Summary
Çok güçlü O9-1 nöral kret hücreleri ve değişen sertlikteki poliakrilamid hidrojeller kullanılarak in vitro mekanik sinyallerin incelenmesi için ayrıntılı adım adım protokoller burada açıklanmıştır.
Abstract
Nöral kret hücreleri (NCC'ler), çeşitli organ ve dokulara yol açan çok çeşitli hücre tiplerine göç ürebilen ve farklılaşabilen omurgalı embriyonik multipotent hücrelerdir. Doku sertliği, NCC farklılaşmasında kritik bir rol oynayan fiziksel bir işaret olan mekanik kuvvet üretir; ancak mekanizma belirsizliğini koruyor. Burada açıklanan yöntem, değişen sertlikteki poliakrilamid hidrojellerin optimize edilmiş üretimi, bu sertliğin doğru ölçümü ve vivo NCC'leri taklit eden bir NCC hattı olan O9-1 hücrelerindeki mekanik sinyallerin etkisinin değerlendirilmesi için ayrıntılı bilgi sağlar.
Hidrojel sertliği atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) kullanılarak ölçüldü ve buna bağlı olarak farklı sertlik seviyeleri belirtildi. Değişen sertlikte hidrojeller üzerinde kültürlenen O9-1 NCC'ler, mekanik sinyal değişikliklerinin neden olduğu çeşitli biyolojik etkilere işaret eden farklı hücre morfolojisi ve stres liflerinin gen ekspresyonunun farklı olduğunu göstermiştir. Dahası, bu, hidrojel sertliğinin değiştirilmesinin, jel sertliğini değiştirerek ve NCC'lerdeki moleküler ve genetik regülasyonu analiz ederek mekanik sinyali manipüle etmek için etkili bir in vitro sistemle sonuçlendiğini ortaya çıkarmıştır. Bu nedenle, bu in vitro sistem, NCC'lerde mekanik sinyalin rolünü ve kimyasal sinyallerle etkileşimini incelemek için güçlü bir araçtır, bu da araştırmacıların sinirsel tepe gelişimi ve hastalıklarının moleküler ve genetik mekanizmalarını daha iyi anlamalarına yardımcı olacaktır.
Introduction
Nöral kret hücreleri (NCC'ler), omurgalı embriyogenez sırasında çeşitli organ ve dokuların gelişimine katkıda bulunma ve göç etme yeteneğine sahip bir grup kök hücredir. NCC'ler, eksenel kökenlinin konumuna ve NCC1,2'ninyerel çevresel rehberliğine bağlı olarak duyusal nöronlar, kıkırdak, kemik, melanositler ve düz kas hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre tiplerine farklılık gösterilebilir. Çok çeşitli hücre tiplerine farklılaşma yeteneği ile, nöral kret (NC) gelişiminin herhangi bir aşamasında düzensizliğe neden olan genetik anormallikler çok sayıda doğumsal hastalığa yol açabilir2. Örneğin, NCC'lerin oluşumu, göçü ve gelişimi sırasındaki pertürbasyonlar, toplu olarak nörokristopatiler olarak bilinen gelişimsel bozukluklara yol açar1,3. Bu hastalıklar, Treacher Collins sendromu gibi NCC oluşumundaki başarısızlığa bağlı kraniyofasiyal defektlerden, melanom3,4,5,6'dagörüldüğü gibi NCC metastatik göçmen yeteneğine bağlı çeşitli kanserleringelişmesinekadar uzanır. Son birkaç on yılda, araştırmacılar NCC'lerin gelişim ve hastalıklardaki rolleri ve mekanizmaları hakkında dikkat çekici keşifler yaptılar, bulguların çoğu kimyasal sinyallere odaklandı7,8. Daha yakın zamanda, mekanik sinyallerin NCC gelişiminde kritik ama iyi anlaşılmamış bir rol oynadığı belirtilmiştir9,10.
NCC'lerin çevresel ipuçları, NCC farklılaşmanın çeşitli hücre türlerine düzenlenmesi de dahil olmak üzere gelişimleri sırasında kritik bir rol oynar. Çevresel ipuçları, örneğin, fiziksel ipuçları, işlevsel çeşitlendirme gibi önemli davranışları ve hücresel yanıtları etkiler. Mechanotransduction, hücrelerin çeşitli biyolojik süreçleri sürdürmek için bu ipuçlarını hissetmelerini ve yanıt vermelerini sağlar2. NCC'ler komşu hücreler ve hücre dışı matris (ECM) gibi farklı substratlarla çevrilidir, bu da homeostazı korumak ve kader belirleme, çoğalma ve kesmez yoluyla değişikliklere uyum sağlamak için mekanik uyaranlara yol açabilir11. Mechanotransduction, mekanik hücre dışı uyaranların duyusal bileşeninin meydana geldiği plazma zarında başlar ve hücre içi düzenleme ile sonuçlanır12. Plazma zarının bütünleşimleri, odak yapışmaları ve kavşakları, kesme kuvvetleri, stres ve çevredeki substratların sertliği gibi mekanik sinyalleri hücresel yanıtlar üretmek için kimyasal sinyallere röle eder12. Plazma membranından gelen kimyasal sinyallerin son hücresel düzenlemeye aktarılması, organizma için farklılaşma gibi hayati süreçleri sonuçlandırmak için farklı sinyal yolları aracılığıyla gerçekleştirilir.
Çeşitli çalışmalar, substrat sertliğinden mekanik sinyal vermenin hücre farklılaşmasında rol oynadığını ileri sürtünmektedir13,14. Örneğin, önceki çalışmalar, beyin dokusununkine benzer bir sertliğe sahip yumuşak substratlarda yetişen mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) nöronal hücre farklılaşmasına neden olduğunu göstermiştir15,16. Bununla birlikte, daha fazla MSC, kas sertliğini taklit eden 8-17 kPa substratlarında büyüdüğünde miyosit benzeri hücrelere farklılık sağlarken, MSC'ler sert substratlar üzerinde kültürlendiğinde osteoblast benzeri farklılaşma gözlenmiştir (25-40 kPa)15,16. Mekanotransdüksiyonun önemi, kanser, kardiyovasküler hastalıklar ve osteoporoz17 , 18,19dahil olmak üzere ciddi gelişimsel kusurlara ve hastalıklara yol açabilecek mekanik sinyal yollarındaki düzensizlikler ve anormallikler ile vurgulanır. Kanserlerde normal meme dokusu yumuşaktır ve meme kanseri riski artar Sert ve yoğun meme dokusunda, meme tümörlerine daha çok benzeyen bir ortam15. Bu bilgi birikimi ile, mekanik sinyalizasyonun NCC gelişimi üzerindeki etkileri, bir in vitro sistem aracılığıyla substrat sertliğinin basit manipülasyonu ile incelenebilir ve NC ile ilgili hastalığın ilerlemesinin ve etiyolojisinin temellerini anlamada daha fazla avantaj ve olasılık sağlar.
