Isolatie van actief caenorhabditis elegans nucleair extract en reconstitutie voor in vitro transcriptie

Summary

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het isoleren van actief nucleair extract uit larvale stadium 4 C. elegans en het visualiseren van transcriptieactiviteit in een in vitro systeem.

Abstract

Caenorhabditis elegans is sinds de introductie in 1963 een belangrijk modelsysteem voor biologisch onderzoek. C. elegans is echter niet volledig gebruikt in de biochemische studie van biologische reacties met behulp van zijn nucleaire extracten zoals in vitro transcriptie en DNA-replicatie. Een belangrijke hindernis voor het gebruik van C. elegans in biochemische studies is het verstoren van de dikke buitenste cuticula van de nematode zonder de activiteit van het nucleaire extract op te offeren. Hoewel verschillende methoden worden gebruikt om de nagelriem te breken, zoals Dounce-homogenisatie of ultrasoonapparaat, leiden ze vaak tot eiwitinstabiliteit. Er zijn geen vastgestelde protocollen voor het isoleren van actieve nucleaire eiwitten uit larven of volwassen C. elegans voor in vitro reacties. Hier beschrijft het protocol in detail de homogenisatie van larvale stadium 4 C. elegans met behulp van een Balch-homogenisator. De Balch-homogenisator gebruikt druk om de dieren langzaam door een smalle opening te dwingen die de cuticula breekt tijdens het proces. Het uniforme ontwerp en de nauwkeurige bewerking van de Balch-homogenisator maken een consistente slijping van dieren tussen experimenten mogelijk. Fractionering van het homogenaat verkregen uit de Balch-homogenisator levert functioneel actief nucleair extract op dat kan worden gebruikt in een in vitro methode voor het testen van de transcriptieactiviteit van C. elegans.

Introduction

De kleine, vrijlevende nematode Caenorhabditis elegans is een eenvoudig maar krachtig modelorganisme voor het aanpakken van een breed scala aan biologische vragen. Sinds de introductie in 1963 zijn de nematoden van onschatbare waarde geweest voor het beantwoorden van vragen in neurobiologie, metabolisme, veroudering, ontwikkeling, immuniteit en ^genetica1. Enkele van de vele kenmerken van het dier die het een ideaal modelorganisme maken, zijn korte generatietijd, de effectiviteit van RNA-interferentie, transparant lichaam en de voltooide kaarten van zowel de cellulaire afstamming als het zenuwstelsel.

Hoewel de bijdragen van de nematode aan de wetenschap enorm zijn, zijn ze onderbenut om het eukaryote transcriptiesysteem op te helderen, waarbij het grootste deel van ons begrip over deze mechanismen afkomstig is van studies met nucleair extract uit gist, fruitvlieg en zoogdiercelcultuur2. De grootste hindernis die onderzoekers ervan weerhoudt om functioneel nucleair extract te extraheren, is de taaie buitenste cuticula van de nematode. Dit exoskelet bestaat uit verknoopte collageen, cuticlinen, glycoproteïnen en lipiden, waardoor C. elegans van larvaal stadium tot volwassenheid resistent zijn tegen eiwitextractie via chemische of mechanische ^krachten3. Een in vitro transcriptiesysteem met C. elegans nucleair extract werd ooit ontwikkeld, maar niet op grote schaal toegepast vanwege de beperkte reikwijdte van het systeem, en het gebruik van Dounce-homogenisator voor het bereiden van het extract zou kunnen leiden tot ^{eiwitinstabiliteit4,5}.

In tegenstelling tot het vorige protocol voor nucleaire extractisolatie, waarbij een Dounce-homogenisator werd gebruikt om C. elegans te breken, gebruikt dit protocol een Balch-homogenisator. De Balch homogenisator bestaat uit twee hoofdcomponenten: een wolfraamcarbide kogel en een roestvrijstalen blok met een kanaal dat van het ene uiteinde naar het andere wordt geboord. De Balch-homogenisator wordt geladen met de wolfraamcarbidekogel en aan weerszijden afgedekt om de maalkamer af te dichten. Spuiten kunnen worden geladen op de twee verticale poorten die naar de slijpkamer leiden. Terwijl het materiaal door de slijpkamer van de ene spuit naar de andere wordt geleid, dwingt de druk van de spuiten het materiaal door een smalle opening tussen de bal en de wand van de kamer. Deze langzame en constante druk breekt het materiaal totdat het een consistente grootte bereikt die gemakkelijk door de smalle opening kan gaan. Door C. elegans via een constante maar zachte druk door de smalle opening te dwingen, breken de dieren open, waardoor hun inhoud in de omringende buffer vrijkomt. Het wisselen van kogelgroottes maakt de opening verder strakker, waardoor de nieuw vrijgegeven cellen worden gebroken en de kernen in de buffer worden bevrijd. Meerdere gevallen van centrifugatie scheiden de kernen van de rest van het celpuin, waardoor een schoon nucleair extract kan worden verzameld. De Balch-homogenisator heeft om verschillende redenen de voorkeur boven de Dounce-homogenisator: het systeem kan een groot aantal dieren aan, waardoor het mogelijk is om in één keer een grote hoeveelheid actieve eiwitten te extraheren; de nauwkeurige bewerking van de kogels en het stalen blok maakt consistent slijpen tussen meerdere monsters mogelijk; het zware stalen blok fungeert als een koellichaam en trekt gelijkmatig warmte weg van de slijpkamer, waardoor denaturering wordt voorkomen.

