Summary
Protocolos passo a passo detalhados são descritos aqui para o estudo de sinais mecânicos in vitro usando células de crista neural O9-1 multipotentes e hidrânis de poliacrilamida de rigidez variada.
Abstract
As células de crista neural (NCCs) são células multipotentes embrionárias vertebrada que podem migrar e se diferenciar em uma ampla gama de tipos celulares que dão origem a vários órgãos e tecidos. A rigidez tecidual produz força mecânica, uma sugestão física que desempenha um papel crítico na diferenciação do NCC; no entanto, o mecanismo permanece incerto. O método descrito aqui fornece informações detalhadas para a geração otimizada de hidrânis de poliacrilamida de rigidez variada, a medição precisa de tal rigidez e a avaliação do impacto dos sinais mecânicos em células O9-1, uma linha NCC que imita NCCs in vivo.
A rigidez do hidrogel foi medida por meio da microscopia de força atômica (AFM) e indicou diferentes níveis de rigidez em conformidade. Os NCCs O9-1 cultivados em hidrogéis de rigidez variada mostraram diferentes morfologia celular e expressão genética de fibras de estresse, o que indicou efeitos biológicos variados causados por alterações mecânicas de sinal. Além disso, isso estabeleceu que a variação da rigidez do hidrogel resultou em um sistema in vitro eficiente para manipular a sinalização mecânica alterando a rigidez do gel e analisando a regulação molecular e genética em NCCs. Os NCCs O9-1 podem se diferenciar em uma ampla gama de tipos celulares sob a influência dos meios de diferenciação correspondentes, e é conveniente manipular sinais químicos in vitro. Portanto, este sistema in vitro é uma poderosa ferramenta para estudar o papel da sinalização mecânica em NCCs e sua interação com sinais químicos, o que ajudará os pesquisadores a entender melhor os mecanismos moleculares e genéticos do desenvolvimento de crista neural e doenças.
Introduction
As células de crista neural (NCCs) são um grupo de células-tronco durante a embriogênese vertebrada com uma notável capacidade de migrar e contribuir para o desenvolvimento de vários órgãos e tecidos. Os NCCs podem se diferenciar em diferentes tipos celulares, incluindo neurônios sensoriais, cartilagem, osso, melanócitos e células musculares lisas, dependendo da localização de origem axial e da orientação ambiental local da NCC1,2. Com a capacidade de se diferenciar em uma ampla gama de tipos celulares, anormalidades genéticas que causam a desregulação em qualquer estágio do desenvolvimento da crista neural (NC) podem levar a inúmeras doenças congênitas2. Por exemplo, perturbações durante a formação, migração e desenvolvimento de DCNT levam a distúrbios do desenvolvimento conhecidos coletivamente como neurocristopatias1,3. Essas doenças vão desde defeitos craniofaciais devido à falha na formação do CCN, como a síndrome de Treacher Collins, até o desenvolvimento de vários cânceres devido à capacidade migratória metastática do CCN, como visto no melanoma3,4,5,6. Ao longo das últimas décadas, pesquisadores fizeram descobertas notáveis sobre os papéis e mecanismos das DCNT no desenvolvimento e nas doenças, com a maioria dos achados sendo focados em sinais químicos7,8. Mais recentemente, os sinais mecânicos foram indicados para desempenhar um papel crítico, mas mal compreendido no desenvolvimento do NCC9,10.
As sugestões ambientais das DCNT desempenham um papel crítico durante o seu desenvolvimento, incluindo a regulação da diferenciação do NCC em vários tipos de células. As sugestões ambientais, por exemplo, as pistas físicas, influenciam comportamentos fundamentais e respostas celulares, como a diversificação funcional. A mecanotransdução permite que as células osenceram e respondam a essas pistas para manter vários processos biológicos2. As NCCs são cercadas por células vizinhas e substratos diferentes, como a matriz extracelular (ECM), que pode dar origem a estímulos mecânicos para manter a homeostase e se adaptar às mudanças através da determinação do destino, proliferação e apoptose11. A mecanotransdução começa na membrana plasmática onde ocorre o componente sensorial dos estímulos extracelulares mecânicos, resultando na regulação intracelular da célula12. Integrinos, aderências focais e junções da membrana plasmática retransmitem sinais mecânicos, como forças de corte, estresse e rigidez de substratos circundantes, em sinais químicos para produzir respostas celulares12. O retransmissamento de sinais químicos da membrana plasmática para a regulação celular final é realizado através de diferentes vias de sinalização para finalizar processos vitais para o organismo, como a diferenciação.
Vários estudos sugerem que a sinalização mecânica da rigidez do substrato desempenha um papel na diferenciação celular13,14. Por exemplo, estudos anteriores mostraram que as células-tronco mesenquimais (MSCs) cultivadas em substratos macios com rigidez semelhante à do tecido cerebral (na faixa de 0,1-1,0 kPa) resultaram na diferenciação celular neuronal15,16. No entanto, mais MSCs se diferenciam em células semelhantes a miócitos quando cultivados em substratos de 8-17 kPa imitando a rigidez do músculo, enquanto a diferenciação semelhante ao osteoblasto foi observada quando os MSCs foram cultivados em substratos rígidos (25-40 kPa)15,16. A significância da mecanotransdução é destacada pelas irregularidades e anormalidades na via de sinalização mecânica que potencialmente levam a graves defeitos e doenças do desenvolvimento, incluindo câncer, doenças cardiovasculares e osteoporose17,18,19. Nos cânceres, o tecido mamário normal é macio, e o risco de câncer de mama aumenta em tecido mamário rígido e denso, um ambiente mais parecido com os tumores mamários15. Com esse conhecimento, os efeitos da sinalização mecânica no desenvolvimento do NCC podem ser estudados através da simples manipulação da rigidez do substrato através de um sistema in vitro, proporcionando mais vantagens e possibilidades na compreensão dos fundamentos da progressão e etiologia da doença relacionada à NC.
