Détermination de la toxicité du rayonnement UV et des produits chimiques sur les cellules épithéliales cornéennes humaines primaires et immortalisées
Summary
Cet article décrit les procédures utilisées pour évaluer la toxicité du rayonnement UV et des toxines chimiques sur une lignée cellulaire primaire et immortalisée.
Abstract
Cet article décrit les méthodes de mesure de la toxicité du rayonnement ultraviolet (UV) et des toxines oculaires sur des cultures de cellules épithéliales cornéennes humaines primaires (CSHCp) et immortalisées (CSHCi). Les cellules ont été exposées au rayonnement UV et à des doses toxiques de chlorure de benzalkonium (BAK), de peroxyde d’hydrogène (H2O2) et de dodécylsulfate de sodium (SDS). L’activité métabolique a été mesurée à l’aide d’un test métabolique. La libération de cytokines inflammatoires a été mesurée à l’aide d’un test multiplex interleukine (IL)-1β, IL-6, IL-8 et facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), et la viabilité des cellules a été évaluée à l’aide de colorants fluorescents.
Les effets néfastes des UV sur l’activité métabolique cellulaire et la libération de cytokines se sont produits à 5 minutes d’exposition aux UV pour l’HCi et à 20 minutes pour les HCECp. Des pourcentages similaires de baisse de l’activité métabolique de l’iHCEC et du pHCEC se sont produits après l’exposition au BAK, H2O2 ou SDS, et les changements les plus significatifs dans la libération de cytokines se sont produits pour l’IL-6 et l’IL-8. La microscopie des cellules exposées à des CSHCi et aux CSHCp Baka a montré la mort cellulaire à 0,005 % d’exposition au BAK, bien que le degré de coloration à l’éthidium soit plus élevé dans les CSEi que dans les CSHCp. En utilisant de multiples méthodes d’évaluation des effets toxiques à l’aide de la microscopie, des évaluations de l’activité métabolique et de la production de cytokines, la toxicité du rayonnement UV et des toxines chimiques a pu être déterminée pour les lignées cellulaires primaires et immortalisées.
Introduction
Des études toxicologiques in vitro sont effectuées pour prédire les effets toxiques des produits chimiques et d’autres agents qui peuvent causer des dommages aux cellules. Dans l’évaluation de la toxicité pour la cornée, les cellules épithéliales cornéennes humaines (CSHC) ont été utilisées dans des modèles pour évaluer ces effets 1,2,3,4. Ces modèles évaluent généralement les effets physiologiques tels que les changements dans l’activité métabolique de la cellule, la prolifération cellulaire et d’autres fonctions cellulaires telles que la production et la libération de cytokines inflammatoires. Pour ces études toxicologiques, des cellules provenant de diverses sources ont été sélectionnées pour évaluer les effets nocifs des produits chimiques et du rayonnement UV sur les HCEC 2,3. Les lignées de CSHCp sont disponibles auprès des entreprises qui fournissent ces cellules à partir de tissus de donneurs d’adultes. Les cellules primaires peuvent être traitées avec de la dispase et grattées doucement de la cornée pour la culture5. Les cellules sont ensuite testées pour les virus et la contamination, puis expédiées cryoconservées dans 10% de diméthylsulfoxyde.
L’avantage des lignées cellulaires primaires est que les cellules sont génétiquement identiques aux cellules du donneur. C’est idéal, car un modèle in vitro devrait imiter le tissu in vivo autant que possible. L’inconvénient des lignées cellulaires primaires est qu’elles ont un nombre limité de divisions ou de passages cellulaires6. Le nombre limité de cellules disponibles limite le nombre d’expériences qui peuvent être menées avec une seule culture primaire, ce qui augmente le coût des expériences.