Na isolatie moet de transcriptionele activiteit van het nucleaire extract worden geverifieerd voordat het in biochemische experimenten wordt gebruikt. Traditioneel werd transcriptieactiviteit gemeten met behulp van radioactief gelabelde nucleotiden om het nieuw gesynthetiseerde RNA te volgen en te visualiseren. Radioactieve etikettering kan echter belastend zijn omdat het voorzorgsmaatregelen vereist tijdens gebruik en ^{verwijdering6}. Technologische vooruitgang stelt onderzoekers tegenwoordig in staat om veel minder schadelijke of lastige methoden te gebruiken om zelfs kleine RNA-hoeveelheden te meten met behulp van technieken zoals kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR)⁷. Hier beschrijft het protocol een methode om actief nucleair extract te isoleren uit larvale stadium 4 (L4) C. elegans en transcriptieactiviteit in een in vitro systeem te visualiseren.

Protocol

1. Mediavoorbereidingen

1. Bereid steriele lysogeniebouillon (LB) agarplaten en vloeibare media volgens de instructies van de fabrikant.
2. Streak Escherichia coli (E. coli) stam OP50 op een LB agarplaat. Incubeer de bacteriestreak bij 37 °C 's nachts.
3. Bewaar de E. coli OP50 streepplaat bij 4 °C na incubatie. De E. coli OP50 plaat kan veilig worden bewaard bij 4 °C gedurende 2 weken indien verpakt in parafilm om vochtverlies te voorkomen.
4. Bereid 2 L Nematode Growth Media (NGM) met behulp van het recept in tabel 1.
   OPMERKING: Nystatine is optioneel. Nystatine helpt voorkomen dat schimmel en andere schimmelverontreinigingen op de NGM-platen groeien. De grote platen met een diameter van 150 mm hebben een grotere kans om schimmelsporen op te vangen wanneer het deksel wordt verwijderd voor het gieten en zaaien van E. coli OP50. Nystatine kan worden gekocht voorgemengd in steriele oplossing van leveranciers bij 10.000 eenheden / ml of kan worden gekocht als een steriel poeder en gemengd met steriel water. Nystatine kan niet worden geautoclaveerd, noch kan het effectief worden gesteriliseerd. Aandacht voor de aseptische techniek is cruciaal bij het mengen van een oplossing van nystatine in het laboratorium. Autoclaaf 1 M _CaCl2, 1 M _KPO4 pH 6,0 en 1 M _MgSO4 bij 121 °C gedurende 15 min. Filter steriliseer cholesterol door een filter van 0,22 μm na te zijn opgelost in 95% ethanol.
5. Na het toevoegen van de reagentia aan de media, giet NGM in veertig petrischalen van 150 mm. Elke schaal van 150 mm heeft 50 ml nodig om te vullen. Laat de NGM-platen een nacht afkoelen bij kamertemperatuur.
6. Ent twee conische buisjes van 50 ml met 25 ml steriele LB met E. coli OP50 uit de vorige streepplaat. Incubeer de bouillon bij 37 °C gedurende 24 uur in een schudincubator die op 200 tpm wordt gehouden.
   OPMERKING: Voor consistentie, ent beide buizen met dezelfde enkele kolonie van de streepplaat. Als dit moeilijk blijkt, ent u 5 ml steriele LB met een enkele kolonie in een conische buis van 50 ml en incubeer de cultuur gedurende 16 uur bij 37 °C in een schudincubator die de dag voor het bereiden van de NGM-platen op 200 tpm wordt gehouden. Bewaar de verse vloeibare cultuur bij 4 °C gedurende maximaal twee dagen. Ent de twee 25 ml bouillon met 25 μL vloeibare cultuur en incubeer onder dezelfde omstandigheden als hierboven vermeld.
7. Zaai verse NGM-platen met 1 ml verse E. coli OP50 vloeibare cultuur en verspreid met een vlam gesteriliseerde spreader gelijkmatig over het oppervlak van de plaat aseptisch om een groot bacteriegazon te creëren dat het grootste deel van de plaat bedekt, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de bacteriën niet van rand tot rand worden verspreid. Laat de E. coli OP50 groeien bij kamertemperatuur gedurende 72-96 uur of totdat er een zichtbaar dik gazon verschijnt.
   OPMERKING: Verplaats na 24 uur de vers gezaaide NGM-platen naar een afgedekte container om vochtverlies te verminderen en de levensduur van de platen te verlengen.

