Her beskriver vi en protokoll for finjustering av interesseområder (ROIs) for Spatial Omics-teknologier for bedre å karakterisere tumormikromiljøet og identifisere spesifikke cellepopulasjoner. For proteomikkanalyser kan automatiserte tilpassede protokoller veilede avkastningsvalg, mens transkriptomikkanalyser kan finjusteres ved å bruke avkastninger så små som 50 μm.
Multiplexing gjør det mulig å vurdere flere markører på samme vev samtidig som det gir romlig kontekst. Romlige Omics-teknologier tillater både protein- og RNA-multipleksing ved å utnytte henholdsvis fotospaltbare oligo-merkede antistoffer og prober. Oligoer spaltes og kvantifiseres fra bestemte regioner over vevet for å belyse den underliggende biologien. Her viser studien at automatiserte tilpassede antistoffvisualiseringsprotokoller kan brukes til å veilede avkastningsvalg i forbindelse med romlige proteomikkanalyser. Denne spesifikke metoden viste ikke akseptabel ytelse med romlige transkriptomikkanalyser. Protokollen beskriver utviklingen av en 3-plex immunfluorescerende (IF) analyse for markørvisualisering på en automatisert plattform, ved hjelp av tyramidsignalforsterkning (TSA) for å forsterke fluorescerende signal fra et gitt proteinmål og øke antistoffbassenget å velge mellom. Visualiseringsprotokollen ble automatisert ved hjelp av en grundig validert 3-plex analyse for å sikre kvalitet og reproduserbarhet. I tillegg ble utvekslingen av DAPI for SYTO-fargestoffer evaluert for å tillate avbildning av TSA-baserte IF-analyser på den romlige profileringsplattformen. I tillegg testet vi muligheten til å velge små avkastninger ved hjelp av spatial transcriptomics-analysen for å tillate undersøkelse av svært spesifikke interesseområder (f.eks. Områder beriket for en gitt celletype). ROI på 50 μm og 300 μm diameter ble samlet, noe som tilsvarer henholdsvis ca. 15 celler og 100 celler. Prøver ble laget i biblioteker og sekvensert for å undersøke evnen til å oppdage signaler fra små avkastninger og profilspesifikke regioner i vevet. Vi bestemte oss for at romlige proteomikkteknologier drar stor nytte av automatiserte, standardiserte protokoller for å veilede avkastningsvalg. Selv om denne automatiserte visualiseringsprotokollen ikke var kompatibel med romlige transkriptomikkanalyser, var vi i stand til å teste og bekrefte at spesifikke cellepopulasjoner med hell kan oppdages selv i små avkastninger med standard manuell visualiseringsprotokoll.
Fremskritt i multipleksingsteknikker fortsetter å gi bedre karakteriseringsverktøy for mål som er tilstede i svulster. Tumormikromiljøet (TME) er et komplekst system av tumorceller, infiltrerende immunceller og stroma, hvor romlig informasjon er avgjørende for å bedre forstå og tolke mekanismer for interaksjon mellom biomarkører av interesse1. Med nye teknikker som GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) og 10x Visium, kan flere mål oppdages og kvantifiseres samtidig innenfor deres romlige kontekst. Bruken av immunfluorescensprotokoller som letter vevsvisualisering, kan ytterligere forbedre de romlige profileringsegenskapene til disse teknologiene.
Spatial Omics-teknologien vi fokuserte på for denne metodeutviklingen består av romlige proteomikk- og transkriptomikkanalyser der oligonukleotider er festet til antistoffer eller RNA-sonder via en UV-sensitiv fotoklyvbar linker. Histologiske lysbilder er merket med disse oligo-konjugerte antistoffene eller sondene og deretter avbildet på den romlige profileringsplattformen. Deretter velges avkastninger av forskjellige størrelser og former for belysning, og de fotokleaved oligonukleotidene aspireres og samles i en 96-brønns plate. De fotokleaved oligonukleotidene er forberedt på å bli kvantifisert med enten Nanostring nCounter-systemet eller Next Generation Sequencing (NGS) 2,3 (Figur 1) 4,5.