Des lignées cellulaires immortalisées ont également été utilisées dans des modèles de toxicité de culture cellulaire. Cependant, contrairement à la lignée cellulaire primaire obtenue à partir de tissus in vivo, la lignée cellulaire immortalisée a été génétiquement modifiée. Les cellules immortalisées sont créées en incorporant les gènes d’un virus dans l’ADN des cellules primaires 6,7,8. Les cellules avec une incorporation réussie de gènes viraux sont sélectionnées pour la lignée cellulaire immortalisée. L’avantage de l’immortalisation est qu’elle permet une prolifération rapide indéfinie, fournissant un nombre illimité de cellules pour effectuer plusieurs expériences en utilisant la même lignée cellulaire. Cela permet une cohérence entre les expériences et réduit les coûts.
En plus des changements dans les gènes qui limitaient la prolifération cellulaire, des changements dans l’expression des gènes de fonctionnalité critique pourraient également se produire9. Par conséquent, l’inconvénient de l’utilisation de cellules immortalisées est qu’elles peuvent ne plus représenter les cellules in vivo d’origine en termes de réponse à divers stimuli externes10. Les comparaisons ont consisté à observer les effets toxiques des produits chimiques sur les kératocytes cornéens humains primaires et immortalisés11, ainsi que sur les HCEC immortalisés et les cellules primaires épithéliales cornéennes de lapin12. La comparaison entre les effets des toxines sur les kératocytes humains primaires et les kératocytes immortalisés n’a montré aucune différence significative11. À l’aide des méthodes décrites dans cet article, l’efficacité de ces essais pour évaluer la toxicité du rayonnement UV et des toxines oculaires sur les HCECs et les CSCEi sera déterminée.
Trois toxines oculaires couramment utilisées dans les essais in vitro ont été sélectionnées : BAK,H2O2et SDS. BAK est un conservateur cationique couramment utilisé dans les solutions ophtalmiques 13,14,H2O2est couramment utilisé pour désinfecter les lentilles de contact 15, et SDS est un tensioactif anionique présent dans les détergents et shampooings 14. À l’instar des toxines oculaires, les rayons UV peuvent également causer des dommages importants aux HCEC3. De plus, une surexposition aux UV peut provoquer une affection oculaire connue sous le nom de photokératite caractérisée par des symptômes de larmoiement, une sensibilité à la lumière et une sensation de granularité16.
Il existe un nombre illimité de cultures cellulaires primaires qui peuvent être utilisées et diverses lignées cellulaires immortalisées qui ont été développées. Par conséquent, une étude a été entreprise pour comparer les HCEC primaires à une lignée de HCEC immortalisée afin de déterminer les similitudes et les différences entre les modèles qui incorporent ces types de cellules.
Cette étude a utilisé la microscopie pour évaluer les différences possibles entre les CSEp et les CSEi sur la réponse physiologique des cellules aux UV et aux toxines. Les effets du rayonnement UV et des produits chimiques sur l’activité métabolique cellulaire et la libération de cytokines inflammatoires pour les deux lignées cellulaires ont également été évalués. L’importance de déterminer les différences entre les deux lignées cellulaires est de comprendre l’utilisation optimale de ces lignées cellulaires pour évaluer: 1) l’effet du rayonnement UV sur les cellules, 2) les effets des toxines sur les cellules et 3) les changements qui en résultent sur le métabolisme, la viabilité cellulaire et la libération de cytokines cellulaires pour les études futures.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les différences potentielles dans l’utilisation de deux types de HCEC ont été évaluées. Les cellules ont été placées dans le même milieu (HOEM) à des concentrations identiques de cellules, puis exposées à de courtes et longues périodes de rayonnement UV et à trois toxines oculaires. Les doses de rayonnement UV et de produits chimiques ont été sélectionnées en fonction de leurs effets physiologiques, qui étaient suffisamment dommageables pour les cellules pour produire des réponses intermédiaires po…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs n’ont reçu aucun financement pour ce travail.
Materials
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 – 700 nm (for assay 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
| Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
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