NCC'lerdeki mekanik sinyallerin etkisini incelemek için, daha önce yayınlanan yöntemlerin optimizasyonuna ve NCC'lerin farklı mekanik sinyallere verdiği yanıtların değerlendirilmesine dayanan NCC'ler için verimli bir in vitro sistem kurduk20,21. NCC'lerde mekanik sinyalizasyonun etkisinin farklı hidrojel sertliği hazırlanması ve değerlendirilmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bunu başarmak için, O9-1 NCC'ler sert ve yumuşak hidrojellere yanıt olarak etkileri ve değişiklikleri incelemek için NC modeli olarak kullanılır. O9-1 NCC'ler, 8.5. günde fare embriyosundan (E) izole edilmiş kararlı bir NC hücre hattıdır. O9-1 NCC'ler, tanımlanmış farklılaşma ortamı22'deçeşitli NC türevli hücre türlerine farklılaşabildiğinden, NCC'leri in vivo olarak taklit eder. NCC'lerin mekanik sinyallerini incelemek için, istenen sertliği elde etmek için çeşitli akrilamid ve bis-akrilamid çözelti konsantrasyonlarından ayarlanabilir elastikiyetli bir matris substratı imal edildi, biyolojik substrat sertliği20 , 21,23ile ilişkili. NCC'ler, özellikle O9-1 hücreleri için matris substrat koşullarını optimize etmek için, daha önce yayınlanan protokol20'dendeğişiklikler yapıldı. Bu protokolde yapılan bir değişiklik, kollajen I'deki hidrojelleri kuluçkaya yatırmaktı, bir gecede 50 mM HEPES yerine% 0.2 asetik asitle seyreltildi. Asetik asidin düşük pH'ı homojen bir dağılıma ve daha yüksek kollajen I bünyesine yol açar, böylece ECM proteininin daha düzgün bir şekilde bağlanmasına izin verir24. Ek olarak, hidrojelleri inkübatörde depolamadan önce, fosfat tampon salininde (PBS) sırasıyla% 10 ve% 5 konsantrasyonlarında at serumu ve fetal sığır serumu (FBS) kombinasyonu kullanılmıştır. At serumu, % 1025konsantrasyonda hücre çoğalmasını ve farklılaşmayı teşvik etme yeteneği nedeniyle FBS'ye ek bir takviye olarak kullanılmıştır.
Bu yöntemle, NCC'lerin büyümesi ve hayatta kalması için doğru bir in vitro ortam oluşturmak için ECM protein kaplaması (örneğin, Kollajen I) tarafından biyolojik bir ortam taklit edildi20,21. Hazırlanan hidrojellerin sertliği, elastik modül26'yıtasvir etmek için iyi bilinen bir teknik olan atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ile nicel olarak analiz edildi. Farklı sertlik seviyelerinin NCC'ler üzerindeki etkisini incelemek için, vahşi tip O9-1 hücreleri, substrat sertliğindeki değişikliklere yanıt olarak hücre yapışması ve morfolojilerindeki farklılıkları göstermek için filamentli aktilona (F-actin) karşı immünofluoresans (IF) lekelenmesi için hidrojeller üzerinde kültürlendi ve hazırlandı. Bu in vitro sistemi kullanan araştırmacılar, NCC'lerdeki mekanik sinyallemenin rollerini ve diğer kimyasal sinyallerle etkileşimini inceleyerek NCC'ler ve mekanik sinyaller arasındaki ilişkiyi daha derinlemesine anlayabilecekler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hidrojel hazırlama
NOT: Tüm adımlar, steriliteyi korumak için kullanılmadan önce etanol ve ultraviyole (UV) ile dezenfekte edilmiş bir hücre kültürü davlumbazında yapılmalıdır. Cımbız ve pipet gibi aletler etanol ile püskürtülmelidir. Tampon çözeltileri de steril filtrelenmelidir.
- Aminosilane kaplı cam kapakların hazırlanması
- İstediğiniz sayıda cam örtü parçasını bir laboratuvar mendilinin üzerine yerleştirin.
NOT: Kolayca kırılırken yeterli yedekleme kaynağı sağlamak için ek bir 3-4 kapak kılıfı hazırlayın. Cam kapakların farklı malzemeleri, hücre tohumlama ve ataşmanının farklı uyumluluğunu sağlayacaktır. Denemelere başlamadan önce hangi türün denemeye en uygun olduğunu belirlemek daha iyidir (bkz. Malzeme Tablosu). - Her kapak sıvısını alevden ileri geri geçirerek sterilize etmek için bir alkol yakıcı veya Bunsen brülörü kullanın (protein test deneyleri için 30 s). Her bir cam örtü kapağını soğuması için bir laboratuvar mendiline yerleştirin.
- Cam kapaklar soğutulduktan sonra, kaymayı önlemek için parafilm ile kaplı bir Petri kabına aktarın.
NOT: Kapaklar yeterince serin değilse, artık ısı parafilm'i kaymaların üzerine eriterek kullanılamaz hale getirir. - Kapakları sırasıyla 12 mm ve 25 mm coverlip için yaklaşık 200 μL ve 800 μL 0,1 M NaOH ile örtün ve 5 dakika bekletin. Ardından, 0,1 M NaOH'u aspire edin ve kapakların eşit bir film oluşturmak için 5 dakika daha havayla kurumasını bekleyin.
- Kapaklar kuruduktan sonra, pipet sırasıyla 12 mm ve 25 mm coverlips için yaklaşık 80 μL ve 150 μL 3-aminopropil triethoxysilane (APTS). Çözeltinin parafilme dökülmesini önlemeye dikkat edin. Çözeltinin 5 dakika oturmasına izin verin.
- Mümkün olduğunca fazla APTS'yi epire edin ve artık APTS'nin 5 dakika kurumasını bekleyin. Kapakları steril, deiyonize (DI) H 2 O'ya her seferinde5dakika boyunca üç kez batırarak iyice durulayın.
NOT: Cam kapaklar iyi durulanmazsa, artık APTS glutaraldehit ile istenmeyen reaksiyonlara neden olur, beyaz bir çökelti oluşmasına neden olur ve kullanılamaz kapakçıklara neden olur. - Kapakları, reaktif tarafı yukarı bakacak şekilde yeni bir Petri kabına taşıyın. Petri kabına kapakları tamamen kaplayacak ve kapakların 30 dakika oturmasını sağlayacak kadar% 0.5 glutaraldehit ekleyin.
- % 0.5 glutaraldehiti aspire edin ve kapakları bir kez DI H 2 O'da3dakika boyunca tekrar durulayın. Kapak reaktif tarafını kullanmadan önce tamamen havayla kuruması için bir laboratuvar mendiline veya temiz bir Petri kabına yerleştirin.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir; kapaklar kullanıma kadar steril DI H2O'ya yerleştirilmelidir.
- İstediğiniz sayıda cam örtü parçasını bir laboratuvar mendilinin üzerine yerleştirin.
- Silikon kapak örtülerinin hazırlanması
- Aminosilane kaplı kapaklarla aynı sayıda kapak kılıfını (adım 1.1.1) parafilm ile kaplı bir Petri kabına yerleştirin.
- Pipet 40 μL veya 150 μL için sırasıyla 12 mm ve 25 mm coverlips, diklorometilsilane (DCMS) kapak kapağının bir tarafına ve çözeltinin 5 dakika oturmasını sağlar.
- Kapak sapından kalan herhangi bir çözeltiyi epire edin, steril DI H2O'da bir kez 1 dakika yıkayın ve reaktif kapakları bir sonraki adıma geçmeden önce tamamen havayla kuruması için bir laboratuvar mendiline yerleştirin.
- Hidrojellerin hazırlanması
- Farklı sertliklerde 500 μL çözelti hazırlamak için akrilamid, bis-akrilamid ve DI H2O'yu 1,5 mL santrifüj tüpünde karıştırın (bkz. Tablo 1). Vortex çözeltisini iyice karıştırmak için 30 sn.
- Hızlı bir şekilde çalışarak, %10 amonyum persülfat çözeltisini (APS) ve tetrametrinediamin (TEMED) tüpe ekleyin ve çözeltileri karıştırmak için çözümleri tekrar girdaplayın.
NOT: Taze %10 APS hazırlayın ve hassas donma/çözülme döngüsü nedeniyle buzda bırakın veya tek kullanımlık aliquots içinde dondurun. - Pipet, çözeltinin yaklaşık 33 μL veya 100 μL'si, sırasıyla kurutulmuş 12 mm veya 25 mm aminosilane kaplı kapak örtülerine (bölüm 1.1) üzerine.
- Kavisli cımbız kullanarak, dcms ile işlenmiş kapak anahtarını hemen jel çözeltisinin üzerine yerleştirin ve işlenmiş taraf jel çözeltisine dokunur, böylece jel çözeltisini DCMS ile işlenmiş kapak ve aminosilane kaplı kapak arasında sandviç.
- Jel çözeltisinin 5-15 dakika polimerize olmasını sağlarken, tüpte kalan çözeltinin jel polimerizasyonunu aktif olarak takip edin.
- Jel polimerize edildikten sonra, DCMS ile işlenmiş kapak sapını kavisli cımbız veya jiletle ayırın ve jeli orijinal aminosilane kaplı kapak kapağına bağlı bırakın.
- Jelin kurumasını önlemek için, kapak sapını önceden belirlenmiş 4 kuyu/24 kuyu ve 6 kuyulu bir plakaya yerleştirin ve jelin kurumasını önlemek için sırasıyla 12 mm ve25mm kapaklar için 500 μL ve 2 mL steril PBS veya DI H 2 O ile kaplanmış.
- Tüm kapaklar için 1.3.4-1.3.7 adımlarını yineleyin.
- Fazla akrilamid çözeltisini çıkarmak için hidrojelleri steril PBS veya DI H2O'ya 30 dakika batırın. Hidrojelleri steril PBS veya DI H 2 O'da4°C'de depolayın.
- Karanlık bir odada, 50 mM 2-[4) 2,5 mL karıştırarak sülfosuçinidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) heksanat (sulfo-SANPAH) karışımını hazırlayın -(2-hidroksyetil) piperazin-1-yl] etanesülfonic asit (HEPES) (pH=8.5) ile 50 μg/mL sülfo-SANPAH'ın 25 μL'si konik tüpte, ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarılır. Kullanmadan önce çözeltiyi iyice karıştırmak için bir pipet kullanın.
NOT: Yaklaşık yirmi beş adet 12 mm hidrojel veya beş adet 25 mm hidrojel için 2,5 mL sülfo-SANPAH çözeltisi hacmi yeterlidir. - Kuyu plakasından PBS veya DI H2O'ya aspire edin. Jeli örtmek için sırasıyla 12 mm ve 25 mm kapaklar için yaklaşık 100 μL veya 500 μL sülfo-SANPAH çözeltisi (adım 1.3.10) ekleyin. Çözeltinin jeli tamamen kapladığından emin olun.
NOT: Güçlü kuvvetin hidrojelleri parçalamasını veya rahatsız etmesini önlemek için vakum emme mukavemetini ayarlayın. - Çözeltili jelleri, sülfo-SANPAH ile reaksiyona sokan UV ışığının herhangi bir parazitini en aza indirmek için 10 dakika boyunca 15 W, 365 nm UV ışığın altına yerleştirin.
- Çözeltinin mümkün olduğunca çoğunu toplamak için plakayı yatırarak fazla sülfo-SANPAH'ı aspire edin. Jeli 50 mM HEPES ile iki ila üç kez yıkayın.
- Hidrojel içeren her kuyuya% 0.2 asetik asitle seyrelttiğim 50 mg / mL kollajen sırasıyla 12 mm ve 25 mm jeller için 500 μL ve 2 mL ekleyin. Jellerin 37 °C, %5 CO2 inkübatörde gece boyunca kuluçkaya yatmasına izin verin.
NOT: Kollajen I'in homojen dağılımını ve bağlanmasını teşvik etmek için kollajen I'i 50 mM HEPES yerine% 0.2 asetik asitte seyreltin. - Kollajen I'i epire edin ve her yıkamada 5 dakika boyunca fazla kollajen I'i çıkarmak için jelleri steril PBS ile üç kez yıkayın. PBS'deki hidrojelleri % 10 at serumu, 37 ° C'de 2 h için% 5 FBS, % 5 CO2 inkübatörü ile kuluçkaya yatırın.
NOT: %10 at serumunun eklenmesi, önceki yayında olduğu gibi sadece FBS kullanmaya kıyasla daha yüksek çoğalma sağlar. - Ortamı aspire edin. Her kuyuya %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin (P/S) ile 500 mL steril filtreli Dulbecco Modifiye Kartal Orta (DMEM) ekleyin. Jelleri hücre kültürüne hazır olana kadar 37 °C,%5 CO 2 inkübatörde saklayın.
- Hazır olduktan sonra kültür yemeklerinde bazal ortamda yaklaşık 1,5 ×10 4 O9-1 hücre/cm2 tabaklayın. Hücreleri 37 °C'de bir inkübatörde 2 gün kuluçkaya yatır, %5 CO2. Hücrelerin jellere yeterince bağlı olduğundan ve analiz için toplanmadan önce hücre sayısının yeterli olduğundan emin olmak için hücrelerin izleniyor.
NOT: O9-1 hücrelerinin20'ninkurtarılması, geçirilmesi ve toplanması adımları için daha önce yayımlanmİş protokole bakın. - Hidrojellerin daha fazla analizi için bölüm 2, 3 veya 4'e geçin.
2. AFM ile sertliğin nicel analizi
- AFM sistem bilgisayarını ve ardından AFM denetleyicisini başlatın (Bkz. Malzeme Tablosu).
- AFM cantilever'i AFM prob tutucusuna monte edin. Yamyamın sonuna monte edilmiş 0,5 μm silika boncuklu küresel bir dokunsal kapitilat kullanın (küresel boncuklu dokunsal).
NOT: 10 kPa, 20 kPa ve 40 kPa gibi daha sert hidrojeller için, 0,24 N/m yay sabiti ile daha sert bir prob kullanılmıştır. 0,5 kPa ve 1 kPa gibi daha yumuşak hidrojeller için 0,059 N/m yay sabiti ile daha yumuşak bir prob kullanılmıştır. - AFM yazılımını kişi modu altında ayarlayın.
- Silikon gofreti AFM örnek aşamasına monte ederek kuvvet eğrilerini toplayın, ancak silikon substrata dokunmak için düğmeye tıklayarak kuvvet eğrilerini üretin.
- Kalibrasyon için yukarıdaki kuvvet eğrilerini (2,4) kullanın, termal ayar koşulu altında kantileverin ortalama yay sabitini elde etmek için kontrol yazılımındaki Kalibrasyon'a tıklayın ve kalibre edilmiş değerleri kontrol yazılımına kaydedin.
- Kapak kapağını ekli hidrojel ile 60 mm Petri kabına AFM tarama aşamasına yerleştirerek numuneleri monte edin. Jelin kurumasını önlemek için ölçümler yapmadan önce yemeğe 3 mL PBS ekleyin.