Cellefordelinger varierer innenfor vev, og evnen til å karakterisere bestemte steder av celler ved hjelp av utvalgte markører og forskjellige avkastningsstørrelser er av stor betydning for å forstå vevsmiljøet fullt ut og identifisere spesifikke funksjoner. I Spatial Omics-teknologien som er nevnt her, bruker standard visualiseringsprotokoll direkte konjugerte antistoffer og er en manuell protokoll. Standardmarkørene for å skille mellom tumor og stroma er panCytokeratin (panCK) og CD456,7, men ytterligere markører er nødvendige for å målrette mot spesifikke cellepopulasjoner av interesse. Videre mangler bruk av direkte konjugerte fluorescerende antistoffer forsterkning, noe som begrenser antistoffvalg til rikelig markører. I tillegg er manuelle analyser gjenstand for større variasjon enn automatiserte arbeidsflyter8. Derfor er det ønskelig å ha en tilpassbar, automatisert og forsterket visualiseringsprotokoll for valg av avkastning.
Her viser studien at TSA-teknologi for romlige proteomikkanalyser kan brukes til visualiseringsprotokoller på en automatisert plattform, noe som resulterer i en mer målrettet og standardisert analyse. I tillegg muliggjør TSA-baserte analyser bruk av markører med lav uttrykk, noe som øker rekkevidden av mål som kan velges for visualisering. En 3-plex analyse for panCK, FAP og antistoff X ble utviklet ved hjelp av en automatisert plattform der panCK og FAP ble brukt til å skille mellom henholdsvis tumor og stroma. Antistoff X er et stromalt protein som ofte oppstår i svulster, men dets biologi og innvirkning på antitumorimmunitet er ikke fullt ut forstått. Karakterisering av immunkontexture i områder rik på antistoff X kan belyse sin rolle i antitumorimmunitet og terapeutisk respons, samt potensialet som et legemiddelmål.
Mens tilpassede automatiserte TSA-visualiseringspaneler viste seg å være vellykkede for romlige proteomikkanalyser, kunne anvendelsen av disse analysene for romlige transkriptomikkanalyser ikke bekreftes. Dette skyldes mest sannsynlig reagensene og protokollen som brukes til de automatiserte visualiseringsprotokollene, som ser ut til å kompromittere RNA-integriteten. Erkjennelsen av at en automatisert merkingsprotokoll for visualiseringsmarkører kan brukes til romlige proteomikkanalyser, men ikke for romlige transkriptomikkanalyser, gir viktig veiledning om Spatial Omics teknologianalysedesign.
I tillegg viser studien at den romlige transkriptomikkanalysen kan brukes til å profilere mål i regioner så små som 50 μm i diameter, eller omtrent 15 celler. To ROIer i forskjellige størrelser ble valgt for å teste analysens evne til også å oppdage transkripsjoner i små avkastninger. For hver interesseregion ble oligoer tilsvarende 1,800 mRNA-mål samlet og gjort til biblioteker i henhold til den romlige profileringsplattformprotokollen. Biblioteker ble individuelt indeksert, deretter samlet og sekvensert. Dette tillot evalueringen av både pooling effektivitet og evnen til å identifisere spesifikke cellepopulasjoner i små avkastninger.
Dette papiret viser at for romlige proteomikkanalyser kan en automatisert protokoll for å veilede avkastningsvalg på spesifikke markører av interesse brukes til selektivt å målrette avhør av relevante vevsområder og karakterisere vevets romlige miljø. Videre demonstrerer vi at mindre avkastninger kan brukes til romlige transkriptomiske analyser for å oppdage og karakterisere spesifikke cellepopulasjoner.
Til dags dato er direkte konjugerte fluorescerende antistoffer i en manuell protokoll mest brukt som visualiseringspaneler for romlig proteomikk eller romlige transkriptomikkanalyser 9,10. Imidlertid kan bruk av direkte konjugerte fluorescerende antistoffer være utfordrende for mindre rikelige markører, noe som begrenser valget av egnede antistoffer. Denne protokollen viser at merking av visualiseringsmarkører kan automatiseres på en automatisert fargeplattfo…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner Thomas Wu for behandling av NGS-filer. Vi takker James Ziai for resultatdiskusjonene og manuskriptgjennomgangen og Meredith Triplet og Rachel Taylor for intern manuskriptrevisjon.
10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
Python | Python | Statistical analysis | |
Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |