Определение токсичности УФ-излучения и химических веществ на первичных и иммортализированных эпителиальных клетках роговицы человека
Summary
В этой статье описываются процедуры, используемые для оценки токсичности УФ-излучения и химических токсинов на первичной и иммортализированной клеточной линии.
Abstract
В данной статье описаны методы измерения токсичности ультрафиолетового (УФ) излучения и глазных токсинов на первичных (pHCEC) и иммортализированных (iHCEC) культурах эпителиальных клеток роговицы человека. Клетки подвергались воздействию ультрафиолетового излучения и токсических доз хлорида бензалкония (BAK), перекиси водорода (H2O2) и додецилсульфата натрия (SDS). Метаболическую активность измеряли с помощью метаболического анализа. Высвобождение воспалительных цитокинов измеряли с помощью мультиплексного интерлейкина (IL)-1β, IL-6, IL-8 и анализа фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α), а жизнеспособность клеток оценивали с использованием флуоресцентных красителей.
Повреждающее действие ультрафиолета на метаболическую активность клеток и высвобождение цитокинов происходило через 5 минут воздействия ультрафиолета для iHCEC и 20 минут для pHCEC. Аналогичное процентное снижение метаболической активности iHCEC и pHCEC произошло после воздействия BAK, H2O2или SDS, и наиболее значительные изменения в высвобождении цитокинов произошли для IL-6 и IL-8. Микроскопия флуоресцентно окрашенных клеток, подвергшихся воздействию iHCEC и pHCEC BAK, показала гибель клеток при воздействии BAK 0,005%, хотя степень окрашивания этидия была выше в iHCEC, чем pHCEC. Используя несколько методов оценки токсических эффектов с помощью микроскопии, оценки метаболической активности и продукции цитокинов, токсичность ультрафиолетового излучения и химических токсинов может быть определена как для первичных, так и для иммортализированных клеточных линий.
Introduction
Токсикологические исследования in vitro проводятся для прогнозирования токсического воздействия химических веществ и других агентов, которые могут вызвать повреждение клеток. При оценке токсичности для роговицы эпителиальные клетки роговицы человека (ГЦС) использовались в моделях для оценки этих эффектов 1,2,3,4. Эти модели обычно оценивают физиологические эффекты, такие как изменения метаболической активности клетки, пролиферация клеток и другие функции клеток, такие как производство и высвобождение воспалительных цитокинов. Для этих токсикологических исследований были отобраны клетки из различных источников для оценки повреждающего воздействия химических веществ и ультрафиолетового излучения на HCECs 2,3. Линии pHCEC доступны у компаний, которые предоставляют эти клетки из донорских тканей взрослых. Первичные клетки можно обработать диспазой и аккуратно соскоблить роговицу для посева5. Затем клетки проверяют на наличие вирусов и загрязнения, а затем отправляют криоконсервированными в 10% диметилсульфоксид.
Преимущество первичных клеточных линий заключается в том, что клетки генетически идентичны клеткам донора. Это идеально, так как модель in vitro должна максимально имитировать ткань in vivo . Недостатком первичных клеточных линий является то, что они имеют ограниченное количество клеточных делений или пассажей6. Ограниченное количество доступных клеток ограничивает количество экспериментов, которые могут быть проведены с одной первичной культурой, увеличивая стоимость экспериментов.
Иммортализированные клеточные линии также использовались в моделях токсичности клеточных культур. Однако, в отличие от первичной клеточной линии, полученной из ткани in vivo, иммортализированная клеточная линия была генетически изменена. Иммортализированные клетки создаются путем включения генов вируса в ДНК первичных клеток 6,7,8. Клетки с успешным включением вирусных генов отбираются для иммортализированной клеточной линии. Преимущество иммортализации заключается в том, что она допускает неограниченную быструю пролиферацию, предоставляя неограниченное количество клеток для проведения нескольких экспериментов с использованием одной и той же клеточной линии. Это обеспечивает согласованность между экспериментами и снижает стоимость.