2. Dierpreparaten en bleeksynchronisatie

1. Breng 5 goed gevoede, wild-type, gravid volwassen C. elegans over op elk van de 10 verse NGM-platen gezaaid met E. coli OP50, voor een totaal van 50 dieren.
2. Laat de dieren eieren leggen. Laat de nakomelingen groeien bij 20 °C totdat ze het gravid volwassen stadium bereiken.
3. Gebruik 15 ml M9-buffer (tabel 2) om de nieuwe goed gevoede wildtype, gravid volwassenen van de tien onderhoudsplaten te verzamelen en de dieren over te brengen naar een gelabelde conische buis van 15 ml.
4. Centrifugeer de dieren gedurende 3 minuten op 1.000 x g om alle dieren op de bodem van de buis te pelleteren.
5. Meng in een aparte, gelabelde conische buis van 15 ml 2 ml bleekmiddel met 5 ml 1 N NaOH voor bleeksynchronisatie. Vortex de oplossing om grondig te mengen.
   OPMERKING: Gebruik het bleekmiddel + NaOH-oplossing dezelfde dag dat het is voorbereid om effectief te zijn.
6. Verwijder het supernatant voorzichtig van de gecentrifugeerde dieren met behulp van een steriele pipet van 10 ml. Probeer zoveel mogelijk M9-buffer te verwijderen om het breken van dieren te verbeteren.
7. Voeg 500 μL van het bleekmiddel + NaOH-oplossing toe aan de dierlijke pellet en start een timer gedurende 4 minuten.
8. Met de hand of met behulp van een rocker, schommel de buis voorzichtig om de dierlijke pellet volledig te breken en laat de dieren vrij bewegen in de bleekmiddel + NaOH-oplossing. Blijf de buis schommelen gedurende de hele duur van 4 minuten.
   OPMERKING: De benodigde hoeveelheid bleekmiddel + NaOH-oplossing kan variëren afhankelijk van de grootte van de dierlijke pellet die wordt gesynchroniseerd. Optimaliseer deze techniek vooraf met verschillende hoeveelheden dieren en bleekmiddel + NaOH-oplossing.
9. Controleer na 4 minuten de breekefficiëntie onder een dissectiemicroscoop. Zorg ervoor dat een meerderheid van de gravid volwassen dieren wordt gebroken en dat hun interne inhoud vrijkomt, inclusief de eieren.
10. Als de dieren niet zijn opengebroken, vortex dan kort de buis op maximale snelheid en controleer vervolgens opnieuw onder de microscoop.
    OPMERKING: Hoewel de eieren resistent zijn tegen het bleekmiddel + NaOH-oplossing, zijn ze niet ondoordringbaar. Eieren mogen niet langer dan nodig aan het bleekmiddel + NaOH-oplossing worden blootgesteld. Te lang stilstaan tijdens de breekstap van het dier kan leiden tot ontwikkelingsproblemen voor het nageslacht.
11. Voeg 10 ml van de M9-buffer toe aan de gebroken dierlijke oplossing.
12. Centrifugeer de eieren en de resten bij 1.000 x g gedurende 3 min.
13. Pipetteer het bovennatuurlijke middel weg en zorg ervoor dat u de nieuwe pellet met alle eieren op de bodem van de buis niet aanraakt.
14. Voeg nog eens 10 ml van de M9-buffer toe en centrifugeer opnieuw gedurende 3 minuten bij 1.000 x g.
15. Herhaal stap 2.13-2.14 nog twee keer om ervoor te zorgen dat er geen bleekmiddel + NaOH-oplossing overblijft.
16. Verwijder na de derde M9-bufferwas het supernatant en voeg 10 ml van de S-basale buffer toe (tabel 2).
17. Keer de buis om om de pellet aan de onderkant te breken om de eieren gelijk in de buffer te laten zweven.
18. Plaats de buis op een wip en schommel de buis voorzichtig gedurende 22 uur bij 20 °C om de eieren te laten uitkomen en larvale stadium 1 (L1) arrestatie te bereiken.
19. Centrifugeer na 22 uur de buis met gesynchroniseerde L1-dieren gedurende 3 minuten bij 1000 x g.
20. Pipetteer en gooi het supernatant weg en laat ongeveer 1 ml buffer in de buis achter.
21. Verstoor met behulp van een micropipette de dierlijke pellet om een homogene suspensie van L1-dieren in de resterende buffer te maken.
22. Breng een enkele druppel van de homogene suspensie van L1-dieren over op een gelabelde NGM-plaat van 150 mm, gezaaid met E. coli OP50.
23. Bereken de dierdichtheid per druppel door het aantal L1-dieren per druppel visueel te tellen met behulp van een dissectiemicroscoop. Een 150 mm NGM-plaat met een volgroeid gazon van E. coli OP50 kan tot 500 dieren van het L1-stadium ondersteunen om het gravid volwassen stadium te bereiken.
24. Breng de L1-dieren over op zes 150 mm NGM-platen met E. coli OP50. Zorg ervoor dat u de plaat niet overbelast.
    OPMERKING: Als het onduidelijk is of de dieren voldoende voedsel hebben voor ontwikkeling tussen L1 en gravid volwassen, voeg dan minder dieren toe aan elk bord en gebruik meer borden.
25. Laat de dieren 72 uur bij 20 °C groeien totdat ze het gravid volwassen stadium bereiken en beginnen met het leggen van eieren.
26. Voer een tweede ronde bleeksynchronisatie uit op de gesynchroniseerde, goed gevoede wildtype gravid volwassen dieren.
27. Plaats de gesynchroniseerde L1-dieren op tien 150 mm NGM-platen gezaaid met E. coli OP50, met ongeveer 1.000 dieren per plaat.
28. Laat de nieuwe gesynchroniseerde L1-dieren 48 uur bij 20 °C groeien totdat ze het L4-stadium bereiken.
    OPMERKING: Het doel is om een pellet van ongeveer 700 - 800 μL L4-dieren te verkrijgen. Te veel dieren kunnen het moeilijk maken om de Balch-homogenisator te gebruiken; dit kan leiden tot spierspanning tijdens het bedienen van de homogenisator en mogelijke lekkage uit de spuiten als gevolg van de verhoogde druk.

