UV Radyasyonu ve Kimyasallarının Primer ve Ölümsüzleştirilmiş İnsan Kornea Epitel Hücreleri Üzerindeki Toksisitesinin Belirlenmesi
Summary
Bu makalede, birincil ve ölümsüzleştirilmiş bir hücre hattında UV radyasyonunun ve kimyasal toksinlerin toksisitesini değerlendirmek için kullanılan prosedürler açıklanmaktadır.
Abstract
Bu makalede, primer (pHCEC) ve ölümsüzleştirilmiş (iHCEC) insan kornea epitel hücre kültürleri üzerinde ultraviyole (UV) radyasyon ve oküler toksinlerin toksisitesini ölçme yöntemleri açıklanmaktadır. Hücreler UV radyasyonuna ve toksik dozlarda benzalkonyum klorür (BAK), hidrojen peroksit (H2O2) ve sodyum dodesil sülfat (SDS) dozlarına maruz bırakıldı. Metabolik aktivite metabolik bir tahlil kullanılarak ölçüldü. İnflamatuar sitokinlerin salınımı multipleks interlökin (IL)-1β, IL-6, IL-8 ve tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α) testi kullanılarak ölçüldü ve hücreler floresan boyalar kullanılarak canlılık açısından değerlendirildi.
UV’nin hücre metabolik aktivitesi ve sitokin salınımı üzerindeki zararlı etkileri, iHCEC için 5 dakika UV maruziyetinde ve pHCEC için 20 dakika UV maruziyetinde meydana gelmiştir. İHCEC ve pHCEC’in metabolik aktivitesindeki benzer yüzde düşüşleri, BAK, H2O2veya SDS’ye maruz kaldıktan sonra meydana geldi ve sitokin salınımındaki en önemli değişiklikler IL-6 ve IL-8 için meydana geldi. Floresan olarak boyanmış iHCEC ve pHCEC BAK’a maruz kalan hücrelerin mikroskopisi,% 0.005 BAK maruziyetinde hücre ölümü gösterdi, ancak iHCEC’lerde etidyum boyama derecesi pHCEC’lerden daha büyüktü. Mikroskopi kullanarak toksik etkileri değerlendirmek, metabolik aktivitenin değerlendirilmesi ve sitokin üretimi için birçok yöntem kullanılarak, UV radyasyonunun ve kimyasal toksinlerin toksisitesi hem birincil hem de ölümsüzleştirilmiş hücre hatları için belirlenebilir.
Introduction
Hücrelere zarar verebilecek kimyasalların ve diğer ajanların toksik etkilerini tahmin etmek için in vitro toksikoloji çalışmaları yapılmaktadır. Korneaya toksisitenin değerlendirilmesinde, insan kornea epitel hücreleri (HCEC’ler) bu etkilerin değerlendirilmesi için modellerde kullanılmıştır 1,2,3,4. Bu modeller tipik olarak hücrenin metabolik aktivitesindeki değişiklikler, hücre proliferasyonu ve enflamatuar sitokinlerin üretimi ve salınımı gibi diğer hücre fonksiyonları gibi fizyolojik etkileri değerlendirir. Bu toksikoloji çalışmaları için, kimyasalların ve UV radyasyonunun HCEC’ler üzerindeki zararlı etkilerini değerlendirmek için çeşitli kaynaklardan hücreler seçilmiştir 2,3. pHCEC hatları, bu hücreleri yetişkinlerin donör dokularından sağlayan şirketlerden temin edilebilir. Birincil hücreler dispaz ile tedavi edilebilir ve kültür5 için korneadan nazikçe kazınabilir. Hücreler daha sonra virüsler ve kontaminasyon açısından test edilir ve daha sonra% 10 dimetil sülfoksit içinde kriyokorunmuş olarak gönderilir.
Birincil hücre hatlarının avantajı, hücrelerin genetik olarak donörün hücreleriyle aynı olmasıdır. Bu idealdir, çünkü in vitro bir model in vivo dokuyu mümkün olduğunca taklit etmelidir. Birincil hücre hatlarının dezavantajı, sınırlı sayıda hücre bölünmesine veya pasajına sahip olmalarıdır6. Mevcut sınırlı sayıda hücre, tek bir birincil kültürle yapılabilecek deney sayısını kısıtlar ve deneylerin maliyetini artırır.
Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları, hücre kültürü toksisite modellerinde de kullanılmıştır. Bununla birlikte, in vivo dokudan elde edilen birincil hücre hattının aksine, ölümsüzleştirilmiş hücre hattı genetik olarak değiştirilmiştir. Ölümsüzleştirilmiş hücreler, bir virüsün genlerinin birincil hücrelerin DNA’sına dahil edilmesiyle oluşturulur 6,7,8. Başarılı viral gen katılımına sahip hücreler, ölümsüzleştirilmiş hücre hattı için seçilir. Ölümsüzleştirmenin avantajı, sınırsız sayıda hücrenin aynı hücre hattını kullanarak birden fazla deney yapmasını sağlayarak sınırsız hızlı çoğalmaya izin vermesidir. Bu, deneyler arasında tutarlılık sağlar ve maliyeti azaltır.