Para estudar o impacto dos sinais mecânicos nas NCCs, estabelecemos um sistema in vitro eficiente para NCCs com base na otimização de métodos publicados anteriormente e na avaliação das respostas das NCCs a diferentes sinais mecânicos20,21. Foi fornecido um protocolo detalhado para a preparação e avaliação da rigidez do hidrogel variado e a avaliação do impacto da sinalização mecânica em NCCs. Para isso, os NCCs O9-1 são utilizados como modelo nc para estudar os efeitos e mudanças em resposta a hidrogéis rígidos versus macios. Os NCCs O9-1 são uma linha de células NC estável isolada do embrião do rato (E) no dia 8.5. Os NCCs O9-1 imitam NCCs in vivo porque podem se diferenciar em vários tipos de células derivadas do NC em mídia de diferenciação definida22. Para estudar a sinalização mecânica das NCCs, foi fabricado um substrato matricial com elasticidade tunable a partir de diferentes concentrações de acrilamida e soluções de biscrilamida para alcançar a rigidez desejada, correlacionando-se com a rigidez biológica do substrato20,21,23. Para otimizar as condições do substrato matricial para NCCs, especificamente células O9-1, foram feitas modificações a partir do protocolo20publicado anteriormente. Uma mudança feita neste protocolo foi a incubação de hidrogéis em colágeno I, diluídos em ácido acético de 0,2% em vez de 50 mM HEPES, a 37 °C durante a noite. O baixo pH do ácido acético leva a uma distribuição homogênea e maior incorporação de colágeno I, permitindo assim um apego mais uniforme da proteína ECM24. Além disso, foi utilizada uma combinação de soro de cavalo e soro bovino fetal (FBS) nas concentrações de 10% e 5% em soro tampão de fosfato (PBS), respectivamente, antes de armazenar os hidrogéis na incubadora. O soro de cavalo foi utilizado como suplemento adicional à FBS devido à sua capacidade de promover a proliferação celular e a diferenciação na concentração de 10%25.
Com este método, um ambiente biológico foi imitado pelo revestimento proteico ECM (por exemplo, Colágeno I) para criar um ambiente in vitro preciso para que os NCCs cresçam e sobrevivama 20,21. A rigidez dos hidrogéis preparados foi analisada quantitativamente via microscopia de força atômica (AFM), uma técnica bem conhecida para retratar o módulo elástico26. Para estudar o efeito de diferentes níveis de rigidez em NCCs, as células do tipo selvagem O9-1 foram cultivadas e preparadas em hidrogéis para a coloração de imunofluorescência (IF) contra a actina filamentosa (F-actin) para mostrar as diferenças na adesão celular e morfologias em resposta às mudanças na rigidez substrato. Utilizando esse sistema in vitro, os pesquisadores poderão estudar os papéis da sinalização mecânica em NCCs e sua interação com outros sinais químicos para obter uma compreensão mais profunda da relação entre NCCs e sinalização mecânica.
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Protocol
1. Preparação de hidrogel
NOTA: Todas as etapas devem ser executadas em uma capa de cultura celular que tenha sido desinfetada com etanol e ultravioleta (UV) esterilizada antes de usar para manter a esterilidade. Ferramentas, como pinças e pipetas, devem ser pulverizadas com etanol. As soluções tampão também devem ser filtradas estéreis.
- Preparação de tampas de vidro revestidas de aminosilano
- Coloque o número desejado de tampas de vidro em um pedaço de limpeza de laboratório.
NOTA: Prepare um adicional de 3-4 tampas para garantir suprimentos de backup suficientes à medida que quebram facilmente. Diferentes materiais de tampas de vidro produzirão diferentes compatibilidades de semeadura e fixação celular. É melhor determinar qual tipo se adequa melhor ao experimento antes de iniciar os experimentos (veja a Tabela de Materiais). - Use um queimador de álcool ou bico de Bunsen para esterilizar cada deslizamento de cobertura passando-o para frente e para trás através da chama (30 s para experimentos de ensaio de proteína). Coloque cada mancha de vidro em um lenço de laboratório para esfriar.
- Uma vez que as tampas de vidro sejam resfriadas, transfira-as para uma placa de Petri forrada com parafilme para evitar escorregar.
NOTA: Se as tampas não estiverem frias o suficiente, o calor residual derreterá o parafilme nos deslizamentos, tornando-os inutilizáveis. - Cubra as tampas com aproximadamente 200 μL e 800 μL de 0,1 M NaOH para um deslizamento de 12 mm e um deslizamento de cobertura de 25 mm, respectivamente, e deixe-os sentar por 5 min. Em seguida, aspire o NaOH 0,1 M e deixe as tampas secarem por mais 5 minutos para formar um filme uniforme.
- Uma vez que as manchas são secas, pipeta aproximadamente 80 μL e 150 μL de trietoxisilano de 3 aminopropílico (APTS) para tampas de 12 mm e 25 mm, respectivamente. Tenha cuidado para evitar derramar a solução no parafilme. Deixe a solução sentar por 5 minutos.
- Aspire o máximo de APTS em excesso possível e permita que o APTS residual seque por 5 minutos. Enxágüe bem as tampas submergindo-as em estéreis, desionizados (DI) H 2 O trêsvezespor 5 min cada vez.
NOTA: Se as tampas de vidro não forem bem lavadas, o APTS residual causa reações indesejadas com glutaraldeído, causando a formação de um precipitado branco e resultando em deslizamentos inutilizáveis. - Mova as tampas para uma nova placa de Petri com o lado reativo voltado para cima. Adicione 0,5% de glutaraldeído suficiente à placa de Petri para cobrir totalmente as tampas e permitir que as tampas se sentem por 30 minutos.
- Aspire o glutaraldeído de 0,5% e enxágue as tampas novamente em DI H2O uma vez por 3 min. Coloque as tampas do lado reativo em um lenço de laboratório ou uma placa de Petri limpa para secar completamente o ar antes de usar.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui; as tampas devem ser colocadas em DI H2O estérei até o uso.
- Coloque o número desejado de tampas de vidro em um pedaço de limpeza de laboratório.
- Preparação de tampas siliconadas
- Coloque o mesmo número de tampas que as tampas revestidas de aminosilano (passo 1.1.1) em uma placa de Petri forrada com parafilm.