3. Balch homogenisator bereiding

1. Bereid zowel hypotone als hypertone buffers voor zoals vermeld in tabel 3 en tabel 4.
   OPMERKING: De hypotone en hypertone buffers kunnen van tevoren worden voorbereid en veilig worden opgeslagen bij 4 °C.
2. Reinig de Balch-homogenisator door de maalkamer te overspoelen met 70% ethanol en spoel vervolgens de kamer af met gedeïoniseerd water om overtollige ethanol te verwijderen.
   OPMERKING: Vermijd het gebruik van bijtende middelen om de Balch-homogenisator te reinigen. Grondig spoelen met ethanol en gedeïoniseerd water zou voldoende moeten zijn om het te reinigen.
3. Plaats de wolfraamcarbidekogel van 7,9820 mm (18 μm spleetspeling) in de slijpkamer.
4. Sluit elk uiteinde van de loop van de Balch-homogenisator af en zet de doppen vast met de meegeleverde duimschroeven.
5. Bereid 5 ml 'complete hypotone buffer' per monster voor: voeg 5 μl 1 M DTT (eindconcentratie: 1 mM DTT) en 100 μL 100x proteaseremmer toe, cocktail voor eenmalig gebruik (eindconcentratie: 2x). Houd de buffer op ijs.
6. Bereid 5 ml 'complete hypertone buffer' per monster voor: voeg 5 μL 1 M DTT (eindconcentratie: 1 mM DTT) en 100 μL 100x proteaseremmer, cocktail voor eenmalig gebruik (eindconcentratie: 2x) toe. Houd de buffer op ijs.
   OPMERKING: Gebruik de volledige hypotone en hypertone buffer op dezelfde dag van bereiding. Bewaar het niet voor later gebruik. Bewaar 1 M DTT als aliquots voor eenmalig gebruik bij -20 °C. Bewaar de proteaseremmer cocktail voor eenmalig gebruik bij 4 °C.
7. Vul een steriele spuit van 2 ml met 1 ml 'complete hypotone buffer' en spoel voorzichtig de maalkamer van de Balch-homogenisator. Laat ongeveer 500 μL 'volledige hypotone buffer' in de kamer.
8. Bewaar de gespoelde homogenisator op ijs en laat 30 min afkoelen.
   OPMERKING: De homogenisator moet ijskoud zijn voordat de dieren worden vermalen. Het maalproces kan door wrijving warmte produceren en de nucleaire eiwitten denatureren. Zorg ervoor dat de metaalhomogenisator ijskoud is om dit te voorkomen. Zorg ervoor dat u voorkomt dat er water uit het omringende ijs in de homogenisator komt. Gebruik twee steriele spuiten om de gaten in de homogenisator te dichten en te voorkomen dat onbedoelde vloeistoffen de maalkamer binnendringen.

4. Verzamelen van dieren

OPMERKING: Er is een beknopte naslaggids beschikbaar met de belangrijkste stappen voor het verzamelen, verstoren en fractioneren van de dieren (figuur 1).

1. Verzamel de goed gevoede L4-dieren met M9-buffer in een conische buis van 15 ml en centrifugeer de dieren gedurende 3 minuten bij 1000 x g . Verwijder het supernatant en ga door met het wassen van de dierlijke pellet totdat het supernatant helder is.
2. Was de dieren met een hypotone buffer van 3 ml van 4 °C en centrifugeer opnieuw bij 1000 x g gedurende 3 minuten.
   OPMERKING: Tijdens de laatste wasbeurt met de hypotone buffer van 4 °C kunnen de dieren aan de zijkant van de buis blijven plakken. Dit is normaal en kan resulteren in een klein verlies van dieren tijdens het verwijderen van het supernatant.
3. Verwijder de hypotone buffer en voeg 1 ml "complete hypotone buffer" toe aan de dierlijke pellet. Breng de dierlijke suspensie over in een nieuwe steriele spuit van 2 ml.
   OPMERKING: Pipetteer tijdens het overbrengen van de dieren naar de spuit met behulp van een micropipette voorzichtig een steriele 0,1% Tween20-oplossing om de binnenkant van de pipetpunt te coaten om het aantal dieren te verminderen dat verloren gaat als gevolg van het plakken aan de pipetpuntwanden.

