッセイを使用して小さなROIを選択する能力をテストし、高度に特異的な関心領域(特定の細胞タイプに富む領域など)の調査を可能にしました。直径50 μmと300 μmのROIを収集し、これはそれぞれ約15細胞と100細胞に相当します。サンプルをライブラリにして配列決定し、組織の小さなROIおよびプロファイル特異的領域からのシグナルを検出する能力を調査しました。私たちは、空間プロテオミクス技術がROI選択を導くための自動化された標準化されたプロトコルから大きな恩恵を受けることを決定しました。この自動可視化プロトコルは空間トランスクリプトミクスアッセイと互換性がありませんでしたが、標準的な手動可視化プロトコルを使用すると、小さなROIでも特定の細胞集団を正常に検出できることをテストし、確認することができました。
Introduction
マルチプレックス技術の進歩は、腫瘍に存在する標的に対してより優れた特性評価ツールを提供し続けています。腫瘍微小環境(TME)は、腫瘍細胞、浸潤免疫細胞、および間質の複雑なシステムであり、空間情報は、関心のあるバイオマーカー間の相互作用のメカニズムをよりよく理解および解釈するために重要です1。GeoMxデジタル空間プロファイラー(DSP)や10x Visiumなどの新しい技術により、複数のターゲットを空間コンテキスト内で同時に検出および定量化できます。組織の可視化を容易にする免疫蛍光プロトコルを使用すると、これらの技術の空間プロファイリング機能をさらに向上させることができます。
本手法開発で着目した空間オミクス技術は、UV感受性光分解性リンカーを介してオリゴヌクレオチドを抗体やRNAプローブに結合させる空間プロテオミクスやトランスクリプトミクスアッセイです。組織学的スライドは、これらのオリゴ結合抗体またはプローブで標識され、空間プロファイリングプラットフォームで画像化されます。次に、さまざまなサイズと形状のROIを照明用に選択し、光切断されたオリゴヌクレオチドを吸引して96ウェルプレートに収集します。光切断されたオリゴヌクレオチドは、ナノストリングnCounterシステムまたは次世代シーケンシング(NGS)2,3のいずれかで定量できるように調製されます(図1)4,5。
細胞分布は組織内で異なり、選択されたマーカーと異なるROIサイズを使用して細胞の特定の位置を特徴付ける能力は、組織環境を完全に理解し、特定の特徴を特定するために非常に重要です。ここで言及した空間オミクス技術では、標準的な可視化プロトコルは直接結合抗体を使用し、手動プロトコルです。腫瘍と間質を区別するための標準マーカーは、パンサイトケラチン(panCK)およびCD45 6,7ですが、目的の特定の細胞集団を標的とするには、追加のマーカーが必要です。さらに、直接結合した蛍光抗体の使用は増幅を欠いており、抗体の選択が豊富なマーカーに限定されています。さらに、手動アッセイは、自動化されたワークフローよりもばらつきが大きくなります8。したがって、ROI選択のために、カスタマイズ可能で、自動化され、増幅された視覚化プロトコルを有することが望ましい。
ここで、この研究は、空間プロテオミクスアッセイの場合、TSAテクノロジーを自動化されたプラットフォームでの視覚化プロトコルに使用でき、よりターゲットを絞った標準化されたアッセイを実現できることを示しています。さらに、TSAベースのアッセイでは、低発現マーカーの使用が可能になり、可視化のために選択できるターゲットの範囲が広がります。panCK、FAP、および抗体Xの3プレックスアッセイは、panCKおよびFAPを使用して腫瘍と間質をそれぞれ区別する自動化されたプラットフォームを使用して開発されました。抗体Xは腫瘍で頻繁に遭遇する間質タンパク質ですが、その生物学と抗腫瘍免疫への影響は完全には理解されていません。抗体Xが豊富な領域における免疫コンテクスチャーの特性評価は、抗腫瘍免疫および治療反応におけるその役割、ならびに創薬標的としてのその可能性を解明することができる。
カスタマイズされた自動TSA可視化パネルは、空間プロテオミクスアッセイで成功することが証明されましたが、空間トランスクリプトミクスアッセイへのこれらのアッセイの適用は確認できませんでした。これは、RNAの完全性を損なうと思われる自動可視化プロトコルに使用される試薬とプロトコルが原因である可能性が最も高いです。可視化マーカーの自動標識プロトコルは、空間プロテオミクスアッセイには使用できるが、空間トランスクリプトミクスアッセイには使用できないことを認識することで、空間オミクス技術のアッセイ設計に関する重要なガイダンスを提供します。
さらに、この研究は、空間トランスクリプトミクスアッセイを使用して、直径50μmの領域(約15細胞)のターゲットをプロファイリングできることを実証しています。小さなROIの転写物も検出するアッセイの能力をテストするために、2つの異なるサイズのROIを選択しました。各関心領域について、1,800 mRNAターゲットに対応するオリゴを収集し、空間プロファイリングプラットフォームプロトコルに従ってライブラリにしました。ライブラリは個別に索引付けされ、その後プールされ、順序付けられました。これにより、プーリング効率と、小さなROIで特定の細胞集団を特定する能力の両方を評価することができました。
この論文は、空間プロテオミクスアッセイの場合、関心のある特定のマーカーのROI選択をガイドする自動プロトコルを使用して、関連する組織領域の調査を選択的に標的化し、組織の空間環境を特徴付けることができることを示しています。さらに、より小さなROIを空間トランスクリプトームアッセイに使用して、特定の細胞集団を検出および特性評価できることを実証します。
Protocol
Representative Results
Discussion
今日まで、手動プロトコルにおける直接結合蛍光抗体は、空間プロテオミクスまたは空間トランスクリプトミクスアッセイの可視化パネルとして最も一般的に使用されている9、10。しかし、直接結合した蛍光抗体の使用は、マーカーの数が少ない場合には困難であり、適切な抗体の選択が制限されます。このプロトコルは、可視化マーカーの標識?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、NGSファイルを処理したトーマス・ウーを認めています。結果の議論と原稿のレビューをしてくれたJames Ziaiと、内部原稿の改訂をしてくれたMeredith TriplelとRachel Taylorに感謝します。
Materials
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
Riferimenti
- Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572 (2020).
- Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. New tools for pathology: a user’s review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue. Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).
- McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).
- . NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler Available from: https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview (2022)
- . NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf (2022)
- McCart Reed, A. E., et al. Digital spatial profiling application in breast cancer: a user’s perspective. Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).
- McNamara, K. L., et al. Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response. Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).
- Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Muñoz, N. M., et al. Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma. Communications Biology. 3 (1), 783 (2020).
- Coleman, M., et al. Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates. mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).
- Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).
- Carter, J. M., et al. Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).
- Busse, A., et al. Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment. Cancers. 12 (11), 3448 (2020).
- Kulasinghe, A., et al. Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures. European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).
- Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user’s perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf (2020)
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment. BioRxiv. , (2020).
- Jerby-Arnon, L., et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).