- Ölçümü başlatmak için AFM'yi temas modunda (akışkan) çalışacak şekilde ayarlayın. Jel örneğine sürekli dokunmak ve kaldırmak için küresel belayı devreye alın.
- Ayar setini, sapma eşiği 10 nm'de olacak şekilde ayarlayın. Sondanın rampa boyutunu 10 μm'de tutun. Ardından, kuvvet eğrilerini adım 2.4'te olduğu gibi kaydedin.
- Hidrojel yüzeyinde en az 3 ila 10 farklı noktadan en az 20 kuvvet eğrisi elde edin.
- AFM görüntüleme ve analiz yazılımıyla her nokta için ortalama Young'ın ~20 kuvvet eğrisi modüllerini hesaplayın. Uzatma rampa kuvveti eğrileri ve doğrusal bir model (küresel) kullanın. Son sertliği elde etmek için her numune için tüm noktaların ortalamasını hesaplayın.
NOT: Young'ın modülü ve ilgili verileri(yani standart sapmalar) otomatik olarak elektronik tablo olarak kaydedilir. - Tüm örnekler için 2.6-2.10 adımlarını yineleyin.
3. İmmünoresans lekeleme yoluyla sertliğin moleküler analizi
- Doğrudan plakaya yetiştirilen hücrelerden gelen yanlış sinyalleri en aza indirmek için kapak kapağını yeni bir tabağa taşımak için cımbız kullanın. Ölü hücreleri ve kalan kültür ortamlarını çıkarmak için hücreleri 500 μL steril PBS ile üç kez yıkayın.
- Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bozulmadan 500 μL% 4 paraformaldehit (PFA) kullanarak sabitlayın. Ardından, her biri 2 dakika boyunca 500 μL PBS / kuyu kullanarak hücreleri üç kez yeniden yıkayın.
NOT: Prosedürel bir durak için 4 °C'de saklayın. - Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca % 0,1 Triton X-100'ün 500 μL'si ile tedavi edin. Ardından, hücreleri 500 μL PBS / kuyu ile üç kez yıkayın.
- Hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kuyu başına %10 eşek serumu (PBS'de seyreltilmiş ve%0,1 Ara 20) ile 250 μL ile tıkayın.
- Hücreleri oda sıcaklığında 2 saat boyunca veya 4 °C'de gece boyunca 250 μL birincil antikorla kuluçkaya yatırın. Ardından, hücreleri her biri 5 dakika boyunca 500 μL PBS / kuyu ile üç kez yıkayın.
NOT: Bu deneyde Anti-Vinculin (Vcl) (1:250) ve anti-AP2 alfa (1:250) kullanılmış ve %10 eşek serumunda seyreltilmiştir. - Hücreleri, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 10 eşek serumunun 250 μL'sinde 1:400 seyreltmede F-akrin lekeleme için kullanılan ikincil antikorlar ve / veya phalloidin ile kuluçkaya yatırın. Ardından, hücreleri PBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
NOT: 568 nm Phalloidin, 488 nm veya 647 nm sekonder antikorlarla veya kendi başına ortaklaşa kuluçkalanabilir. - Hücreleri 4′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI, 1:1000 seyreltme) ile 250 μL PBS'de 10 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından 2 dakika boyunca pbs'nin son bir yıkaması.
- Her kuyuya 3-4 damla montaj ortamı ekleyin. Montaj ortamının düzgün ayarlandığından emin olmak için görüntülemeden önce en az 2 saat ayarlamak için numuneleri 4 °C'de saklayın.
- Floresan mikroskopla hidrojel numune başına en az 3 rastgele karenin görüntülerini yakalayın, bireysel ve birleştirilmiş kanallar üretin.
4. Nicel gerçek zamanlı PCR (RT-qPCR)
- Hücre plakasına bağlı hücrelerden istenmeyen RNA'yı en aza indirmek için RNA toplama için yapışık hücrelere sahip hidrojelleri yeni bir tabağa aktarın. Ölü hücreleri ve kültür ortamını çıkarmak için hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
- Bir RNA çıkarma kiti kullanarak toplam mRNA'yı çıkarın. Üreticinin talimatlarını izleyerek ters transkripsiyon süpermiksi kullanarak RNA'dan cDNA'ya ters transkripsiyon gerçekleştirin.
- Rt-qPCR'yi Vcl için astarlarla tercih ettiği sertlik göstergesi olarak gerçekleştirin ve 2-ΔΔCT yöntemini kullanarak analiz edin.
NOT: Vcl'nin astar dizisi: İleri 5' GCTTCAGTCAGACCCCACTCG 3'; ters 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AFM ve Hertz modeli ile hidrojel hazırlama ve sertlik değerlendirmesi
Burada akrilamid ve bis-akrilamid oranını düzenleyerek değişen sertlikte poliakrilamid hidrojeller üretmek için ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır. Bununla birlikte, poliakrilamid hidrojeller ECM proteinlerinin eksikliği nedeniyle hücrelerin yapıştırılmasına hazır değildir. Böylece, bir bağlayıcı olarak hareket eden sulfo-SANPAH, UV aktivasyonundan sonra sülfo-SANPAH'taki N-hidroksisuçinid ester yoluyla ECM proteinlerinin yüzeylerine yapıştırılmasını sağlamak için ecm proteinlerinin birincil aminleri ile birlikte hidrojellere bağlanır ve reaksiyona girer. Kollajen tipi I, O9-1 hücre ekini etkili bir şekilde teşvik etmek için tercih edilen ECM proteini olarak kullanılmıştır. Farklı hidrojellerin doğru sertlik değerlerini sağlamak için, elastik modülü tasvir etmek için iyi bilinen bir teknik olan AFM kullanılarak sertlik değerlendirmesi yapıldı.
Poliakrilamid hidrojelin cam kapaklıya başarılı bir şekilde oluşumu ve bağlanması üzerine jel, eşit bir yüzey ve minimum yırtılma ile kapak kapağına yapışmaya devam etti. Sertlik, girinti tekniği prensibine dayanarak AFM tarafından ölçüldü, burada numuneye girinti derinliğine ulaşmak için gerekli kuvvete sahip sert bir girinti uygulandı26. Bu ölçümle, Young'un elastik modülü, Hertz'in modelinde derinlik ve kuvvet girintisine dayanarak hesaplandı, elastik bir teori26. Bununla birlikte, AFM'nin sonuçlardaki büyük varyasyonu nedeniyle, düzensiz yüzeylerin minimum etkisi ve jel çözeltilerinin kusurlu homojenliği ile nicel bir sonuç elde etmek için ek bir istatistiksel yöntem uygulanmıştır26. AFM kullanarak nicel bir ölçüm üretmek için, ortalama bir numune sertliği için jel numunesinin her yerinden en az 50 kuvvet ve mesafe eğrisinin bir derlemesi alındı. Yüksek sertlik jeli için uygulanan kuvvet, daha yumuşak jel için uygulanandan daha yüksekti, bu da daha sert bir substratın Kuvvet ve Z grafiğinde daha dik bir eğim sağladığını ve kuvvetin nN ile ölçüldüğü ve Z'nin girinti ve numune arasındaki girinti derinliğini gösterdiğini gösterir.