- Pipeta 40 μL ou 150 μL para tampas de 12 mm e 25 mm, respectivamente, de dichlorometilsilano (DCMS) para um lado da tampa e permitem que a solução se sente por 5 min.
- Aspire qualquer solução restante do deslizamento de cobertura, lave em DI H2O estéril uma vez por 1 min, e coloque as tampas reativas de frente para cima em um limpador de laboratório para secar completamente o ar antes de passar para o próximo passo.
- Preparando hidrogéis
- Misture acrilamida, bis-acrilamida e DI H2O em um tubo de centrífuga de 1,5 mL para preparar 500 μL de soluções com rigidezs variadas (ver Tabela 1). Vórtice a solução para 30 s para misturá-lo completamente.
- Trabalhando rapidamente, adicione a solução de persulfato de amônio de 10% (APS) e tetrametileenodiamina (TEMED) ao tubo e vórtice as soluções novamente para misturar as soluções.
NOTA: Prepare o APS fresco de 10% e deixe-o no gelo ou congele em alíquotas de uso único devido ao seu ciclo sensível de congelamento/degelo. - Pipeta aproximadamente 33 μL ou 100 μL da solução sobre as tampas secas revestidas de aminosilano (seção 1.1), respectivamente.
- Utilizando pinças curvas, coloque imediatamente o deslizamento de cobertura tratado com DCMS em cima da solução de gel com o lado tratado tocando a solução de gel, sanduíchendo assim a solução de gel entre o deslizamento de cobertura tratado com DCMS e o deslizamento revestido de aminosilano.
- Deixe a solução de gel polimerizar por 5-15 min, enquanto monitora ativamente para polimerização de gel da solução restante no tubo.
- Uma vez que o gel seja polimerizado, separe o deslizamento de cobertura tratado com DCMS com pinças curvas ou uma lâmina de barbear, deixando o gel preso ao talão original revestido de aminosilano.
- Coloque imediatamente o talo de cobertura com o hidrogel anexado em uma placa pré-determinada de 4-bem/24-bem e 6-bem coberta com 500 μL e 2 mL de PBS estéril ou DI H2O para tampas de 12 mm e 25 mm, respectivamente, para evitar que o gel seque.
- Repetir as etapas 1.3.4-1.3.7 para todas as tampas.
- Submergir os hidrogéis em PBS estéreis ou DI H2O por 30 minutos para remover o excesso de solução de acrilamida. Armazene os hidrogéis em PBS estéreis ou DI H2O a 4 °C para uma parada processual aqui.
- Em uma sala escura, prepare a mistura de sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoato (sulfo-SANPAH) misturando 2,5 mL de 50 mM 2-[4 -(2-hidroxietila) piperazin-1-yl] ácido esfilfônico (HEPES) (pH=8,5) com 25 μL do sulfo-SANPAH de 50 μg/mL em um tubo cônico, embrulhado em papel alumínio para proteger da luz. Use uma pipeta para misturar bem a solução antes de usar.
NOTA: Um volume de 2,5 mL de solução sulfo-SANPAH é suficiente para aproximadamente 25 hidrogéis de 12 mm ou cinco hidrogéis de 25 mm. - Aspirar PBS ou DI H2O da placa do poço. Adicione aproximadamente 100 μL ou 500 μL para tampas de 12 mm e 25 mm, respectivamente, da solução sulfo-SANPAH (etapa 1.3.10) para cobrir o gel. Certifique-se de que a solução cobre o gel inteiramente.
NOTA: Ajuste a força de sucção do vácuo para evitar que a força forte rasge ou perturda os hidrogéis. - Coloque os géis com a solução sob uma luz UV de 15 W, 365 nm por 10 minutos, descobertos para minimizar qualquer interferência da luz UV reagindo com o sulfo-SANPAH.
- Aspire o excesso de sulfo-SANPAH inclinando a placa para coletar o máximo possível da solução. Lave o gel com 50 mM HEPES duas a três vezes.
- Adicione 500 μL e 2 mL para géis de 12 mm e 25 mm, respectivamente, de 50 mg/mL de colágeno que diluí em ácido acético de 0,2% a cada poço contendo o hidrogel. Deixe os géis incubarem durante a noite em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2.
NOTA: Diluir o colágeno I em ácido acético de 0,2% em vez de 50 mM HEPES para promover distribuição homogênea e fixação de colágeno I. - Aspire o colágeno I e lave os géis com PBS estéril três vezes para remover o excesso de colágeno I por 5 min cada lavagem. Incubar os hidrogéis em PBS com soro de 10%, 5% FBS por 2h na incubadora de 37 °C, 5% CO2.
NOTA: A adição de 10% de soro de cavalo promove maior proliferação em relação apenas ao uso de FBS como feito na publicação anterior. - Aspire o meio. Adicione 500 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) com 10% de FBS e 1% penicilina-estreptomicina (P/S) a cada poço. Armazene os géis na incubadora de 37 °C, 5% de CO2 até ficar pronto para a cultura celular.
- Uma vez pronto, prato aproximadamente 1,5 × 104 células O9-1/cm2 em meio basal nos pratos de cultura. Incubar as células por 2 dias em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO2. Verifique se as células estão em busca de confluência para garantir que as células estejam suficientemente ligadas aos géis, e que o número de células é suficiente antes de coletar para análise.
NOTA: Veja o protocolo publicado anteriormente para as etapas de recuperação, passagem e coleta de células O9-120. - Prossiga para as seções 2, 3 ou 4 para análise posterior dos hidrogéis.
2. Análise quantitativa da rigidez via AFM
- Inicie o computador do sistema AFM, seguido pelo controlador AFM (consulte a tabela de materiais).
- Monte o cantilever AFM no suporte da sonda AFM. Use uma cantilever esférica com uma conta de sílica de 0,5 μm montada no final do cantilever (cantilever com contas esféricas).
NOTA: Para hidrogéis mais rígidos, como 10 kPa, 20 kPa e 40 kPa, uma sonda mais rígida foi usada com a constante de mola de 0,24 N/m. Uma sonda mais macia foi utilizada para hidrogéis mais macios, como 0,5 kPa e 1 kPa, com uma constante de mola de 0,059 N/m. - Defina o software AFM sob o modo de contato.