5. Fractionering

1. Homogeniseer de dieren op ijs door de dieren voorzichtig door de maalkamer van de Balch-homogenisator geladen met de 7.9820 mm-kogel en in een nieuwe steriele spuit te duwen. Herhaal het duwen van de dieren door de maalkamer gedurende 30 volledige cycli.
   OPMERKING: Een 'volledige cyclus' wordt gedefinieerd als de volledige op- en neergaande beweging van de zuiger van een spuit.
   Deze slijpstap maakt gebruik van 7.9820 mm kogellager (18 μm kogellager).
2. Verwijder na 30 cycli zoveel mogelijk van de dierlijke suspensie uit de Balch-homogenisator en bewaar de spuit, punt naar beneden in een microbuis van 1,7 ml.
3. Verwijder de kogel van 7,9820 mm uit de maalkamer en reinig deze met gedeïoniseerd water. Droog en breng de bal terug naar de gelabelde buis.
4. Steek de kogel van 7,9880 mm (12 μm spleetspeling) in de maalkamer en sluit de homogenisator opnieuw.
5. Spoel de maalkamer opnieuw door met 1 ml ijskoude 'complete hypotone buffer'.
6. Maal de suspensie gedurende 25 volledige cycli.
7. Verwijder na 25 cycli de dierlijke suspensie uit de Balch-homogenisator, breng de suspensie over in een schone microbuis van 1,7 ml en bewaar deze op ijs.
   OPMERKING: Demonteer en reinig de Balch homogenisator met 70% ethanol en gedeïoniseerd water. Zorg ervoor dat u de kogel van 7,9880 mm terugbrengt naar de juiste buis.
8. Pelleteer de dierenlichamen en het puin door de suspensie gedurende 5 minuten te centrifugeren bij 500 x g, 4 °C.
9. Pipetteer 40 μL van het supernatant naar een buis met het label 'ingangsfractie' en bewaar deze op ijs.
   OPMERKING: Schrijf alle etiketten met een alcoholbestendige pen om te voorkomen dat ze later worden uitgesmeerd.
10. Breng het resterende supernatant over in een nieuwe buis van 1,7 ml, zorg ervoor dat de pellet niet op de bodem van de buis wordt aangeraakt en gooi de pellet vervolgens weg.
11. Centrifugeer het supernatant om de kernen te pelleteren bij 4.000 x g, 4 °C gedurende 5 minuten.
12. Breng het supernatant, voorzichtig om de gepelleteerde kernen niet te verstoren, over in een nieuwe buis van 1,7 ml en label de buis als 'cytosolische fractie'.
    OPMERKING: Centrifugeer de cytosolische fractie verder bij 17.000 x g, 4 °C gedurende 30 minuten om het resterende onoplosbare materiaal te verwijderen en gebruik het als een negatieve controle voor western blots (specifiek voor nucleaire eiwitten).
13. Was de kernpellet met 500 μL 'complete hypotone buffer' en breng de pellet over in een nieuwe buis van 1,7 ml. Centrifugeer de gesuspendeerde pellet bij 4.000 x g, 4 °C gedurende 5 minuten.
14. Gooi het supernatant weg en voeg 500 μL verse 'complete hypotone buffer' toe aan de nucleaire pellet en breng de suspensie over in een nieuwe buis van 1,7 ml. Centrifugeer het monster opnieuw bij 4.000 x g, 4 °C gedurende 5 minuten.
15. Verwijder het supernatant en los de pellet op in 40 μL 'complete hypertone buffer'. Breng de nieuwe nucleaire suspensie over in een nieuwe buis van 1,7 ml, label de buis als 'kernfractie' en bewaar deze op ijs.
16. Bepaal de eiwitconcentratie van de drie fracties met behulp van een fluorescerende kwantificeringskit.
    OPMERKING: De hoeveelheid nucleair eiwit die met deze methode wordt verkregen, kan variëren van 1-2 μg / μL.
17. Verdeel de kernfracties in buizen voor eenmalig gebruik die 6 μg van het kerneiwit bevatten en breek bevriezing in een droogijs- en ethanolbad. Bewaren bij -80 °C tot nader gebruik.

6. Transcriptietest

1. Zet een warmteblok aan en verwarm het voor op 30 °C.
2. Verwijder het volgende uit het Nulcear Extract in vitro transcriptiesysteem: 50 mM _MgCl2, Nuclear Extract 1x Transcription Buffer, 100 mM rATP, 100 mM rCTP, 100 mM rGTP, 100 mM rUTP en de CMV promotor positive-control template. Ontdooien op ijs.
   OPMERKING: Versterk de positieve-controle DNA-sjabloon met behulp van een high-fidelity polymerase en sla het op als genormaliseerde aliquots voor eenmalig gebruik.
3. Meng en centrifugeer de ontdooide rNTPs voordat u een 10 mM-werkoplossing bereidt.
   OPMERKING: Voeg 2 μL van elke rATP, rCTP, rGTP en rUTP toe aan 12 μL _H2O om 10 mM van elke rNTP te bereiken. Deze samenstelling kan indien nodig worden opgeschaald.
4. Vul het rNTP-mengsel toe aan geëtiketteerde buizen voor eenmalig gebruik en bewaar bij -20 °C voor toekomstig gebruik.
5. Voeg in een verse buis van 1,5 ml met het label "Mastermix" de reagentia per reactie toe zoals vermeld in tabel 5
6. Breng 14 μL van de Mastermix over naar elke reactiebuis
7. Voeg 11 μL minus (volume voor 5 μg van het kernextract) van 1x transcriptiebuffer toe aan elke reactiebuis.
8. Voeg 5 μg van het kernextract toe aan elke reactiebuis.
9. Tik voorzichtig op de reactiebuis om de inhoud binnenin te mengen en centrifugeer de buizen na het mengen om ervoor te zorgen dat er geen reactiemateriaal aan de wand van de buizen vastzit.
10. Incubeer de reacties bij 30 °C gedurende 30 minuten.
11. Stop de reactie onmiddellijk door 400 μL RLT-buffer toe te voegen die door de RNA-extractiekit wordt geleverd.
    OPMERKING: Op dit punt is het veilig om te stoppen. Monsters kunnen worden bewaard bij -80 °C totdat ze verder worden opgeruimd met de RNA-extractiekit.