Yumuşak hidrojellerde, AFM probundan istenen kuvvet daha az olduğu için oluşturulan kuvvet eğrisinin eğimi yumuşaktı (Şekil 1A). Bununla birlikte, 40 kPa modülüne sahip olanlar gibi sert hidrojellerde, uygulanan kuvvet daha yumuşak jellerden daha yüksek olduğu için üretilen eğim çok daha dikti (Şekil 1B). Prob ve hidrojel numunesi arasındaki ayrım azaldıkça, probun ucu cam kapak ucuna dokundukça eğri önemli ölçüde artar. Ancak, ayırma mesafesi arttıkça, uygulanan bir kuvvet olmadığından eğri yalnızca 0'a yaklaşır.
Şekil 1A'dagösterildiği gibi, AFM probundaki kantilever jel çizgisiyle gösterilen jele yaklaştı ve prob jel örneğine nüfuz etmek ve sonunda cam kapak ucuna ulaşmak için gereken uygulanan kuvveti ölçtü ve ani bir kuvvet artışına neden oldu. Gerekli çözeltilerin kalitesi gibi olası prosedürel ve enstrümantal hatalar nedeniyle, hidrojel numunelerin gerçek sertliği büyük ölçüde ve istenen sertlikten uzaktır. Bu nedenle, AFM, daha sonraki denemelerde yanlış veri sunumunun önlenmesini önlerken metodolojiyi doğrulamak ve onaylamak için yararlı bir araçtır.
Bu AFM değerlendirmesinde hazırlanan beş hidrojel numunesi nicel yaklaşımla ölçüldüğünde. Protokol, çeşitli hücre tiplerinin farklılaşması için bildirilen biyolojik substrat sertlik seviyelerinin genişliğini taklit eden 0,5 kPa, 1 kPa, 10 kPa, 20 kPa ve 40 kPa hidrojel sertlik seviyelerine odaklandı. AFM ölçümlerinden elde edilen kuvvet eğrileri, bir AFM analiz algoritması yazılımı kullanılarak kilopaskallarda Young'un elastik modülünü oluşturmak için kullanılmıştır (Şekil 2).
Poliakrilamid hidrojel sistemlerin ve hücre tiplerinin karşılaştırılması
Orijinal protokolün Tse ve meslektaşları tarafından uyarlanarak, O9-1 hücrelerini kullanarak NCC'nin mekanosensitive yönlerini incelemek için etkili ve etkili bir yaklaşım sağlar20. Önceki protokolde yapılan değişiklikler arasında ECM protein inkübasyonunun değiştirilmesi yer almaktadır: 50 mM HEPES'in % 0,2 asetik asitle değiştirilmesi ve hücre kültürü için% 10 at serumu ve FBS eklenmesi (adım 1.3.14-1.3.15). Bu değişiklikler, bu modifiye jel sistemindeki O9-1 NCC'lerin büyümesi ve bakımı ile orijinal (kontrol) protokoldekiler karşılaştırılarak doğrulanmıştır. Burada, bazal ortamdaki her sistem için 1 kPa ve 40 kPa elastik modüle sahip her iki hidrojel sistemde de vahşi tip O9-1 hücrelerini kültüre ettik. Genel hücre büyüme durumu ve gelişimi, apoptotik özellikler, stresli morfoloji ve hidrojellere hücre bağlanması için parlak alan ışık mikroskobu kullanılarak görselleştirildi. Orijinal jel sisteminde yetişen O9-1 hücreleri, hem 1 kPa hem de 40 kPa hidrojel için fazla miktarda yuvarlak hücre (Şekil 3E,F) ile belirtilen daha yüksek sayıda ölü hücre ile sonuçlandı.
Buna karşılık, modifiye jel sisteminde yetişen O9-1 hücreleri sağlıklı hücre büyümesi ve hidrojel substrata yeterli bağlanma sergiledi (Şekil 3G, H). Buna ek olarak, NCC'lerin modifiye hidrojel sistemi ile uyumluluğu, NCC işaretleyicisi Tcfap2α'nın (AP-2) IF boyanma işlemi yapılarak değerlendirildi. AP-2, fare embriyolarındaki gelişimi düzenlemek için NC soylarında ifade edilen bir transkripsiyon faktörüdür, böylece uyumluluğu değerlendirmeye uygun hale getirir27. Kontrolde yetişen O9-1 hücreleri ve modifiye edilmiş hidrojel sistemleri ap-2'yi ifade etse de, modifiye hidrojel sistemi üzerine kaplanmış O9-1 hücrelerinde AP-2 ekspresyonunda, daha güçlü floresan sinyali ve ilgili nicelik ile belirtildiği gibi önemli bir artış oldu (Şekil 4A,B).
Ek olarak, P19 hücreleri, modifiye hidrojel sisteminin hücrelerin büyümesi için faydalarını daha da doğrulamak için kullanılmıştır. P19, fare28'deembriyodan türetilmiş teratokarsinomdan elde edilen embriyonik karsinom hücre hattıdır. İlgili kültür protokolü kullanılarak, P19 hücreleri hayatta kalma ve büyüme özelliklerini izlemek için hem kontrol hem de modifiye hidrojel sistemlerde yetiştirildi. Brightfield görüntüleme, her iki hidrojel sistemde de kaplanmış P19 hücrelerinin fazla miktarda yuvarlak yüzen hücre ve hücre-substrat ataşmanlarının eksikliğini görüntülediğini ortaya koydu (Şekil 3A-D). Bu gözlem, değiştirilen protokolün O9-1 NCC'lerin NCC'lerdeki mekanik sinyalleri incelemesi için daha uygun olduğunu öne sürdü.
Sert yüzeylerde yüksek stresli lif ekspresyonunun görselleştirilmesi
Modifiye hidrojel, farklı sertlik seviyelerindeki jeller ve diğer efektörler üzerinde kültürlenen hücrelerin morfolojislerindeki farklılıkların nicel ve nitel analizine izin verdi. Hidrojeller hücre tohumlama için hazır olduğunda, vahşi tip O9-1 hücreleri farklı sertlik seviyelerindeki hidrojellere geçirildi. Hücreler, şekillerini, mekansal yayılımlarını ve hatta hidrojel üzerindeki bağlanmalarını minimum ölü hücrelerle gözlemleyerek sağlıkları ve büyümeleri için izlendi. Bazı çalışmalar, yüksek sertlikli substratlarda MSC'ler için stres liflerinde ve hücre yapışmalarında bir artış olduğunu göstermiştir, daha sert bir substrat üzerinde yetişen NCC'lerin de daha yumuşak substratlarda yetişen NCC'lere kıyasla benzer bulgular sergileyeceğini göstermektedir29,30.
F-actin ile birlikte miosin II, α-actinin ve diğer sitoskeletal proteinler toplu olarak stres lifleri31olarak bilinir. Önceki çalışmalarda, artan mekanik kuvvete yanıt olarak stres lifi montajında bir artış gözlenmiştir31. Stres liflerinin bir veya her iki ucunda, odak yapışma kompleksine yapılan ekler hücrelerin ECM31'egeçişini ve yapışmasını sağlar. NCC'lerde F-aktinin ekspresyon ve organizasyonunun görselleştirilmesi için phalloidin lekeleme, mekanik sinyalizasyona yanıt olarak sağlıklı hücre büyümesi göstermiştir (Şekil 5). Ek olarak, düşük veya yüksek sertlikteki hidrojellerde yetişen O9-1 hücreleri, değişen miktarlarda stres lifleri yoluyla farklı morfolojiler sergilemektedir (Şekil 5). MSC'ler kullanılarak yapılan bildirilen çalışmalardan elde edilen gözlemlere benzer şekilde, daha sert bir substrat üzerinde yetiştirilen O9-1 hücrelerinin, 40 kPa, daha fazla stres lifi sergilediği ve 1 kPa sertliği29,30ile belirtilen daha yumuşak bir hidrojel üzerinde yetişen hücrelere kıyasla iyi yayıldığı gözlenmiştir.
