Aislamiento del extracto nuclear activo de Caenorhabditis elegans y reconstitución para la transcripción in vitro

Summary

Aquí, describimos un protocolo detallado para aislar el extracto nuclear activo de la etapa larvaria 4 de C. elegans y visualizar la actividad de transcripción en un sistema in vitro .

Abstract

Caenorhabditis elegans ha sido un importante sistema modelo para la investigación biológica desde que se introdujo en 1963. Sin embargo, C. elegans no se ha utilizado completamente en el estudio bioquímico de reacciones biológicas utilizando sus extractos nucleares, como la transcripción in vitro y la replicación del ADN. Un obstáculo significativo para el uso de C. elegans en estudios bioquímicos es interrumpir la gruesa cutícula externa del nematodo sin sacrificar la actividad del extracto nuclear. Si bien se utilizan varios métodos para romper la cutícula, como la homogeneización o la sonicación de Dounce, a menudo conducen a la inestabilidad de las proteínas. No existen protocolos establecidos para aislar proteínas nucleares activas de larvas o adultos de C. elegans para reacciones in vitro . Aquí, el protocolo describe en detalle la homogeneización de la etapa larvaria 4 C. elegans utilizando un homogeneizador Balch. El homogeneizador Balch utiliza presión para forzar lentamente a los animales a través de un estrecho espacio que rompe la cutícula en el proceso. El diseño uniforme y el mecanizado preciso del homogeneizador Balch permiten una molienda constante de animales entre experimentos. El fraccionamiento del homogeneizado obtenido del homogeneizador Balch produce un extracto nuclear funcionalmente activo que se puede utilizar en un método in vitro para evaluar la actividad de transcripción de C. elegans.

Introduction

El pequeño nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans es un organismo modelo simple pero poderoso para abordar una amplia gama de preguntas biológicas. Desde su introducción en 1963, los nematodos han sido invaluables para responder preguntas en neurobiología, metabolismo, envejecimiento, desarrollo, inmunidad y ^genética1. Algunas de las muchas características del animal que lo convierten en un organismo modelo ideal incluyen el corto tiempo de generación, la efectividad de la interferencia de ARN, el cuerpo transparente y los mapas completos tanto de su linaje celular como de su sistema nervioso.

Si bien las contribuciones del nematodo a la ciencia son vastas, se han subutilizado para dilucidar el sistema de transcripción eucariota, y la mayor parte de nuestra comprensión sobre estos mecanismos proviene de estudios que utilizan extracto nuclear de levadura, mosca de la fruta y cultivo de células de ^mamíferos2. El mayor obstáculo que disuade a los investigadores de extraer extracto nuclear funcional es la dura cutícula externa del nematodo. Este exoesqueleto comprende colágenos, cuticlinas, glicoproteínas y lípidos reticulados, lo que hace que C. elegans desde la etapa larvaria hasta la edad adulta sea resistente a la extracción de proteínas a través de fuerzas químicas o mecánicas3. Una vez se desarrolló un sistema de transcripción in vitro que utiliza extracto nuclear de C. elegans, pero no se adoptó ampliamente debido al alcance limitado del sistema, y el uso del homogeneizador Dounce para preparar el extracto podría conducir a la inestabilidad de la ^proteína4,5.

A diferencia del protocolo anterior para el aislamiento de extractos nucleares que utilizaba un homogeneizador Dounce para romper C. elegans, este protocolo utiliza un homogeneizador Balch. El homogeneizador Balch consta de dos componentes principales: una bola de carburo de tungsteno y un bloque de acero inoxidable con un canal perforado de un extremo a otro. El homogeneizador Balch se carga con la bola de carburo de tungsteno y se tapa a cada lado para sellar la cámara de molienda. Las jeringas se pueden cargar en los dos puertos verticales que conducen a la cámara de molienda. A medida que el material pasa de una jeringa a la otra a través de la cámara de molienda, la presión de las jeringas fuerza el material a través de un espacio estrecho entre la bola y la pared de la cámara. Esta presión lenta y constante rompe el material hasta que alcanza un tamaño consistente que es capaz de pasar a través del espacio estrecho fácilmente. Forzar a C. elegans a través de la estrecha brecha a través de una presión constante pero suave rompe la apertura de los animales, liberando su contenido en el amortiguador circundante. Cambiar el tamaño de las bolas aprieta aún más la brecha, rompiendo las células recién liberadas y libera los núcleos en el tampón. Múltiples instancias de centrifugación separan los núcleos del resto de los desechos celulares, lo que permite la recolección de un extracto nuclear limpio. El homogeneizador Balch es preferido sobre el homogeneizador Dounce por varias razones: el sistema puede manejar una gran cantidad de animales, lo que permite extraer una gran cantidad de proteínas activas en un solo intento; el mecanizado preciso de las bolas y el bloque de acero permite un rectificado consistente entre múltiples muestras; el bloque de acero pesado actúa como un disipador de calor, extrayendo uniformemente el calor de la cámara de molienda, evitando la desnaturalización.