- Monte o wafer de silício no estágio de amostra AFM para coletar curvas de força clicando em Engatar para que o cantilever toque no substrato de silício, gerando assim as curvas de força.
- Use as curvas de força acima (2.4) para calibração, clique em Calibrar no software de controle para obter uma constante média de mola do cantilever em condição de melodia térmica e salve os valores calibrados no software de controle.
- Monte as amostras colocando o deslizamento de tampa com o hidrogel anexado em uma placa de Petri de 60 mm no estágio de varredura AFM. Adicione 3 mL de PBS no prato antes de realizar medições para evitar que o gel seque.
- Defina o AFM para trabalhar no modo de contato (fluido) para iniciar a medição. Engaje a conta esférica para tocar continuamente e levantar da amostra de gel.
- Defina a cantilever para que seu limiar de deflexão permaneça em 10 nm. Mantenha o tamanho de rampa da sonda a 10 μm. Em seguida, registo as curvas de força como no passo 2.4.
- Adquira pelo menos 20 curvas de força de pelo menos 3 a 10 pontos diferentes através da superfície do hidrogel.
- Calcule o módulo médio de Young de ~20 curvas de força para cada ponto com software de imagem e análise AFM. Use curvas de força de rampa estendidas e um modelo linearizado (esférico). Calcule a média de todos os pontos para cada amostra para produzir a rigidez final.
NOTA: O módulo de young e os dados relacionados(ou seja, desvios padrão) são automaticamente salvos como uma planilha. - Repita as etapas 2.6-2.10 para todas as amostras.
3. Análise molecular da rigidez via coloração de imunofluorescência
- Use pinças para transportar o deslizamento de tampas para uma nova placa para minimizar sinais falsos de células cultivadas diretamente na placa. Lave as células com 500 μL de PBS estéril três vezes para remover células mortas e qualquer meio de cultura restante.
- Fixar as células usando 500 μL de 4% de paraformaldeído (PFA) por 10 minutos em temperatura ambiente, sem ser perturbado. Em seguida, relave as células três vezes usando 500 μL de PBS/well por 2 min cada.
NOTA: Armazene a 4 °C para uma parada processual. - Trate as células com 500 μL de 0,1% Triton X-100 por 15 min a temperatura ambiente. Em seguida, lave as células três vezes com 500 μL de PBS/well.
- Bloqueie as células com 250 μL de 10% de soro de burro (diluído em PBS e 0,1% Tween 20) por poço por 30 minutos à temperatura ambiente.
- Incubar as células com 250 μL de anticorpos primários por 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C. Em seguida, lave as células três vezes com 500 μL de PBS/bem por 5 min cada.
NOTA: Anti-Vinculina (Vcl) (1:250) e anti-AP2 alfa (1:250) foram usados neste experimento e foram diluídos em 10% de soro de burro. - Incubar as células com anticorpos secundários correspondentes e/ou faloidina usada para coloração F-actin a uma diluição de 1:400 em 250 μL de soro de burro de 10% para 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, lave as células três vezes com PBS por 5 minutos cada.
NOTA: 568 nm Phalloidin pode ser co-incubado com anticorpos secundários de 488 nm ou 647 nm ou por conta própria. - Incubar as células com 4′,6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI, diluição de 1:1000) em 250 μL de PBS por 10 min seguido de uma última lavagem de PBS por 2 min.
- Adicione 3-4 gotas de meio de montagem para cada poço. Armazene as amostras a 4 °C para definir por pelo menos 2 h antes da imagem para garantir que o meio de montagem esteja bem definido.
- Capture imagens de pelo menos 3 quadros aleatórios por amostra de hidrogel com um microscópio de fluorescência, produzindo canais individuais e mesclados.
4. PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR)
- Transfira os hidrogéis com as células aderentes para a coleta de RNA para uma nova placa para minimizar o RNA indesejado das células ligadas à placa celular. Lave as células com PBS três vezes para remover células mortas e meio de cultura.
- Extrair o mRNA total usando um kit de extração de RNA. Realize a transcrição reversa do RNA para o cDNA usando um supermix de transcrição reversa seguindo as instruções do fabricante.
- Execute o RT-qPCR com primers para Vcl como o marcador de rigidez de escolha e analise usando o método 2-ΔΔCT.
NOTA: Sequência de primer de Vcl: Forward 5' GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; reverter 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.
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Representative Results
Avaliação de preparação e rigidez de hidrogel através da AFM e do modelo Hertz
Aqui, um protocolo detalhado é fornecido para gerar hidrágundos de poliacrilamida de rigidez variada, regulando a razão de acrilamida e biscrilamida. No entanto, os hidrânuis de poliacrilamida não estão prontos para a adesão das células devido à falta de proteínas ECM. Assim, o sulfo-SANPAH, atuando como um linker, se liga covalentemente aos hidrogéis e reage com as aminas primárias das proteínas ECM para permitir a adesão das proteínas ECM às superfícies dos hidrogéis através do éster N-hidroxysuccinimide em sulfo-SANPAH após a ativação uv. O tipo de colágeno I foi usado como a proteína ECM escolhida para promover efetivamente o apego celular O9-1. Para garantir valores precisos de rigidez de diferentes hidrogéis, foi realizada uma avaliação de rigidez utilizando-se AFM, uma técnica bem conhecida para retratar o módulo elástico.
Após a formação bem sucedida e a fixação do hidrogel de poliacrilamida ao deslizamento de tampa de vidro, o gel permaneceu aderente à tampa com uma superfície uniforme e rasgo mínimo. A rigidez foi medida pela AFM com base no princípio da técnica de recuo, em que um recuo rígido foi aplicado à amostra com a força necessária para atingir uma profundidade de recuo26. Com esta medição, o módulo elástico do Young foi calculado com base no recuo de profundidade e força no modelo de Hertz, uma teoria elástica26. No entanto, devido à grande variação nos resultados pela AFM, foi aplicado um método estatístico adicional para obter um resultado quantitativo com impacto mínimo de superfícies irregulares e homogeneidade imperfeita das soluções em gel26. Para produzir uma medição quantitativa utilizando AFM, foi colhida uma compilação de pelo menos 50 curvas de força e distância de cada local na amostra de gel para uma rigidez amostral média. A força aplicada ao gel de alta rigidez foi maior do que a aplicada ao gel mais macio, indicando que um substrato mais rígido produziu uma inclinação mais íngreme no gráfico Force vs. Z, no qual a força é medida em nN, e Z indica a profundidade de recuo entre o recuo e a amostra.