Hücre yapışıklıklarının değerlendirilmesi
Substrat sertliğindeki değişimin NCC yapışıklığını etkilediği hipotezini daha da doğrulamak için, Vcl ekspresyonunda yapılan değişiklikler, farklı hidrojel sertlik seviyelerine yanıt veren NCC'lerde RT-qPCR ile nicel olarak ölçüldü. Vcl, hücrenin substratla temas kurma ve ECM özelliklerini algılama işlemi sırasında odak yapışıklık kompleksinde bulunan çok sayıda sitoskeletal proteinden biridir32. Odak yapışıklıkları, sitoplazmik aktin sitoskeletona tutturan integrin reseptörleri aracılığıyla hücrelerin ECM'ye temas noktalarıdır, F-actin33 Vcl gen ekspresyon seviyesi, substrat sertliğine yanıt olarak O9-1 hücrelerinin odak yapışıklıklarındaki ve hücre yapışıklıklarındaki değişiklikleri göstermektedir.
Önceki çalışmalar Vcl'nin embriyonik kök ve fibroblast hücrelerinde hücre yapışma üzerindeki etkisini ifadesindeki farklılıklarla göstermiştir. Vcl'ninyüksek ifadesine yanıt olarak, odak yapışıklıklarının sayısı ve boyutları da arttı, ancak Vcl 34düşürürken azaldı. Tutarlı bir şekilde, Vcleksikliği olan hücreler de hücre yapışkanlığında önemli bir azalma gösterdi ve35yayıldı. Ek olarak, Vcl odak yapışıklıklarını stabilize ederek hücre yapışıklıklarının düzenlenmesinde rol oynar36. Odak yapışıklıklarının, olgunlaşma seviyesinin ve bileşimlerin boyutu substrat sertliğine göre değişir, böylece sinyallerin hücre içi olarak çevrilmesine ve hücrelerin çevresel ipuçlarına yanıt vermesine izin verir37. Bu nedenle, Vcl, RT-qPCR (Şekil 6C) tarafından tespit edilen daha yüksek mRNA seviyeleri tarafından yansıtıldığı gibi, sert substratlarda yetişen hücrelerdeki odak yapışkanlık komplekslerine yüksek oranda işealınır.
Daha yumuşak yüzeylerde yetişen hücreler, hücrelerde daha düşük mRNA Vcl seviyeleri tarafından yansıtıldığı gibi minimum odak yapışkan kompleksleri oluşturur15. Şekil 6C'de,O9-1 hücreleri sert substratta yumuşak substrattan daha yüksek bir Vcl ifadesi sergiledi. Bu sonuçlar, O9-1 hücrelerinin sert substratlar üzerindeki hücre-substrat yapışıklıklarının daha yumuşak substratlardaki O9-1 hücrelerine göre daha yüksek düzeyde olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, Vcl ekspresyolü, RT-qPCR bulgusunu daha fazla tamamlamak ve desteklemek için bir anti-Vcl antikor ile IF boyama yoluyla niteliksel olarak görselleştirildi. Sürekli olarak, daha sert substratta yetişen O9-1 hücrelerindeki Vcl ekspresyonu, RT-qPCR ile F-actin phalloidin boyama ve Vcl ekspresyon seviyeleri ile gözlenen 1 kPa hidrojel ile karşılaştırıldığında, yüksek hücre yapışıklığı ve 40 kPa hidrojel üzerinde yayılan ilk bulguyu daha da destekleyen daha yumuşak substratta yetişenlerden daha yüksekti (Şekil 6A,B).
Şekil 1: AFM probunun girintisinden oluşturulan kuvvet eğrileri. Kuvvet (y ekseni) nN'de uygulanan gerekli kuvveti, Z (x ekseni) ise Bruker AFM prob mesafesini numuneden μm olarak gösterir. 1 kPa hidrojel (A) için, oluşturulan eğim, 40 kPa hidrojel (B) için gözlenen daha dik eğime karşı yumuşaktır. Renkli eğriler, hidrojel numunesinden yaklaşırken (mavi) ve geri çekilirken (kırmızı) afm probu üzerindeki dokunsal hareketini temsil eder. Eğrinin en yüksek başlangıç noktası, cam kapak kapağının sert temasını gösterir. (B) 40 kPa hidrojeldeki geri çekilen eğrideki büyük daldırma, boncuk ve numune arasındaki yapışkanlığı gösterir. Kısaltma: AFM = atomik kuvvet mikroskopisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Young'ın elastik modülünden hesaplanan hidrojellerin ortalama sertliği (kPa'da). Young'ın modülü Şekil 1'denkuvvet eğrilerinden oluşturulmuş. Hidrojellerin referans alınan elastik modülü 0,5 kPa, 1 kPa, 10 kPa, 20 kPa ve 40 kPa'ydı. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hücre büyüme özelliklerini tespit etmek için 1 kPa ve 40 kPa hidrojeller ve modifiye jel sistemleri üzerine kaplanmış P19 ve O9-1 hücrelerinin parlak alan görüntüleri. (A-D) P19 ve (E-H) O9-1 hücreleri; ölü hücreler kırmızı oklarla gösterilir. Ölçek çubukları = 25 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: NCC uyumluluğunu görselleştirmek için O9-1 NCC'lerde NCC işaretleyici AP-2'nin immünoresans boyanmasını. (A) 40 kPa modifiye hidrojel sistemi ile karşılaştırıldığında (B) 40 kPa kontrolü. AP-2 (yeşil); çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. Ölçek çubukları = 25 μm. (C) Çubuk grafik, önem gösteren AP-2 ifade düzeyinin nicelleştirilmesini sağlar (p-değer = 0.003) (n = 3). Veriler, sağlanan standart sapma hata çubuklarıyla göreli ifadeyi gösterir. Kısaltmalar: NCC = nöral kret hücresi; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 40 kPa hidrojel üzerindeki O9-1 hücrelerinde iyi yayılmış stres liflerini gösteren F-actin floresan phalloidin lekesi. O9-1 hücreleri 1 kPa (A) ve 40 kPa hidrojel (B) üzerinde kültürlendi. O9-1 hücreleri Alexa Fluor 488 Phalloidin (yeşil) kullanılarak, çekirdekler ise DAPI (mavi) ile boyandı. Ölçek çubukları = 25 μm. Kısaltma: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: O9-1 hücrelerinde vinculin immünoresans görüntüleri. O9-1 hücreleri 1 kPa (A) ve 40 kPa (B) hidrojeller üzerine kaplandı. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. Ölçek çubukları = 25 μm. (C) 1 kPa ve 40 kPa hidrojellerde kültürlenmiş O9-1 hücrelerinde Vcl'nin toplam mRNA seviyesinin gerçek zamanlı nicel PCR analizi. 1 kPa hidrojel üzerindeki Vcl ekspresyon seviyesi, 40 kPa hidrojeldekinden önemli ölçüde daha düşüktür (p-değer = 0,02). Veriler, sağlanan standart sapma hata çubuklarıyla ortalamayı gösterir. Kısaltma: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| 500 μL toplam hacim | 0,5 kPa | 1 kPa | 10 kPa | 20 kPa | 40 kPa | ||
| %40 Akrilamid (μL) | 37.5 | 62.5 | 125 | 100 | 100 | ||
| %20 Bis-akrilamid (μL) | 15 | 7.5 | 25 | 66 | 120 | ||
| H2O (μL) | 447.5 | 430 | 350 | 334 | 280 | ||
| %10 APS (μL) | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | ||
| TEMED (μL) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | ||
Tablo 1: İstenilen sertlik seviyelerini elde etmek için karşılık gelen çözelti hacimleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut çalışmanın amacı, NCC'lerdeki mekanik sinyallerin etkisini daha iyi anlamak için etkili ve verimli bir in vitro sistem sağlamaktır. Yukarıda belirtilen adım adım protokolü takip ederek, araştırmacıların O9-1 NCC'lerin hücre kültürünün hidrojel hazırlamak için kullanılan cam kapakların türünden etkilendiğini akılda tutmaları gerekir. Örneğin, belirli bir cam kapak kapağı türüne tohumlanmış hücrelerin (Bkz. Malzeme Tablosu)hayatta kaldığı ve iyi çoğaldığı, diğer cam kapak örtülerinde tohumlanan kültürlü hücrelerin ise daha fazla hücre ölümü gösterdiği belirtilmiştir. Ayrıca, O9-1 NCC38için doğru hücre kültürü koşullarını kesinlikle takip etmek önemlidir. Hidrojeller mümkün olan en kısa sürede kullanıldığında veya steril 37 °C inkübatörde iki güne kadar saklandığında hücre kültürünün kalitesi en uygun olanıdır.