Después del aislamiento, la actividad transcripcional del extracto nuclear debe verificarse antes de ser utilizada en cualquier experimento bioquímico. Tradicionalmente, la actividad de transcripción se medía utilizando nucleótidos radiomarcados para rastrear y visualizar el ARN recién sintetizado. Sin embargo, el etiquetado radiactivo puede ser oneroso, ya que requiere precaución durante el uso y la ^{eliminación6}. Los avances tecnológicos permiten a los investigadores de hoy utilizar métodos mucho menos dañinos o problemáticos para medir incluso pequeñas cantidades de ARN utilizando técnicas como la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)⁷. Aquí, el protocolo describe un método para aislar el extracto nuclear activo de la etapa larvaria 4 (L4) C. elegans y visualizar la actividad de transcripción en un sistema in vitro.

Protocol

1. Preparación de los medios de comunicación

1. Prepare placas de agar de caldo de lisogenia (LB) estériles y medios líquidos siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Streak Escherichia coli (E. coli) cepa OP50 en una placa de agar LB. Incubar la racha de bacterias a 37 °C durante la noche.
3. Guarde la placa de rayas de E. coli OP50 a 4 °C después de la incubación. La placa op50 de E. coli se puede almacenar de forma segura a 4 °C durante 2 semanas si se envuelve en parafilm para evitar la pérdida de humedad.
4. Prepare 2 L de nematodos medios de crecimiento (NGM) usando la receta de la Tabla 1.
   NOTA: La nistatina es opcional. La nistatina ayuda a prevenir el moho y otros contaminantes fúngicos que crecen en las placas NGM. Las grandes placas de 150 mm de diámetro tienen una mayor probabilidad de atrapar esporas de hongos cuando se retira la tapa para verter y sembrar E. coli OP50. La nistatina se puede comprar premezclada en solución estéril de proveedores a 10,000 unidades / ml o se puede comprar como polvo estéril y mezclado con agua estéril. La nistatina no se puede esterilizar en autoclave, ni se puede esterilizar con filtro de manera efectiva. La atención a la técnica aséptica es crucial mientras se mezcla una solución de nistatina en el laboratorio. Autoclave 1 M _CaCl2, 1 M _KPO4 pH 6.0 y 1 M MgSO4 a 121 °C durante 15 min. El filtro esteriliza el colesterol a través de un filtro de 0,22 μm después de ser disuelto en etanol al 95%.
5. Después de agregar los reactivos a los medios, vierta NGM en cuarenta placas de Petri de 150 mm. Cada plato de 150 mm requiere 50 ml para llenarse. Deje que las placas NGM se enfríen durante la noche a temperatura ambiente.
6. Inocular dos tubos cónicos de 50 ml que contengan 25 ml de LB estéril con E. coli OP50 de la placa de raya anterior. Incubar el caldo a 37 °C durante 24 h en una incubadora de agitación mantenida a 200 rpm.
   NOTA: Para mayor consistencia, inocule ambos tubos con la misma colonia única de la placa de rayas. Si esto resulta difícil, inocular 5 ml de LB estéril con una sola colonia en un tubo cónico de 50 ml e incubar el cultivo durante 16 h a 37 °C en una incubadora de agitación mantenida a 200 rpm el día antes de preparar las placas NGM. Conservar el cultivo líquido fresco a 4 °C durante un máximo de dos días. Inocular los dos 25 mL de caldo con 25 μL de cultivo líquido e incubar en las mismas condiciones mencionadas anteriormente.
7. Separe placas NGM frescas con 1 ml de cultivo líquido fresco de E. coli OP50 y extiéndalas con un esparcidor esterilizado por llama de manera uniforme a través de la superficie de la placa asépticamente para crear un césped de bacterias grandes que cubra la mayor parte de la placa, teniendo cuidado de no propagar las bacterias de borde a borde. Deje que la E. coli OP50 crezca a temperatura ambiente durante 72-96 h o hasta que aparezca un césped visiblemente grueso.
   NOTA: Después de 24 h, mueva las placas NGM recién sembradas a un recipiente cubierto para reducir la pérdida de humedad y extender la vida útil de las placas.