Em hidrogéis macios, a inclinação da curva de força gerada foi suave, pois a força necessária da sonda AFM era menor(Figura 1A). No entanto, em hidrogéis rígidos, como aqueles com o módulo de 40 kPa, a inclinação gerada foi muito mais íngreme, pois a força aplicada era maior do que para géis mais macios(Figura 1B). À medida que a separação entre a sonda e a amostra de hidrogel diminui, a curva aumenta significativamente à medida que a ponta da sonda toca a tampa do vidro. No entanto, à medida que a distância de separação aumenta, a curva se aproxima apenas de 0, pois não há força aplicada presente.
Como mostrado na Figura 1A,o cantilever na sonda AFM aproximou-se do gel, indicado pela linha azul, e a sonda mediu a força aplicada necessária para penetrar a amostra de gel e, eventualmente, alcançar a mancha de vidro, causando um aumento repentino na força. Devido a possíveis erros processuais e instrumentais, como a qualidade das soluções necessárias, a verdadeira rigidez das amostras de hidrogel varia em grande parte e longe da rigidez desejada. Assim, a AFM é uma ferramenta útil para validar e confirmar a metodologia, evitando a apresentação de dados falsos em outros experimentos.
Nesta avaliação da AFM, as cinco amostras de hidrogel preparadas foram medidas através da abordagem quantitativa. O protocolo se concentrou nos níveis de rigidez do hidrogel de 0,5 kPa, 1 kPa, 10 kPa, 20 kPa e 40 kPa, que imitam a amplitude dos níveis biológicos de rigidez do substrato relatados para diferenciação de vários tipos de células. As curvas de força obtidas a partir de medições afm foram utilizadas para gerar o módulo elástico do Young em quilopascals usando um software de algoritmo de análise AFM(Figura 2).
Comparação de sistemas de hidrogel de poliacrilamida e tipos de células
Esta adaptação do protocolo original por Tse e colegas fornece uma abordagem eficiente e eficaz para estudar os aspectos mecanosensíveis do NCC utilizando células O9-120. As modificações no protocolo anterior incluem a modificação da incubação de proteínas ECM: substituição de HEPES de 50 mM por ácido acético de 0,2% e a adição de 10% de soro de cavalo e FBS para cultura celular (etapa 1.3.14-1.3.15). Essas modificações foram validadas comparando o crescimento e manutenção de NCCs O9-1 neste sistema de gel modificado com o do protocolo original (controle). Aqui, nós cultuamos células O9-1 do tipo selvagem em ambos os sistemas de hidrogel com o módulo elástico de 1 kPa e 40 kPa para cada sistema em meio basal. O estado e o desenvolvimento geral do crescimento celular foram visualizados usando um microscópio de luz de campo brilhante para características apoptóticas, morfologia estressada e apego celular aos hidrogéis. As células O9-1 cultivadas no sistema original de gel resultaram em um maior número de células mortas indicadas por um excesso de células redondas (Figura 3E,F) para hidrgel de 1 kPa e 40 kPa.
Em contraste, as células O9-1 cultivadas no sistema de gel modificado apresentaram crescimento celular saudável e apego suficiente ao substrato de hidrogel(Figura 3G,H). Além disso, a compatibilidade das NCCs com o sistema de hidrogel modificado foi avaliada pela realização da coloração IF do marcador NCC, Tcfap2α (AP-2). AP-2 é um fator de transcrição expresso nas linhagens NC para regular o desenvolvimento em embriões de camundongos, tornando-o adequado para avaliar acompatibilidade 27. Embora as células O9-1 tenham crescido em sistemas de hidrogel controlados e modificados ambos expressos AP-2, houve um aumento significativo na expressão AP-2 em células O9-1 banhadas no sistema de hidrogel modificado, como indicado pelo sinal de fluorescência mais forte e pela quantificação correspondente (Figura 4A, B).
Além disso, as células P19 foram utilizadas para validar ainda mais os benefícios do sistema de hidrogel modificado para o crescimento das células. P19 é uma linha celular carcinoma embrionária derivada do teratocarcinoma derivado de embrião no camundongo28. Utilizando o protocolo de cultura correspondente, as células P19 foram cultivadas em sistemas de controle e hidrogel modificados para monitorar características de sobrevivência e crescimento. Imagens de Brightfield revelaram que as células P19 banhadas em ambos os sistemas de hidrogel apresentaram um excesso de células flutuantes redondas e a falta de anexos de substrato celular(Figura 3A-D). Esta observação sugeriu que o protocolo modificado era mais adequado para os NCCs O9-1 estudarem a sinalização mecânica em NCCs.
Visualização de expressão de fibra de alto estresse em substratos rígidos
O hidrogel modificado permitiu a análise quantitativa e qualitativa das diferenças na morfologia das células cultivadas em géis de diferentes níveis de rigidez e outros efeitos. Uma vez que os hidrogéis estavam prontos para semeadura celular, as células O9-1 do tipo selvagem foram passagemdas para hidrogéis de diferentes níveis de rigidez. As células foram monitoradas para sua saúde e crescimento observando sua forma, propagação espacial e até mesmo apego no hidrogel com células mortas mínimas. Alguns estudos têm mostrado um aumento nas fibras de estresse e na adesão celular para MSCs em substratos de alta rigidez, sugerindo que os NCCs cultivados em um substrato mais rígido também apresentariam achados semelhantes em comparação com os NCCs cultivados em substratos mais suaves29,30.