Protokoldeki her bileşenin hassasiyeti nedeniyle, elastik modül deneyler arasında değişebilir. %10 APS ile ilgili protokolde belirtilen noktalara (adım 1.3.2) ek olarak, akılda tutulması gereken diğer kritik faktörler de varyasyonu etkiler. AFM ölçümlerinde büyük farklılıklara neden olduğundan şüphelenilen bir diğer faktör de hidrojellerin kalınlığıydı. Daha önceki bir çalışma, kalınlığın 15 ila 1000 μm arasında değişen Young modülü üzerindeki etkisini araştırmış ve kalınlık farklılıklarının Young'un modülünü önemli ölçüde değiştirmediğini tespit etmişti39. Bununla birlikte, substratların kalınlığı, hücrelerin algıleyebileceği mekanik özellikleri de etkiler ve farklı morfolojilere yol açarak40,41,42. Çeşitli çalışmalar, hidrojellerin kalınlığındaki önemli bir artışın hücre bölgesinde azalmaya, hidrojellerin yayılmasına ve etkinliğinin sertliğine yol açtığını göstermiştir40,41,42. Bununla birlikte, hücrelerin fenotipleri de önemli ölçüde ince hidrojellere yanıt olarak değişir, örneğin, düşük sertlikteki hidrojellerde bile daha yüksek yayılma40,41,42. Tutarlı bir poliakrilamid jel hacmi ile, hidrojellerin kalınlığı tekdüze olmalıdır, böylece hafif sapmalar AFM ölçümlerindeki elastik modülü önemli ölçüde etkilemez.
Kapakları bir alkol yakıcı kullanarak alevde ileri geri geçirerek sterilize etmek daha iyidir, çünkü diğer sterilizasyon yöntemleri daha karmaşık olabilir ve cam kapaklara potansiyel hasara neden olabilir. Deneysel gereksinimlere göre farklı boyutlarda cam kapaklar kullanılabilir. Bu protokolde sırasıyla immünhistokinoloji ve RT-qPCR için 12 mm ve 25 mm coverlips kullanılmıştır. Deneylere uygun olarak uygun boyutta jeller kullanmak verimliliği teşvik eder ve israfı en aza indirir. Bu değişiklikler, orijinal (kontrol) hidrojel sistem20ile karşılaştırıldığında O9-1 NCC'ler için optimizasyon sağlamak için niteliksel ve nicel olarak doğrulanmıştır. O9-1 NCC'lerin genel sağlığı ve büyümesi hücresel ve substrat bağlanma özellikleri için parlak alan mikroskobu altında değerlendirildi.
Buna ek olarak, O9-1 hücrelerinin uyumluluğu, IF boyama kullanarak AP-2 ifadesini nitel olarak görselleştirerek bu protokoldeki değişiklikleri daha da doğrulamak için hem kontrol hem de modifiye edilmiş hidrojel sistemleri arasında karşılaştırıldı. Sinyallerin yoğunluğu, O9-1 hücrelerinde kontrol ve modifiye hidrojel sistemleri arasındaki AP-2 ekspresyonunun temsili görüntülerini daha da desteklemek için ölçüldü. AP-2 yaygın bir NCC işaretleyicisi olsa da, pluripotency ve sağkalım28'inNCC bakımı için önemi nedeniyle Sox10 ve Pax3 gibi diğer iyi bilinen belirteçler doğrulama için düşünülmelidir. Ek olarak, bu hidrojel sistemin NC hücreleri için verimli ve güvenilir olmasını sağlamak için O9-1 NC hücrelerinin başka bir hücre hattı olan P19 ile karşılaştırılması ile bu protokoldeki optimizasyon daha da doğrulandı. P19 hücreleri ölümsüz özelliklere sahip olmalarına ve kolayca kültüre olmalarına rağmen, hidrojel sistemlerinin her ikisinde de iyi gelişmediler.
Hücrelerin bağlandığı substrat veya doku sertliğinden üretilen uzama kuvvetine karşı direnç genellikle Young'ın elastik modülü45olarak ifade edilir. AFM ile Young'ın elastik modülü, uygulanan dikey kuvvet26'danoluşturulan kuvvet eğrisinden elde edilir. AFM ölçümü sırasında, daha sert hidrojeller için yanlış okumalara yol açabilecek ölçümler arasında büyük farklılıklar meydana gelebilir. Tutarsızlık, ölçüm için kullanılan yanlış problardan kaynaklanabilir. Örneğin, 20 kPa ve 40 kPa hidrojel ölçümü, daha yüksek yay sabitine (k = 0,24 N/m) sahip daha sert bir prob kullanılmasını gerektirir. Daha sert bir prob, daha yumuşak bir probla karşılaştırıldığında daha düşük bir çözünürlük sağlar; ancak, çok yumuşak dokunsal elverdeler örneklere yapışabileceğinden daha sert bir probun seçimini tercih etmek için nedenler vardır46. Ek olarak, çok yumuşak problar son derece hassastır, istenmeyen parçacıklardan gelen yanlış sinyallere katkıda bulunan ve gerçek sertlikten yapay olarak daha düşük veya daha yüksek sertlik değerlerine neden olur46. Ayrıca, ölçüm malzemesine bağlı olarak Poisson oranının doğru girişine dikkat edilmelidir; bu, veri çıktısını önemli ölçüde etkilediği için standartlaştırılmış çalışmalarda bulunabilir.
