Perfil espacial de la expresión de proteínas y ARN en tejidos: un enfoque para ajustar la microdisección virtual
Summary
Aquí, describimos un protocolo para ajustar las regiones de interés (ROI) para las tecnologías de Spatial Omics para caracterizar mejor el microambiente tumoral e identificar poblaciones celulares específicas. Para los ensayos proteómicos, los protocolos personalizados automatizados pueden guiar la selección del ROI, mientras que los ensayos transcriptómicos se pueden ajustar utilizando ROI tan pequeños como 50 μm.
Abstract
La multiplexación permite la evaluación de varios marcadores en el mismo tejido al tiempo que proporciona un contexto espacial. Las tecnologías de Spatial Omics permiten la multiplexación de proteínas y ARN mediante el aprovechamiento de anticuerpos y sondas oligomarcados foto-divisorias, respectivamente. Los oligos se escinden y cuantifican a partir de regiones específicas a través del tejido para dilucidar la biología subyacente. Aquí, el estudio demuestra que los protocolos automatizados de visualización de anticuerpos personalizados se pueden utilizar para guiar la selección del ROI junto con los ensayos de proteómica espacial. Este método específico no mostró un rendimiento aceptable con los ensayos de transcriptómica espacial. El protocolo describe el desarrollo de un ensayo inmunofluorescente (IF) 3-plex para la visualización de marcadores en una plataforma automatizada, utilizando amplificación de señal de tiramida (TSA) para amplificar la señal fluorescente de un objetivo de proteína dado y aumentar el grupo de anticuerpos para elegir. El protocolo de visualización se automatizó utilizando un ensayo 3-plex completamente validado para garantizar la calidad y la reproducibilidad. Además, se evaluó el intercambio de DAPI por colorantes SYTO para permitir la obtención de imágenes de ensayos de FI basados en TSA en la plataforma de perfiles espaciales. Además, probamos la capacidad de seleccionar pequeños ROI utilizando el ensayo de transcriptómica espacial para permitir la investigación de áreas de interés altamente específicas (por ejemplo, áreas enriquecidas para un tipo de célula determinado). Se recolectaron ROI de 50 μm y 300 μm de diámetro, lo que corresponde a aproximadamente 15 células y 100 células, respectivamente. Las muestras se hicieron en bibliotecas y se secuenciaron para investigar la capacidad de detectar señales de pequeños ROI y regiones específicas del perfil del tejido. Determinamos que las tecnologías de proteómica espacial se benefician enormemente de los protocolos automatizados y estandarizados para guiar la selección del ROI. Si bien este protocolo de visualización automatizada no era compatible con los ensayos de transcriptómica espacial, pudimos probar y confirmar que poblaciones celulares específicas pueden detectarse con éxito incluso en pequeños ROI con el protocolo de visualización manual estándar.
Introduction
Los avances en las técnicas de multiplexación continúan proporcionando mejores herramientas de caracterización para los objetivos presentes en los tumores. El microambiente tumoral (EMT) es un sistema complejo de células tumorales, células inmunes infiltrantes y estroma, donde la información espacial es crítica para comprender e interpretar mejor los mecanismos de interacción entre biomarcadores de interés1. Con técnicas emergentes como GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) y 10x Visium, se pueden detectar y cuantificar múltiples objetivos simultáneamente dentro de su contexto espacial. El uso de protocolos de inmunofluorescencia que facilitan la visualización del tejido puede mejorar aún más las capacidades de perfil espacial de estas tecnologías.
La tecnología de Spatial Omics en la que nos centramos para el desarrollo de este método consiste en ensayos de proteómica espacial y transcriptómica donde los oligonucleótidos se unen a anticuerpos o sondas de ARN a través de un enlace fotodivisible sensible a los rayos UV. Los portaobjetos histológicos se etiquetan con estos anticuerpos o sondas oligoconjugados y luego se obtienen imágenes en la plataforma de perfiles espaciales. A continuación, se seleccionan ROI de diferentes tamaños y formas para la iluminación, y los oligonucleótidos fotohendidos se aspiran y se recogen en una placa de 96 pocillos. Los oligonucleótidos fotohendidos están preparados para ser cuantificados con el sistema Nanostring nCounter o Next Generation Sequencing (NGS)2,3 (Figura 1)4,5.