F-actin juntamente com a minocina II, α-actinina e outras proteínas citoesqueletal são conhecidas coletivamente como fibras de estresse31. Estudos anteriores observaram um aumento no conjunto de fibras de estresse em resposta ao aumento da força mecânica31. Em uma ou ambas as extremidades das fibras de estresse, os acessórios ao complexo de adesão focal permitem que as células migrem e aderirem ao ECM31. A coloração da faloina para visualizar a expressão e organização da F-actin nos NCCs demonstrou crescimento celular saudável em resposta à sinalização mecânica(Figura 5). Além disso, as células O9-1 cultivadas em hidrogéis de baixa ou alta rigidez apresentaram diferentes morfologias através de quantidades variadas de fibras de estresse(Figura 5). Semelhante às observações de estudos relatados realizados por meio de MSCs, observou-se que as células O9-1 cultivadas em um substrato mais rígido, 40 kPa, apresentaram mais fibras de estresse e foram bem disseminadas em comparação com células cultivadas em um hidrogel mais macio, indicadas por 1 kPa rigidez29,30.
Avaliação das aderências celulares
Para confirmar ainda a hipótese de que a mudança na rigidez do substrato impacta a adesão ao NCC, as alterações na expressão de Vcl foram medidas quantitativamente via RT-qPCR em NCCs que respondem a diferentes níveis de rigidez de hidrogel. O VCL é uma das inúmeras proteínas citoesqueletal presentes no complexo de adesão focal durante o processo da célula estabelecendo contatos com o substrato e sentindo as propriedades ECM32. Aderências focais são os pontos de contato das células ao ECM através de receptores integrin, que ancoram ao citoplasqueleto de actina citoplasmica, F-actin33 O nível de expressão genética Vcl sugere as mudanças nas aderências focais e aderências celulares das células O9-1 em resposta à rigidez do substrato.
Estudos anteriores mostraram o efeito de Vcl na adesão celular em células-tronco embrionárias e fibroblastos por diferenças em sua expressão. Em resposta à alta expressão de Vcl,o número e tamanhos de aderências focais também aumentou, mas diminuiu quando Vcl foi derrubado34. Consistentemente, as células deficientes de VCLtambém apresentaram uma diminuição significativa na adesão celular e na disseminaçãode 35. Além disso, o Vcl desempenha um papel na regulação da adesão celular, estabilizando as aderências focais36. O tamanho das aderências focais, o nível de maturação e as composições variam de acordo com a rigidez do substrato, permitindo assim que os sinais sejam transduzidos intracelularmente e as células respondam às suas pistas ambientais37. Assim, o Vcl é altamente recrutado para os complexos de adesão focal em células cultivadas em substratos rígidos, como refletido por níveis mais elevados de mRNA detectados por RT-qPCR (Figura 6C).
As células cultivadas em substratos mais suaves formam complexos mínimos de adesão focal, como refletido por níveis mais baixos de mRNA de Vcl nas células15. Na Figura 6C,as células O9-1 apresentaram uma expressão mais elevada de Vcl no substrato rígido do que no substrato macio. Esses resultados sugerem um nível mais alto de aderências de substrato celular de células O9-1 em substratos rígidos do que células O9-1 em substratos mais suaves. Além disso, a expressão Vcl foi qualitativamente visualizada através da coloração IF com um anticorpo anti-Vcl para complementar e apoiar ainda mais a descoberta rt-qPCR. Consistentemente, a expressão Vcl em células O9-1 cultivadas no substrato mais rígido foi maior do que aquelas cultivadas no substrato mais macio (Figura 6A, B), que apoiou ainda mais o achado inicial de alta adesão celular e disseminação no hidrogel de 40 kPa em comparação com o hidrogel 1 kPa observado com a coloração de f-actin phalloidin e níveis de expressão de Vcl via RT-qPCR.
Figura 1: Curvas de força geradas a partir do recuo da sonda AFM. A força (eixo y) indica a força necessária aplicada em nN, e Z (eixo x) indica a distância da sonda Bruker AFM da amostra em μm. Para o hidrogel de 1 kPa(A),a inclinação gerada é suave versus a inclinação mais íngreme observada para o hidrogel de 40 kPa(B). As curvas coloridas representam o movimento do cantilever na sonda AFM à medida que se aproxima (azul) e retrai (vermelho) da amostra de hidrogel. O ponto de partida mais alto da curva indica o contato rígido da tampa de vidro. (B) O grande mergulho na curva retraída no hidrogel de 40 kPa indica adesão entre a conta e a amostra. Abreviação: AFM = microscopia de força atômica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A rigidez média dos hidrogéis (em kPa) calculada a partir do módulo elástico do Young. O módulo do Young foi gerado a partir das curvas de força da Figura 1. Os modulis elásticos referenciados dos hidrogéis foram 0,5 kPa, 1 kPa, 10 kPa, 20 kPa e 40 kPa. As barras de erro indicam desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens de campo brilhante de células P19 e O9-1 banhadas em hidrogéis de 1 kPa e 40 kPa de sistemas de controle e gel modificados para detectar características de crescimento celular. (A-D) P19 e (E-H) células O9-1; células mortas são indicadas por setas vermelhas. Barras de escala = 25 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Mancha de imunofluorescência do marcador NCC AP-2 em NCCs O9-1 para visualizar a compatibilidade NCC. (A) Um sistema de hidrogel modificado de 40 kPa em comparação com (B) um controle de 40 kPa. AP-2 (verde); os núcleos estavam manchados com DAPI (azul). Barras de escala = 25 μm. (C) O gráfico da barra fornece quantificação do nível de expressão AP-2 mostrando significância(p-valor = 0,003) (n = 3). Os dados mostram a expressão relativa com barras de erro de desvio padrão fornecidas. Abreviaturas: NCC = célula de crista neural; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenildole. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Mancha de faloideina fluorescente de F-actin mostrando fibras de estresse que estão bem espalhadas em células O9-1 no hidrogel de 40 kPa. As células O9-1 foram cultivadas em hidrogéis de 1 kPa(A)e 40 kPa(B). As células O9-1 foram manchadas usando Alexa Fluor 488 Phalloidin (verde), e os núcleos foram manchados com DAPI (azul). Barras de escala = 25 μm. Abreviação: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilôle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Imagens de imunofluorescência de vinculina em células O9-1. As células O9-1 foram banhadas em hidrogéis de 1 kPa(A)e 40 kPa(B). Os núcleos estavam manchados com DAPI (azul). Barras de escala = 25 μm. (C) Análise quantitativa de PCR em tempo real do nível total de mRNA de Vcl em células O9-1 cultivadas em hidrogéis de 1 kPa e 40 kPa. O nível de expressão Vcl no hidrogel de 1 kPa é significativamente menor do que no hidrogel de 40 kPa (p-valor = 0,02). Os dados mostram a média com barras de erro de desvio padrão fornecidas. Abreviação: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilôle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Volume total de 500 μL | 0,5 kPa | 1 kPa | 10 kPa | 20 kPa | 40 kPa | ||
| 40% de acrilamida (μL) | 37.5 | 62.5 | 125 | 100 | 100 | ||
| 20% Bis-acrilamida (μL) | 15 | 7.5 | 25 | 66 | 120 | ||
| H2O (μL) | 447.5 | 430 | 350 | 334 | 280 | ||
| APS 10% (μL) | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | ||
| TEMED (μL) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | ||
Tabela 1: Volumes correspondentes de soluções para obter os níveis de rigidez desejados.