7. RNA opruimen

1. Bereid DNase I-voorraadoplossing met behulp van de RNase-vrije DNase-set in de RNA-extractiekit. Los het gelyofiliseerde DNase I op in 550 μL RNase-vrij water. Meng de oplossing voorzichtig. Niet vortex . Gebruik de DNase I-oplossing in buizen voor eenmalig gebruik van 10 μL en bewaar de aliquots bij -20 °C.
2. Bereid 70% en 80% ethanol met ethanol van moleculaire kwaliteit en RNase-vrij water.
3. Verplaats de monsters en reagentia naar een RNase-vrije werkruimte voordat u begint met het opruimen.
4. Voeg 400 μL 70% ethanol toe aan elk monster en pipetteer voorzichtig om goed te mengen.
5. Breng 400 μL van het monster over naar een gelabelde RNA-extractiespinkolom met een opvangbuis van 2 ml en centrifugeer het monster gedurende 30 s bij 8.500 x g . Gooi de doorstroming weg.
6. Herhaal stap 7.5 met het resterende monster en gooi de doorstroming weg.
7. Voeg 350 μL RW1-buffer (RNA-extractiekit) toe aan elke kolom. Centrifugeer de kolommen bij 8.500 x g gedurende 30 s. Gooi de doorstroming weg.
8. Voeg 70 μL RDD-buffer (RNA-extractiekit) toe aan een enkele 10 μL aliquot DNase I-stamoplossing en meng voorzichtig. Draai geen vortex.
9. Voeg de DNase I incubatiemix (80 μL) rechtstreeks toe aan het spinkolommembraan. Incubeer de kolommen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u de DNase I-oplossing aan het membraan toevoegt. Voorkom dat u een deel van de oplossing verliest aan de kolomwand of O-ring.
10. Voeg na 15 minuten 350 μL RW1-buffer toe aan de kolommen. Centrifugeer gedurende 30 s bij 8.500 x g. Gooi de doorstroming weg.
11. Plaats de kolommen in nieuwe opvangbuizen van 2 ml. Voeg 500 μL RPE-buffer (RNA-extractiekit) toe aan de spinkolom. Centrifugeer de kolommen op 8.500 x g gedurende 30 s om het membraan te wassen. Gooi de doorstroming weg.
12. Voeg 500 μL 80% ethanol toe aan elke kolom en centrifugeer de kolommen bij 8.500 x g gedurende 30 s. Gooi de doorstroming weg.
13. Plaats de kolommen in nieuwe opvangbuizen van 2 ml. Laat de kolomdeksels open en centrifugeer de kolommen gedurende 5 minuten bij 17.900 x g . Gooi de doorstroming weg.
14. Plaats de kolommen in gelabelde buizen van 1,7 ml. Voeg 17 μL RNase-vrij water direct toe aan het midden van het membraan van de spinkolom. Laat de kolommen 1 min op kamertemperatuur rusten. Centrifugeer de kolommen gedurende 1 min bij 17.900 x g .
15. Gooi de kolom weg en bewaar de buis van 1,7 ml met het vers gezuiverde RNA-monster.

8. DNA-vertering

1. Verwarm twee warmteblokken voor op 37 °C en 65 °C.
2. Voeg 2 μL van 10x reactiebuffer toe aan elk monster.
3. Voeg 1 μL (1 MBU) DNase toe aan elk monster.
4. Zet een pipet op 10 μL en pipetteer de nieuwe oplossing op en neer om voorzichtig te mengen. Draai geen vortex.
5. Incubeer de RNA-monsters bij 37 °C gedurende 30 minuten om het resterende DNA te verteren.
6. Inactiveer de DNase door de monsters op het warmteblok gedurende 10 minuten bij 65 °C te incuberen.
   OPMERKING: Het is veilig om bij deze stap te stoppen en het RNA op te slaan bij -80 °C om later reverse transcriptie uit te voeren.

9. Omgekeerde transcriptie

1. Voeg bij het programmeren van de thermocycler een extra stap van 1 uur, 37 °C toe voor de incubatie om de thermocycler voor te verwarmen. Voer het programma uit met de 'voorverwarmingsstap' tijdens het voorbereiden van de monsters en laat de thermocycler 37 °C bereiken. Wanneer de monsters voor reverse transcriptie klaar zijn, slaat u de voorverwarmingsstap van 37 °C over en gaat u verder met de eigenlijke incubatiestap (tabel 6). Als de thermocycler geen skip-functie heeft, voeg dan een stap van 1 min 37 °C toe voor de incubatie. Laat de thermocycler opwarmen tot de juiste temperatuur voordat u het systeem pauzeert en de voorbereide monsters toevoegt.
2. Bereid een 10 μM werkoplossing van transcriptie reverse primer in RNase-vrije _H2O en bewaar deze op ijs.
3. Ontdooi op ijs, 10x buffer uit de reverse transcriptie kit, dNTP mix (5 mM elk dNTP), RNase Inhibitor en de reverse transcriptase.
4. Bereid een Mastermix (per reactie) door de in tabel 7 genoemde bestanddelen toe te voegen aan een schone PCR-buis van 0,2 ml.
5. Aliquot 18 μL van de Mastermix in nieuwe 0,2 ml PCR-buizen voor elk monster.
6. Voeg 2 μL van het met DNase behandelde RNA voor elk monster toe aan hun respectievelijk gelabelde buisjes.
7. Incubeer de monsters bij 37 °C gedurende 1 uur in een voorverwarmde thermocycler.
8. Verplaats de monsters naar de -20 °C voor opslag na reverse transcriptie of ga direct door naar de volgende stap.
   OPMERKING: Het is veilig om te stoppen bij deze stap; bewaar het cDNA bij -20 °C voor later gebruik.

10. Specifieke productversterking

1. Ontdooien op ijs: cDNA, 10 μM transcriptie voorwaarts en 10 μM transcriptie reverse primers, en de PCR 2x Premix A.
   OPMERKING: Gebruik de PCR 2x Premix A in kleinere volumes om de dooitijd te verkorten.
2. Maak een Mastermix (per reactie) door de in tabel 8 genoemde bestanddelen toe te voegen aan een schone PCR-buis van 0,2 ml.
3. Aliquot 24 μL Mastermix voor elk monster in schoon gelabelde 0,2 ml PCR-buizen.
4. Voeg 1 μL cDNA van elk monster toe aan hun respectieve buisjes.
5. Incubeer de monsters in de thermocycler met behulp van de in tabel 9 vermelde programmacondities
6. Bewaar de PCR-producten na de incubatie bij 4 °C of -20 °C voor opslag op langere termijn.