Hücre proliferasyonunu sınırlayan genlerdeki değişikliklere ek olarak, kritik işlevselliğe sahip genlerin ekspresyonunda da değişiklikler meydana gelebilir9. Bu nedenle, ölümsüzleştirilmiş hücrelerin kullanılmasının dezavantajı, çeşitli dış uyaranlara tepkileri açısından orijinal in vivo hücreleri artık temsil edememeleridir10. Karşılaştırmalar, kimyasalların primer ve ölümsüzleştirilmiş insan kornea keratositleri11, ayrıca ölümsüzleştirilmiş HCEC’ler ve tavşan kornea epitelyal primer hücreleri12 üzerindeki toksik etkilerini gözlemlemeyi içermektedir. Toksinlerin primer insan keratositleri ile ölümsüzleştirilmiş keratositler üzerindeki etkileri arasındaki karşılaştırmada anlamlı bir fark görülmemiştir11. Bu makalede detaylandırılan yöntemler kullanılarak, UV radyasyonunun ve oküler toksinlerin pHCEC’ler ve iHCEC’ler üzerindeki toksisitesini değerlendirmek için bu testlerin etkinliği belirlenecektir.
İn vitro testlerde yaygın olarak kullanılan üç oküler toksin seçildi: BAK, H2,O2ve SDS. BAK, oftalmik çözeltilerde yaygın olarak kullanılan katyonik bir koruyucudur13,14, H2O2, kontakt lensleri dezenfekte etmek için yaygın olarak kullanılır15 ve SDS, deterjanlarda ve şampuanlarda bulunan anyonik bir yüzey aktif maddedir 14. Oküler toksinlere benzer şekilde, UV radyasyonu da HCEC’lerde önemli hasara neden olabilir3. Ek olarak, UV’ye aşırı maruz kalmak, yırtılma, ışık hassasiyeti ve kumluluk hissi belirtileri ile karakterize fotokeratit olarak bilinen bir oküler duruma neden olabilir16.
Kullanılabilecek sınırsız sayıda birincil hücre kültürü ve geliştirilmiş çeşitli ölümsüzleştirilmiş hücre hatları vardır. Bu nedenle, bu tip hücreleri içeren modeller arasındaki benzerlikleri ve farklılıkları belirlemek için birincil HCEC’leri ölümsüzleştirilmiş bir HCEC çizgisiyle karşılaştırmak için bir araştırma yapılmıştır.
Bu çalışmada, pHCEC’ler ve iHCEC’ler arasındaki UV ve toksinlere hücre fizyolojik yanıtı üzerindeki olası farklılıkları değerlendirmek için mikroskopi kullanılmıştır. UV radyasyonu ve kimyasallarının hücre metabolik aktivitesi ve iki hücre hattı için inflamatuar sitokin salınımı üzerindeki etkileri de değerlendirildi. İki hücre hattı arasındaki farklılıkları belirlemenin önemi, bu hücre hatlarının değerlendirmek için en uygun kullanımını anlamaktır: 1) UV radyasyonunun hücreler üzerindeki etkisi, 2) toksinlerin hücreler üzerindeki etkileri ve 3) gelecekteki çalışmalar için metabolizma, hücre canlılığı ve hücre sitokin salınımında ortaya çıkan değişiklikler.
Protocol
Representative Results
Discussion
İki tip HCEC’in kullanımındaki potansiyel farklılıklar değerlendirildi. Hücreler aynı ortama (HOEM) aynı hücre konsantrasyonlarında yerleştirildi ve daha sonra kısa ve uzun süreli UV radyasyonuna ve üç oküler toksine maruz bırakıldı. UV radyasyonu ve kimyasalların dozları, karşılaştırılabilecek ara tepkiler üretmek için hücrelere yeterince zarar veren fizyolojik etkilerine dayanarak seçildi. UV radyasyonu için 5 ve 20 dakika ve seçilen BAK (% 0.001), SDS (% 0.0025) ve H2O2(% 0….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar bu çalışma için herhangi bir fon almadılar.
Materials
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 – 700 nm (for assay 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
| Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
Riferimenti
- McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
- Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).
- Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells. Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).
- Hakkarainen, J. J., et al. Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells. International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).
- Spurr, S. J., Gipson, I. K. Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).
- Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).
- Araki-Sasaki, K., et al. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
- Griffith, M., et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).
- Toouli, C. D., et al. Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit. Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing. Altex. 21 (3), 129-134 (2004).
- Huhtala, A., et al. Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).
- Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits. Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).
- Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens. Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).
- Hughes, R., Kilvington, S. Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).
- Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea. Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).
- Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation. Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).
- Tong, Y., et al. Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage. Cell Death & Disease. 6, 1640 (2015).
- Muller, P. A., Vousden, K. H. p53 mutations in cancer. Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).
- Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer. Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).
- Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells. Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).
- Xie, F., et al. Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK. Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).
- Mallet, J. D., Rochette, P. J. Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea. Photochemical & Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).
- Cejkova, J., Cejka, C. The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries. Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).
- Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. Photoprotection: a review of the current and future technologies. Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).
- Svobodova, A. R., et al. DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light. Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).
- Kennedy, M., et al. Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).
- Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells. Respiratory Research. 7, 132 (2006).
- Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).