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Discussion
O objetivo do presente estudo é fornecer um sistema in vitro eficaz e eficiente para entender melhor o impacto dos sinais mecânicos nos NCCs. Além de seguir o protocolo passo-a-passo mencionado acima, os pesquisadores precisam ter em mente que a cultura celular dos NCCs O9-1 é afetada pelo tipo de tampas de vidro usadas para preparar hidrogéis. Por exemplo, observou-se que as células semeadas em um tipo específico de mancha de vidro (ver a Tabela dos Materiais) sobreviveram e proliferaram bem, enquanto células cultivadas semeadas em outros tipos de tampas de vidro mostraram mais morte celular. Além disso, é importante seguir rigorosamente as condições corretas de cultura celular para O9-1 NCCs38. A qualidade da cultura celular é ótima quando os hidrogéis são usados o mais rápido possível ou armazenados em uma incubadora estéril de 37 °C por até dois dias.
Devido à sensibilidade de cada componente no protocolo, o moduli elástico pode variar entre os experimentos. Além dos pontos mencionados no protocolo (etapa 1.3.2) em relação a 10% de APS, outros fatores críticos a serem considerados também afetam a variação. Outro fator suspeito de causar grandes variações nas medições da AFM foi a espessura dos hidrogéis. Um estudo anterior havia investigado o efeito da espessura no moduli do Jovem, variando de 15 a 1000 μm, e descobriu que as diferenças de espessura não alteraram significativamente o moduli do Jovem39. No entanto, a espessura dos substratos também afeta as propriedades mecânicas que as células podem sentir, levando a diferentes morfologias40,41,42. Vários estudos mostraram que um aumento significativo na espessura dos hidrogéis levou a uma diminuição na área celular, espalhando-se e efetividade da rigidez dos hidrogéis40,41,42. No entanto, os fenótipos das células também mudam em resposta a hidrogéis significativamente finos, por exemplo, maior espalhando-se mesmo em hidrogéis de baixa rigidez40,41,42. Com um volume consistente de géis de poliacrilamida, a espessura dos hidrogéis deve ser uniforme para que pequenos desvios não afetem significativamente o módulo elástico nas medidas afm.
É melhor esterilizar tampas passando-as para frente e para trás na chama usando um queimador de álcool porque outros métodos de esterilização podem ser mais complicados e causar danos potenciais às tampas de vidro. Diferentes tamanhos de tampas de vidro podem ser usados com base em requisitos experimentais. Este protocolo utilizou tampas de 12 mm e 25 mm para imunohistoquímica e RT-qPCR, respectivamente. O uso de géis de tamanho adequado para se adequar aos experimentos incentiva a eficiência e minimiza o desperdício. Essas modificações foram validadas qualitativa e quantitativamente para garantir a otimização para NCCs O9-1 em comparação com o sistema original (controle) de hidrogel20. A saúde geral e o crescimento dos NCCs O9-1 foram avaliados sob um microscópio de campo brilhante para características de apego celular e substrato.
Além disso, a compatibilidade das células O9-1 foi comparada entre os sistemas de controle e hidrogel modificados para validar ainda mais as modificações neste protocolo, visualizando qualitativamente a expressão AP-2 usando a coloração IF. A intensidade dos sinais foi quantificada para apoiar ainda mais as imagens representativas da expressão AP-2 em células O9-1 entre o controle versus os sistemas de hidrogel modificados. Embora o AP-2 seja um marcador NCC comum, outros marcadores conhecidos devem ser considerados para validação, como Sox10 e Pax3, devido à sua significância para a manutenção ncc de pluripotência e sobrevivência28. Além disso, a otimização neste protocolo foi ainda confirmada comparando as células O9-1 NC com outra linha celular, P19, para garantir que este sistema de hidrogel seja eficiente e confiável para as células NC. Embora as células P19 tenham características imortais e sejam facilmente cultivadas, elas não prosperaram bem em nenhum dos sistemas de hidrogel.
A resistência à força alongadora gerada a partir do substrato ou rigidez tecidual onde as células se prendem é frequentemente expressa como o módulo elástico de Young45. Com o AFM, o módulo elástico do Young é obtido a partir da curva de força gerada a partir da força vertical aplicada26. Grandes variações podem ocorrer durante a medição do AFM, entre medições que podem levar a leituras imprecisas para os hidrogéis mais rígidos. A inconsistência pode ser causada por sondas inadequadas utilizadas para medição. Por exemplo, a medição de hidrogéis de 20 kPa e 40 kPa requer o uso de uma sonda mais rígida com uma constante de mola mais alta (k = 0,24 N/m). Uma sonda mais rígida permite uma resolução mais baixa em comparação com uma sonda mais macia; no entanto, há razões para favorecer a escolha de uma sonda mais rígida, pois cantilevers muito macios poderiam aderir às amostras46. Além disso, sondas muito macias são altamente sensíveis, contribuindo para sinais falsos de partículas indesejadas e resultando em valores de rigidez artificialmente menores ou mais altos do que a verdadeira rigidez46. Além disso, deve-se notar uma entrada precisa da razão de Poisson, dependendo do material de medição; isso pode ser encontrado em estudos padronizados, pois isso afeta significativamente a produção de dados.