11. Gel analyse

1. Gebruik 1x TAE-buffer om een gel te bereiden die 2% w/v agarose en 1x gelvlek bevat.
2. Laat de PCR-producten gedurende 1 uur op 50 V en 300 mA draaien of totdat er een duidelijke bandscheiding is.
3. Stel de gel voor met behulp van het geautomatiseerde belichtingsprogramma dat vooraf is geladen in de gel imager.

Representative Results

Het volgen van de geschetste stappen zou functioneel nucleair extract moeten opleveren (figuur 1), afwijking in de maal- of wasstappen kan leiden tot slechte activiteit of lage opbrengsten. Als functioneel C. elegans nucleair extract wordt verkregen, zal het het gebied stroomafwaarts van de CMV-promotor op het DNA-sjabloon transcriberen wanneer het wordt toegevoegd aan de eerder beschreven in vitro test. Het resulterende RNA-transcript kan worden gezuiverd uit de nucleaire eiwitten en DNA-sjabloon met behulp van conventionele methoden. Zonder het sjabloon-DNA kan omgekeerde transcriptie en het daaropvolgende PCR-product alleen het resultaat zijn van het RNA dat door het nucleaire extract is getranscribeerd. De PCR-producten kunnen worden gevisualiseerd op een agarosegel, de intensiteit van de DNA-band kan indicatief zijn voor de kwaliteit van nucleair eiwit en RNA-isolatie. Een zwakke bandintensiteit kan worden veroorzaakt door de inactivering van het nucleaire extract door hitte of een slechte buffervoorbereiding. Een te sterke bandintensiteit kan het gevolg zijn van DNA-besmetting als gevolg van slechte RNA-zuivering of onjuiste DNase-vertering. Consistente en succesvolle nucleaire isolaties zullen banden van vergelijkbare intensiteiten produceren, en zowel transcriptionele als PCR-negatieve controles mogen geen zichtbaar PCR-product hebben (figuur 2).

Figuur 1. Een schets van nucleaire extractisolatie. Het stroomdiagram schetst de belangrijkste stappen voor het isoleren van nucleair extract van C. elegans. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. C. elegans kernkundig extract behoudt zijn activiteit. De gelafbeelding toont de transcriptieproducten van C. elegans L4 larven nucleair extract met behulp van de CMV promotor DNA-sjabloon. Succesvolle isolatie van actieve nucleaire eiwitten zal resulteren in een 132 bp PCR-product na in vitro transcriptie, zoals te zien in lanes 1 en 2. Mislukte isolatie zal resulteren in een zwakke band of de afwezigheid van een PCR-product vergelijkbaar met lane 3. Deze visualisatie van de transcriptieactiviteit via PCR-versterking is een eenvoudige manier om de kwaliteit van de nucleaire extractie-isolatie te beoordelen. De positieve PCR-controle wordt geproduceerd door de CMV-promotor-DNA-sjabloon toe te voegen aan de PCR-reactie en de negatieve controle mist het sjabloon-DNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Nematode Groei Media Platen
Agar-agar	20.4 gr
Tafelzout	2,8 g
Bacto pepton	2,3 g
dH2O	975 ml
Autoclaaf bij 121 °C gedurende 30 min
Laat de media afkoelen tot 50 °C voordat u het volgende toevoegt
1 M CaCl2 (Steriel)	1 ml
1 M MgSO4 (steriel)	1 ml
10.000 eenheden / ml nystatine (steriel)	3 ml
5 mg / ml cholesterol in 95% ethanol (filter gesteriliseerd)	1 ml
1M KPO4 pH 6,0 (steriel)	25 ml

Tabel 1.

M9-buffer
Kh2PO4	3 gr
Na2HPO4	6 gr
NaCl	5 gr
dH2O	1.000 ml
Autoclaaf bij 121 °C gedurende 15 min
1 M MgSO4 (steriel)	1 ml (toevoegen na autoclaveren)
S-basale buffer
Kh2PO4	6 gr
K2HPO4	1 gr
NaCl	5,85 g
dH2O	1.000 ml
Autoclaaf bij 121 °C gedurende 15 min
Cholesterol 5 mg/ml (steriel)	1 ml (toevoegen na autoclaveren)

Tabel 2.

Hypotone buffer
Voorraad oplossing	Volume	Eindconcentratie
1 M HEPES KOH pH 7,6	7,5 ml	15 meter
1 M KCl	5,0 ml	10 meter
1 m mgCl2	2,5 ml	5 meter
0,5 M EDTA	0,1 ml	0,1 mM
1 m sucrose	175 ml	350m
dH2O	309,9 ml
Filter steriliseren

Tabel 3.

Hypertone buffer
Voorraad oplossing	Volume	Eindconcentratie
1 M HEPES KOH pH 7,6	7,5 ml	15 meter
1 M KCl	200 ml	400 meter
1 m mgCl2	2,5 ml	5 meter
0,5 M EDTA	0,1 ml	0,1 mM
10% Tween 20	5 ml	0.10%
50% Glycerol	100 ml	10%
dH2O	184,9 ml
Filter steriliseren

Tabel 4.

MgCl2, 50m	1,5 μL
rNTP mix, 10 mM elk	1,0 μL
Sjabloon DNA, 25 ng/μL	4,0 μL
RNase-vrije H2O	7,5 μL

Tabel 5.

Stap	Temp	Tijd	Cyclusnummer
Voorverwarmen	37 °C	60 min.	1x
Omgekeerde transcriptie	37 °C	60 min.	1x
Houden	10 °C		1x

Tabel 6.