В дополнение к изменениям в генах, которые ограничивали пролиферацию клеток, также могут происходить изменения в экспрессии генов критической функциональности9. Таким образом, недостатком использования иммортализированных клеток является то, что они могут больше не представлять исходные клетки in vivo с точки зрения их реакции на различные внешние раздражители10. Сравнения включали наблюдение токсического воздействия химических веществ на первичные и иммортализированные кератоциты роговицычеловека 11, а также на иммортализированные ГХЕК и первичные эпителиальные клеткироговицы кроликов 12. Сравнение воздействия токсинов на первичные кератоциты человека и иммортализированные кератоциты не показало существенных различий11. Используя методы, подробно описанные в этой статье, будет определена эффективность этих анализов для оценки токсичности УФ-излучения и глазных токсинов на pHCEC и iHCEC.
Были выбраны три глазных токсина, обычно используемых в анализах in vitro: BAK, H2 O2 и SDS. BAK представляет собой катионный консервант, обычно используемый в офтальмологических растворах 13,14,H 2 O2 обычно используется для дезинфекции контактных линз 15, а SDS представляет собой анионное поверхностно-активное вещество, содержащееся в моющих средствах и шампунях 14. Подобно глазным токсинам, УФ-излучение также может нанести значительный ущерб HCEC3. Кроме того, чрезмерное воздействие ультрафиолета может вызвать глазное заболевание, известное как фотокератит, характеризующееся симптомами слезотечения, светочувствительности и ощущения зернистости16.
Существует неограниченное количество первичных клеточных культур, которые могут быть использованы, и различные иммортализированные клеточные линии, которые были разработаны. Поэтому было проведено исследование для сравнения первичных HCEC с иммортализированной линией HCEC, чтобы определить сходства и различия между моделями, которые включают эти типы клеток.
В этом исследовании использовалась микроскопия для оценки возможных различий между pHCEC и iHCEC в физиологическом ответе клеток на ультрафиолетовое излучение и токсины. Также оценивалось влияние ультрафиолетового излучения и химических веществ на метаболическую активность клеток и высвобождение воспалительных цитокинов для двух клеточных линий. Важность определения различий между двумя клеточными линиями заключается в понимании оптимального использования этих клеточных линий для оценки: 1) влияния ультрафиолетового излучения на клетки, 2) воздействия токсинов на клетки и 3) результирующих изменений в метаболизме, жизнеспособности клеток и высвобождении клеточных цитокинов для будущих исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Были оценены потенциальные различия в использовании двух типов HCEC. Клетки помещали в одну и ту же среду (HOEM) при одинаковых концентрациях клеток, а затем подвергали краткосрочному и длительному воздействию ультрафиолетового излучения и трех глазных токсинов. Дозы ультрафиолетового из…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы не получили финансирования для этой работы.
Materials
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 – 700 nm (for assay 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
| Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
Riferimenti
- McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
- Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).
- Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells. Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).
- Hakkarainen, J. J., et al. Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells. International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).
- Spurr, S. J., Gipson, I. K. Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).
- Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).
- Araki-Sasaki, K., et al. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
- Griffith, M., et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).
- Toouli, C. D., et al. Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit. Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing. Altex. 21 (3), 129-134 (2004).
- Huhtala, A., et al. Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).
- Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits. Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).
- Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens. Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).
- Hughes, R., Kilvington, S. Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).
- Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea. Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).
- Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation. Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).
- Tong, Y., et al. Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage. Cell Death & Disease. 6, 1640 (2015).
- Muller, P. A., Vousden, K. H. p53 mutations in cancer. Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).
- Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer. Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).
- Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells. Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).
- Xie, F., et al. Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK. Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).
- Mallet, J. D., Rochette, P. J. Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea. Photochemical & Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).
- Cejkova, J., Cejka, C. The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries. Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).
- Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. Photoprotection: a review of the current and future technologies. Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).
- Svobodova, A. R., et al. DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light. Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).
- Kennedy, M., et al. Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).
- Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells. Respiratory Research. 7, 132 (2006).
- Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).