Além disso, a AFM foi utilizada para medir a espessura dos hidrogéis, pois a espessura é outra propriedade mecânica que afeta a forma como as células sentem seu ambiente47,42. Em vários estudos relatados, as células cultivadas em hidrogéis macios são observadas em forma redonda em e além da "espessura crítica", que é relatada em ~2-5 μm, dependendo da célula tipo47,42,48. No entanto, observou-se uma disseminação muito maior quando as células foram banhadas em hidrogéis da mesma rigidez, mas de espessura inferior à "espessura crítica"42,48. Uma explicação potencial para este achado interessante é que a espessura subcrítica dos hidrogéis permite que as células sentem as rígidas tampas de vidro subjacentes à medida que as células exercem tração para deslocamento lateral47. A espessura média entre os hidrogéis de rigidez foi de 342 μm com um desvio padrão de 27 μm. A espessura dos hidrogéis foi maior do que a "espessura crítica" sugerida, e dentro da faixa de teste inferior a 400 μm, o que foi relatado em estudos e os hidrogéis pré-fabricados fabricados, de modo que as células pudessem sentir a rigidez diferente dos hidrogéis e não as tampas de vidro rígidas subjacentes42,48.
Além do método de análise quantitativa afm, os hidrogéis também foram qualitativamente analisados através da imunohistoquímica para estudar a expressão dos marcadores afetados pela rigidez variável nas células O9-1 e visualizar o crescimento saudável das células. F-actin no citoplasma está ligado aos integrins ligados à membrana através de um conjunto de proteínas citoesqueletal, como talina e Vcl, formando o complexo de adesão focal33. A expressão das fibras de estresse nas células também poderia ser analisada medindo a expressão de outros genes citoesqueléticos em células, como talina e integrin, que poderiam ser visualizadas juntas usando o kit de coloração de aderência focal.
Havia diferentes graus de rigidez de hidrogel que influenciaram a morfologia e a resposta do NCC, como visto na mudança na adesão celular e fibras de estresse através da sinalização mecânica. Este protocolo oferece a capacidade de influenciar a diferenciação celular em vários tipos de células modificando as condições de cultura correspondentes in vitro,fornecendo assim um método conveniente de manipulação de sinais mecânicos e sinais químicos em NCCs. Como mencionado anteriormente, o destino da diferenciação do NCC é em grande parte guiado por forças mecânicas presentes no tecido circundante, incluindo sua rigidez2,3. Enquanto o objetivo imediato deste artigo era desenvolver um protocolo passo a passo para preparar hidrogéis para a cultura NCC, os benefícios potenciais deste protocolo vão além da metodologia, buscando maior conhecimento da sinalização mecânica em NCCs. Também vale a pena notar que este sistema in vitro tem algumas limitações. Esta técnica de fabricação de hidrogéis compreende múltiplas etapas que podem potencialmente introduzir variações técnicas ao longo do caminho, incluindo heterogeneidade, superfície irregular e rigidez imprecisa. Portanto, os usuários devem executar essas etapas cuidadosamente para minimizar as variações técnicas durante os experimentos. Além disso, os géis de poliacrilamida neste sistema limitaram os estudos à cultura 2D devido à toxicidade da acrilamida, ignorando o ambiente biológico 3D preciso que as NCCs habitam50.
Apesar dessas restrições, este sistema in vitro permite um método barato e simples, beneficiando todos os níveis de pesquisa e permitindo que os pesquisadores realizem testes suficientes e funcionais a jusante. Como visto em descobertas recentes, as DCNT dependem fortemente tanto da sinalização mecânica, como força de cisalhamento e rigidez do substrato, quanto da sinalização química, como a sinalização do fator de crescimento do WNT e do fibroblasto, no craniofacial, bem como do desenvolvimento cardíaco em vertebrados6,15. Usando este protocolo, os microambientes locais para experimentos in vitro podem ser facilmente imitados para estudos futuros sobre NCCs, incluindo diferenciação, migração, respostas celulares e o potencial de progressão prejudicial da doença. Portanto, este sistema in vitro será uma poderosa ferramenta para estudar os papéis da sinalização mecânica em NCCs e suas interações com outras vias de sinalização, o que aprofundará a compreensão dos mecanismos moleculares e genéticos do desenvolvimento do NCC e doenças relacionadas.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos à Dra. Ana-Maria Zaske, operadora da instalação Atomic Force Microscópio-UT Core no Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Texas, pela expertise em AFM neste projeto. Agradecemos também às fontes de financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 e R01HL142704 a J. Wang).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-012 | |
| 2% Bis-Acrylamide | Sigma Aldrich | M1533 | |
| 24-well plate | Greiner Bio-one | 662165 | |
| 25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-025 | |
| 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | A3648 | |
| 4-well cell culture plate | Thermo Scientific | 179830 | |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | J61899-AP | |
| 40% Acrylamide | Sigma Aldrich | A4058 | |
| 50% glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G7651 | |
| 6-well cell culture plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| AFM cantilever (spherical bead) | Novascan | ||
| AFM software | Catalyst NanoScope | Model: 8.15 SR3R1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 248614 | Powder |
| anti-AP-2α Antibody | Santa Cruz | sc-12726 | |
| anti-Vinculin antibody | Abcam | ab129002 | |
| Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst | Bruker Corporation | ||
| Collagen type I (100mg) | Corning | 354236 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dichloromethylsilane (DCMS) | Sigma Aldrich | 440272 | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fluorescence microscope | Leica | Model DMi8 | |
| Fluoromount-G mounting medium | SouthernBiotech | 0100-35 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Powder |
| Horse serum | Corning | 35-030-CI | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
| Penicillin-Streptomycin antibiotic | Thermo Fisher | 15140148 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| Sterile 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
| Sterile deionized water | Hardy Diagnostics | U284 | |
| sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
| SYBR green | Applied Biosystems | 4472908 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
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