Las distribuciones celulares varían dentro de los tejidos, y la capacidad de caracterizar ubicaciones específicas de células utilizando marcadores seleccionados y diferentes tamaños de ROI es de gran importancia para comprender completamente el entorno del tejido e identificar características específicas. En la tecnología Spatial Omics mencionada aquí, el protocolo de visualización estándar utiliza anticuerpos directamente conjugados y es un protocolo manual. Los marcadores estándar para distinguir entre tumor y estroma son pancitoqueratina (panCK) y CD456,7, pero se necesitan marcadores adicionales para dirigirse a poblaciones celulares específicas de interés. Además, el uso de anticuerpos fluorescentes directamente conjugados carece de amplificación, lo que limita la selección de anticuerpos a marcadores abundantes. Además, los ensayos manuales están sujetos a una mayor variabilidad que los flujos de trabajo automatizados8. Por lo tanto, es deseable tener un protocolo de visualización personalizable, automatizado y amplificado para la selección del ROI.
Aquí, el estudio demuestra que, para los ensayos de proteómica espacial, la tecnología TSA se puede utilizar para protocolos de visualización en una plataforma automatizada, lo que resulta en un ensayo más específico y estandarizado. Además, los ensayos basados en TSA permiten el uso de marcadores de baja expresión, lo que aumenta el rango de objetivos que se pueden seleccionar para la visualización. Se desarrolló un ensayo 3-plex para panCK, FAP y Antibody X utilizando una plataforma automatizada donde se usaron panCK y FAP para diferenciar entre tumor y estroma, respectivamente. El anticuerpo X es una proteína estromal que se encuentra con frecuencia en los tumores, pero su biología y su impacto en la inmunidad antitumoral no se comprenden completamente. La caracterización de la textura inmune en áreas ricas en anticuerpos X puede dilucidar su papel en la inmunidad antitumoral y la respuesta terapéutica, así como su potencial como diana farmacológica.
Si bien los paneles de visualización TSA automatizados personalizados demostraron ser exitosos para los ensayos de proteómica espacial, no se pudo confirmar la aplicación de estos ensayos para ensayos de transcriptómica espacial. Esto se debe probablemente a los reactivos y al protocolo utilizado para los protocolos de visualización automatizada, que parecen comprometer la integridad del ARN. Reconocer que un protocolo de etiquetado automatizado para marcadores de visualización se puede utilizar para ensayos de proteómica espacial, pero no para ensayos de transcriptómica espacial, proporciona una guía importante sobre los diseños de ensayos de tecnología Spatial Omics.
Además, el estudio demuestra que el ensayo de transcriptómica espacial se puede utilizar para perfilar objetivos en regiones tan pequeñas como 50 μm de diámetro, o aproximadamente 15 células. Se seleccionaron dos ROI de diferentes tamaños para probar la capacidad del ensayo para detectar también transcripciones en ROI pequeños. Para cada región de interés, se recolectaron oligos correspondientes a 1.800 objetivos de ARNm y se convirtieron en bibliotecas de acuerdo con el protocolo de la plataforma de perfiles espaciales. Las bibliotecas se indexaron individualmente, posteriormente se agruparon y secuenciaron. Esto permitió evaluar tanto la eficiencia de la agrupación como la capacidad de identificar poblaciones celulares específicas en pequeños ROI.
Este documento muestra que para los ensayos de proteómica espacial, se puede utilizar un protocolo automatizado para guiar la selección del ROI en marcadores específicos de interés para dirigirse selectivamente a la interrogación de áreas de tejido relevantes y caracterizar el entorno espacial del tejido. Además, demostramos que se pueden usar ROI más pequeños para ensayos transcriptómicos espaciales para detectar y caracterizar poblaciones celulares específicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hasta la fecha, los anticuerpos fluorescentes directamente conjugados en un protocolo manual se utilizan más comúnmente como paneles de visualización para ensayos de proteómica espacial o transcriptómica espacial 9,10. Sin embargo, el uso de anticuerpos fluorescentes directamente conjugados puede ser un desafío para los marcadores menos abundantes, lo que limita la selección de anticuerpos adecuados. Este protocolo muestra que el etiquetado de marcadores d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen a Thomas Wu por procesar archivos NGS. Agradecemos a James Ziai por las discusiones de resultados y la revisión del manuscrito y a Meredith Triplet y Rachel Taylor por la revisión interna del manuscrito.
Materials
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
Riferimenti
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