Questo articolo descrive le procedure utilizzate per valutare la tossicità delle radiazioni UV e delle tossine chimiche su una linea cellulare primaria e immortalata.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Determinazione della tossicità delle radiazioni UV e delle sostanze chimiche sulle cellule epiteliali corneali umane primarie e immortalizzate
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo articolo descrive i metodi per misurare la tossicità delle radiazioni ultraviolette (UV) e delle tossine oculari su colture di cellule epiteliali corneali umane primarie (pHCEC) e immortalizzate (iHCEC). Le cellule sono state esposte a radiazioni UV e dosi tossiche di benzalconio cloruro (BAK), perossido di idrogeno(H 2 O2) e sodio dodecilsolfato (SDS). L'attività metabolica è stata misurata utilizzando un test metabolico. Il rilascio di citochine infiammatorie è stato misurato utilizzando un test multi-plex di interleuchina (IL)-1β, IL-6, IL-8 e fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) e le cellule sono state valutate per la vitalità utilizzando coloranti fluorescenti.
Gli effetti dannosi dei raggi UV sull'attività metabolica cellulare e sul rilascio di citochine si sono verificati a 5 minuti di esposizione ai raggi UV per iHCEC e 20 minuti per pHCEC. Simili cali percentuali nell'attività metabolica di iHCEC e pHCEC si sono verificati dopo l'esposizione a BAK, H 2 O2o SDS e i cambiamenti più significativi nel rilascio di citochine si sono verificati per IL-6 e IL-8. La microscopia delle cellule esposte a iHCEC e pHCEC BAK colorate con fluorescenza ha mostrato la morte cellulare con un'esposizione BAK dello 0,005%, sebbene il grado di colorazione dell'etidio fosse maggiore negli iHCEC rispetto ai pHCEC. Utilizzando molteplici metodi di valutazione degli effetti tossici mediante microscopia, valutazioni dell'attività metabolica e produzione di citochine, la tossicità delle radiazioni UV e delle tossine chimiche potrebbe essere determinata sia per le linee cellulari primarie che per quelle immortalate.
Introduzione
Gli studi tossicologici in vitro vengono eseguiti per prevedere gli effetti tossici di sostanze chimiche e altri agenti che possono causare danni alle cellule. Nella valutazione della tossicità per la cornea, le cellule epiteliali corneali umane (HCEC) sono state utilizzate in modelli per valutare questi effetti 1,2,3,4. Questi modelli valutano tipicamente gli effetti fisiologici come i cambiamenti nell'attività metabolica della cellula, la proliferazione cellulare e altre funzioni cellulari come la produzione e il rilascio di citoc....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Coltura di pHCEC e iHCEC
- Coltivare i pHCEC e gli iHCEC nel mezzo epiteliale oculare umano (HOEM) con i seguenti integratori: 6 mM di L-glutammina, 0,002% di integratore di terreni cellulari O (Tabella dei materiali), 1,0 μM di epinefrina, 0,4% di integratore di terreni cellulari P (Tabella dei materiali), 5 μg/mL di insulina rh, 5 μg/mL di apo-transferrina e 100 ng/mL di idrocortisone emisuccinato in palloni rivestiti di collagene-1 (18 mL in un matraccio di coltura da 75 cm2 ).
- Cambiare il mezzo nei palloni ogni 2-3 giorni rimuovendo il mezzo dopo che le cellule crescono fino a ~ 80% di confluenza. A....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Dimensioni della cella
Gli HCEC primari e immortalati sono stati visualizzati con tre coloranti fluorescenti, che riflettono tre diversi stadi di vitalità cellulare. Le cellule vive sono verdi (calceina-AM), le cellule morte sono rosse (omodimero di etidio-1) e le cellule apoptotiche sono gialle (colore regolato dal computer V-annessina per una migliore visualizzazione del segnale di fluorescenza). Le cellule vive contengono esterasi nel citoplasma cellulare e convertono calcein-AM in calceina. Le cel.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Sono state valutate le potenziali differenze nell'uso di due tipi di HCEC. Le cellule sono state collocate nello stesso mezzo (HOEM) a concentrazioni identiche di cellule e quindi esposte a brevi e lunghi periodi di radiazioni UV e tre tossine oculari. Le dosi di radiazioni UV e sostanze chimiche sono state selezionate in base ai loro effetti fisiologici, che erano abbastanza dannosi per le cellule da produrre risposte intermedie che potevano essere confrontate. I tempi di esposizione di 5 e 20 minuti per le radiazioni U.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
L'autore, Lyndon W. Jones, negli ultimi 3 anni, attraverso CORE, ha ricevuto supporto alla ricerca o onorari di conferenze dalle seguenti società: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J & J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage e Visioneering. Lyndon Jones è anche consulente e/o fa parte di un comitato consultivo per Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis e Ophtecs. Gli altri autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori non hanno ricevuto alcun finanziamento per questo lavoro.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 75 cm2 Flacone ventilato | Corning | 354485 | Questa è la piastra |
| 96 pozzetti | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Soluzione tampone colorante | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Microscopio Axiovert 100 con microscopio a scansione laser confocale Zeiss 510 sistema | Carl Zeiss Inc., Germania | ||
| Corning Piastre a 48 pozzetti | Corning | 354505 | Questo è il marchio BioCoat, rivestito di collagene |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Può leggere la fluorescenza da 280 a 700 nm (per il test 540/590) |
| Siero fetale bovino | Hycone | SH30396.03 | |
| vetrini coprioggetti con fondo in vetro | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Cellule epiteliali corneali umane umane | dell'Università di Ottawa | N/A | SV40-immortalizzate cellule epiteliali corneali umane dal Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) e sono state caratterizzate Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Equivalenti corneali umani funzionali costruiti da linee cellulari. Scienza. 1999;286:2169-72. |
| Epiteli Oculari Umani Terreni Metallici (HOEM) con i seguenti integratori: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro terreni base integrati con 6 mM di L-Glutammina, 0,002% EpiFactor O (supplemento di terreni cellulari O nell'articolo), 1,0 μ M Epinefrina, 0,4% EpiFattore P (integratore di terreni cellulari P nell'articolo), 5 μ g/mL rh Insulina, 5 μ g/mL di Apo-Transferrina e 100 ng/mL di idrocortisone emisuccinato in fiasche di coltura rivestite di Collagene-1 (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Vivo Morto di calcine ed etidio omodimero | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 strumento | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Pannello proinfiammatorio umano II (4-Plex) Saggio V-Plex | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillina Streptomicina | Gibco | 15140-122 | Concentrazione 100x, quindi aggiungere 1 mL a ogni 99 mL di terreno |
| Cellule epiteliali corneali primarie | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | |||
| TrypLE Express (soluzione di dissociazione cellulare) | Fisher Scientific | 12605036 |
Riferimenti
- McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
- Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