Ek olarak, AFM hidrojellerin kalınlığını ölçmek için kullanılmıştır, çünkü kalınlık hücrelerin çevrelerini nasıl algılaylarını etkileyen başka bir mekanik özelliktir47,42. Bildirilen çeşitli çalışmalarda, yumuşak hidrojeller üzerinde yetiştirilen hücrelerin, hücre tipi47 , 42,48'e bağlı olarak ~2-5 μm olarak bildirilen "kritik kalınlıkta" ve ötesinde yuvarlak şekilli olduğu gözlenir. Bununla birlikte, hücreler aynı sertlikte ancak "kritik kalınlık"42,48'dendaha düşük kalınlıkta hidrojeller üzerine kaplandığında çok daha yüksek yayılma gözlenmiştir. Bu ilginç bulgu için potansiyel bir açıklama, hidrojellerin alt kritik kalınlığının, hücrelerin yanal yer değiştirme için çekiş eforu olarak sert alttaki cam örtüleri hissetmesini sağladığıdır47. Tüm sertlikteki hidrojellerde ortalama kalınlık 342 μm diri 27 μm standart sapma ile idi. Hidrojellerin kalınlığı önerilen "kritik kalınlıktan" daha yüksekti ve çalışmalarda ve üretilen premade hidrojellerde bildirilen 400 μm'nin altındaki test aralığında, hücrelerin alttaki sert cam kapakların değil, hidrojellerin farklı sertliğini hissedebileceği42,48.
AFM nicel analiz yöntemine ek olarak, hidrojeller, O9-1 hücrelerindeki değişen sertlikten etkilenen belirteçlerin ekspresyonunun incelenmesi ve hücrelerin sağlıklı büyümesinin görselleştirilmesi için immünhistokimya yoluyla nitel olarak analiz edildi. Sitoplazmadaki F-actin, membran bağlı integrinlere talin ve Vcl gibi bir dizi sitoskeletal proteinle bağlanır ve odak yapışıklıkkompleksini oluşturur 33. Hücrelerdeki stres liflerinin ekspresyonu, odak yapışma lekeleme kiti kullanılarak birlikte görselleştirilebilen talin ve integrin gibi hücrelerdeki diğer sitoskeletal genlerin ekspresyonu ölçülerek de analiz edilebilir.
Mekanik sinyalizasyon yoluyla hücre yapışma ve stres liflerindeki değişimde görüldüğü gibi, NCC morfolojisini ve yanıtını etkileyen çeşitli derecelerde hidrojel sertliği vardı. Bu protokol, ilgili kültür koşullarını in vitrodeğiştirerek hücre farklılığını çeşitli hücre türlerine etkileme yeteneği sunar, böylece NCC'lerde mekanik sinyallerin ve kimyasal sinyallerin uygun bir manipülasyon yöntemini sağlar. Daha önce de belirtildiği gibi, NCC farklılaşmanın kaderi, sertliği2,3de dahil olmak üzere çevredeki dokuda bulunan mekanik kuvvetler tarafından yönlendirilir. Bu makalenin acil amacı, NCC kültürü için hidrojel hazırlamak için adım adım bir protokol geliştirmek olsa da, bu protokolün potansiyel yararları metodolojinin ötesine geçerek NCC'lerde mekanik sinyalizasyon hakkında daha fazla bilgi edinmektedir. Bu tüp bebek sisteminin bazı sınırlamaları olduğunu da belirtmek gerekir. Hidrojelleri imal etme tekniği, heterojenlik, düzensiz yüzey ve yanlış sertlik de dahil olmak üzere yol boyunca teknik varyasyonlar ortaya çıkarabilecek birden fazla adımdan oluşur. Bu nedenle, kullanıcılar denemeler sırasında teknik varyasyonları en aza indirmek için bu adımları dikkatlice gerçekleştirmelidir. Ek olarak, bu sistemdeki poliakrilamid jeller, NCC'lerin yaşadığı hassas 3D biyolojik ortamı göz ardı ederek, akrilamid toksisitesi nedeniyle çalışmaları 2D kültürü ilesınırlamaktadır.
Bu kısıtlamalara rağmen, bu in vitro sistem, tüm araştırma seviyelerine fayda sağlayan ve araştırmacıların yeterli ve işlevsel aşağı akış testleri yapmalarını sağlayan ucuz ve basit bir yöntem sağlar. Son bulgularda görüldüğü gibi, NCC'ler hem kesme kuvveti ve substrat sertliği gibi mekanik sinyallere hem de kraniyofasiyal olarak Wnt ve fibroblast büyüme faktörü sinyali gibi kimyasal sinyalizasyona ve omurgalılarda kalp gelişimine büyük ölçüde güvenir6,15. Bu protokol kullanılarak, in vitro deneyler için yerel mikroçevrimler, farklılaşma, göç, hücresel yanıtlar ve zararlı hastalığın ilerleme potansiyeli de dahil olmak üzere NCC'ler üzerinde gelecekteki çalışmalar için kolayca taklit edilebilir. Bu nedenle, bu in vitro sistem, NCC'lerde mekanik sinyalizasyonun rollerini ve diğer sinyal yollarıyla etkileşimlerini incelemek için güçlü bir araç olacak ve bu da NCC gelişiminin ve ilgili hastalıkların moleküler ve genetik mekanizmalarının anlaşılmasını derinecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Teksas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Atomik Kuvvet Mikroskop-UT Çekirdek tesisinin işletmecisi Dr. Ana-Maria Zaske'ye bu projede AFM'ye katkı sağlayan uzmanlığı için teşekkür ederiz. Ayrıca Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 ve R01HL142704'ten J. Wang'a) finansman kaynaklarına teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-012 | |
| 2% Bis-Acrylamide | Sigma Aldrich | M1533 | |
| 24-well plate | Greiner Bio-one | 662165 | |
| 25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-025 | |
| 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | A3648 | |
| 4-well cell culture plate | Thermo Scientific | 179830 | |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | J61899-AP | |
| 40% Acrylamide | Sigma Aldrich | A4058 | |
| 50% glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G7651 | |
| 6-well cell culture plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| AFM cantilever (spherical bead) | Novascan | ||
| AFM software | Catalyst NanoScope | Model: 8.15 SR3R1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 248614 | Powder |
| anti-AP-2α Antibody | Santa Cruz | sc-12726 | |
| anti-Vinculin antibody | Abcam | ab129002 | |
| Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst | Bruker Corporation | ||
| Collagen type I (100mg) | Corning | 354236 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dichloromethylsilane (DCMS) | Sigma Aldrich | 440272 | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fluorescence microscope | Leica | Model DMi8 | |
| Fluoromount-G mounting medium | SouthernBiotech | 0100-35 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Powder |
| Horse serum | Corning | 35-030-CI | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
| Penicillin-Streptomycin antibiotic | Thermo Fisher | 15140148 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| Sterile 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
| Sterile deionized water | Hardy Diagnostics | U284 | |
| sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
| SYBR green | Applied Biosystems | 4472908 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
References
- Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
- Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Developmental Biology. 419 (2), 199-216 (2016).
- Watt, K. E. N., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. Trainor, P. A. , Academic Press. 361-394 (2014).
- Lavelle, C. L. B. Applied oral physiology. , Butterworth-Heinemann. (1988).
- Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
- Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
- Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
- Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
- Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
- Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
- Dupont, S., et al.
- Lu, Y. -B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
- Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335 (2007).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
- Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 10, Unit 10.16 (2010).
- Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089 (2010).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
- Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108 (2019).
- Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
- Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
- Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
- Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
- Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
- Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257 (2018).
- Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
- Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
- Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
- Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze'ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
- Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
- Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
- Kuo, J. -C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346 (2018).
- Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
- Lin, Y. -C., et al.
- Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
- Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
- McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
- Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15 (2015).
- Wells, R. G.
- Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
- Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , Academic Press. 363-373 (2017).