10x omgekeerde transcriptiebuffer	2,0 μL
dNTP Mix (5 mM per dNTP)	2,0 μL
Transcriptie Reverse Primer (10 μM)	2,0 μL
RNase-remmer	1,0 μL
Sensiscript Reverse Transcriptase	1,0 μL
RNase-vrije H2O	10,0 μL

Tabel 7.

RNase-vrije H2O	6,25 μL
Transcriptie Forward Primer (10 μM)	2,5 μL
Transcriptie Reverse Primer (10 μM)	2,5 μL
PCR 2X Premix A	12,5 μL
PCR Enzym Mix	0,25 μL

Tabel 8.

Stap	Temp	Tijd	Cyclusnummer
Initiële denature	92 °C	60 s	1x
Denatur	92 °C	30 s
Anneal	59 °C	30 s	35x
Extensie	72 °C	30 s
Houden	10 °C		1x

Tabel 9.

Discussion

C. elegans is een aantrekkelijk modelorganisme om het eukaryote transcriptiesysteem te bestuderen vanwege het goedkope onderhoud en het gemak van genetische manipulatie. Hier wordt een protocol voor consistente isolatie van functioneel actief nucleair extract van L4 C. elegans beschreven. Hoewel dit protocol gericht was op het visualiseren van transcriptieactiviteit, kan het cDNA dat post-transcriptioneel wordt geproduceerd, worden gekwantificeerd met behulp van RT-qPCR om een nauwkeurigere meting van de transcriptieactiviteit te ^verkrijgen8. Deze methode om nucleaire eiwitten van C. elegans te isoleren, kan helpen de studie van de eukaryote transcriptiemachinerie uit te breiden. Aangezien C. elegans geen celkweek in een schaal of een kolonie gist is, maar eerder een vrij rondlopend dier, kan het isoleren en onderzoeken van het nucleaire extract een duidelijker inzicht geven in hoe de transcriptionele machinerie in de loop van de tijd of in verschillende omgevingen kan veranderen. Hierdoor kunnen onderzoekers profiteren van de lage kosten en veerkracht van C. elegans . C. elegans is, in tegenstelling tot andere modelorganismen of celculturen, veel vergevingsgezinder wanneer bacteriële of gistbesmetting verschijnt. Een populatie van C. elegans kan gemakkelijk worden gereinigd van besmetting met behulp van vastgestelde protocollen, waardoor tijd en moeite worden bespaard wanneer besmetting ^optreedt9. Over het algemeen kan het gebruik van nucleair extract van C. elegans voor biochemische assays een meer betaalbare en flexibele optie zijn in vergelijking met het kopen van nucleair extract van een leverancier of het omgaan met minder vergevingsgezinde modelorganismen.

Hoewel dit protocol relatief eenvoudig is, zijn er nog steeds kritieke stappen die speciale aandacht vereisen voor de succesvolle isolatie van het nucleaire extract. Het is belangrijk dat tijdens de bereiding van de volledige hypotone en hypertone buffers de twee oplossingen duidelijk worden gelabeld en gescheiden. Als de buffers op enig moment tijdens de isolatie worden geschakeld, kan dit leiden tot inactivatie van de nucleaire eiwitten of slechte fractionering van de cytosolische eiwitten uit de nucleaire eiwitten. Geïsoleerde nucleaire eiwitten moeten ook, indien nodig, worden verdund in hypertone buffer, niet in water of een andere oplossing. De hoge zoutconcentratie helpt de activiteit van de eiwitten te behouden en een hypotone oplossing kan deze activiteit ^doden10.

Een andere uitdaging die zich kan voordoen tijdens het slijpgedeelte van dit protocol komt van puin dat zich aan het oppervlak van de wolfraamballen hecht. Hoewel er wordt gesteld dat de ballen na elke maalcyclus moeten worden gewassen en gedroogd, zal het materiaal zich hechten aan het gladde oppervlak van de ballen. Dit materiaal verschijnt meestal als roestkleurige ringen rond de omtrek van de ballen en is dik genoeg om de opening tussen de bal en de wand van de slijpkamer te blokkeren. Deze verstopping is merkbaar omdat het steeds moeilijker wordt om de dieren door de molen te duwen, wat uiteindelijk kan leiden tot spierletsel of scheuren van de spuit. Als de wolfraamballen verkleuring beginnen te vertonen, week ze dan 5 minuten in heet water en reinig het oppervlak met een nieuw schuursponsje. Vermijd het gebruik van zure of basische reinigingsoplossingen. Na het voorzichtig polijsten moeten de wolfraamballen terugkeren naar hun oorspronkelijke glans en zal het merkbaar gemakkelijker zijn om monsters te slijpen.

Dit protocol is ontworpen om het volledige nucleaire extract van C. elegans te isoleren. Het is niet getest voor gebruik op andere modelorganismen. Nucleair extract van andere organismen kan verschillende buffers vereisen en de CMV-promotor is mogelijk niet voldoende om transcriptie in andere niet-zoogdiermonsters te stimuleren. Het nucleaire extract dat met deze methode wordt verzameld, is ook niet weefsel- of celspecifiek; elke transcriptieactiviteit die met deze methode wordt gemeten, kijkt naar de dieren als geheel, wat de subtiele veranderingen tussen weefsels kan verbergen.

Toekomstig gebruik van dit protocol zou het meten van de DNA-reparatie- of replicatiemachinerie van C. elegans na DNA-schade kunnen zijn. De cytosolische fractie die tijdens het isolatieproces wordt verzameld, kan worden gebruikt om de hoeveelheid oplosbare eiwitten te meten en de activiteit van deze eiwitten te kwantificeren op een manier die vergelijkbaar is met het meten van transcriptie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010