2. Preparaciones animales y sincronización de lejía

1. Transfiera 5 C. elegans adultos grávidos bien alimentados, de tipo silvestre, a cada una de las 10 placas frescas de NGM sembradas con E. coli OP50, para un total de 50 animales.
2. Permita que los animales pongan huevos. Deje que la progenie crezca a 20 °C hasta que alcance la etapa adulta grávida.
3. Use 15 ml de tampón M9 (Tabla 2) para recolectar los nuevos adultos grávidos de tipo salvaje bien alimentados de las diez placas de mantenimiento y transfiera los animales a un tubo cónico de 15 ml etiquetado.
4. Centrifugar los animales a 1.000 x g durante 3 min para peletizar todos los animales en la parte inferior del tubo.
5. En un tubo cónico separado y etiquetado de 15 ml, mezcle 2 ml de lejía con 5 ml de 1 N NaOH para la sincronización de la lejía. Vórtice la solución para mezclar bien.
   NOTA: Use la solución de lejía + NaOH el mismo día que esté preparada para ser efectiva.
6. Retire suavemente el sobrenadante de los animales centrifugados con una pipeta estéril de 10 ml. Intente eliminar la mayor cantidad posible de amortiguador M9 para mejorar la rotura de los animales.
7. Agregue 500 μL de la solución de lejía + NaOH al pellet animal y comience un temporizador durante 4 min.
8. Ya sea a mano o usando un balancín, mece suavemente el tubo para romper el pellet animal por completo y deje que los animales se muevan libremente en la solución de lejía + NaOH. Continúe meciendo el tubo durante los 4 minutos de duración.
   NOTA: La cantidad de lejía + solución de NaOH necesaria puede variar dependiendo del tamaño del pellet animal que se esté sincronizando. Optimice esta técnica de antemano con cantidades variables de animales y solución de lejía + NaOH.
9. Después de 4 minutos, verifique la eficiencia de rotura bajo un microscopio de disección. Asegúrese de que la mayoría de los animales adultos grávidos estén rotos y su contenido interno liberado, incluidos los huevos.
10. Si los animales no están abiertos, vórtice brevemente el tubo a la velocidad máxima, luego verifique nuevamente bajo el microscopio.
    NOTA: Si bien los huevos son resistentes a la solución de lejía + NaOH, no son impermeables. Los huevos no deben exponerse a la solución de lejía + NaOH más tiempo del necesario. El estancamiento durante demasiado tiempo durante el paso de ruptura del animal puede conducir a problemas de desarrollo para la progenie.
11. Agregue 10 ml del tampón M9 a la solución animal rota.
12. Centrifugar los huevos y los restos a 1.000 x g durante 3 min.
13. Pipetee el sobrenadante, asegurándose de no tocar el nuevo pellet que contiene todos los huevos en la parte inferior del tubo.
14. Añadir otros 10 mL del tampón M9 y centrifugar de nuevo durante 3 min a 1.000 x g.
15. Repita los pasos 2.13-2.14 dos veces más para asegurarse de que no quede nada de la solución de lejía + NaOH.
16. Después del tercer lavado tampón M9, retire el sobrenadante y agregue 10 ml del tampón S-basal (Tabla 2).
17. Invierta el tubo para romper el pellet en la parte inferior para suspender los huevos por igual en el tampón.
18. Coloque el tubo en un balancín y meca suavemente el tubo durante 22 h a 20 ° C para permitir que los huevos eclosionen y alcancen la etapa larvaria 1 (L1) de detención.
19. Después de 22 h, centrifugar el tubo que contiene animales L1 sincronizados durante 3 min a 1000 x g.
20. Pipete y deseche el sobrenadante dejando aproximadamente 1 ml de tampón en el tubo.
21. Usando una micropipeta, perturbe el pellet animal para hacer una suspensión homogénea de los animales L1 en el tampón restante.
22. Transfiera una sola gota de la suspensión homogénea de los animales L1 a una placa NGM de 150 mm etiquetada sembrada con E. coli OP50.
23. Calcule la densidad animal por gota contando visualmente el número de animales L1 por gota utilizando un microscopio de disección. Una placa NGM de 150 mm con un césped completamente crecido de E. coli OP50 puede soportar hasta 500 animales de la etapa L1 para alcanzar la etapa adulta grávida.
24. Transfiera los animales L1 a seis placas NGM de 150 mm con E. coli OP50. Asegúrese de no sobrecargar la placa.
    NOTA: Si no está claro si los animales tendrán suficiente alimento para el desarrollo entre L1 y adulto grávido, agregue menos animales a cada plato y use más platos.
25. Deje que los animales crezcan durante 72 h a 20 ° C hasta que alcancen la etapa adulta grávida y comiencen a poner huevos.
26. Realice una segunda ronda de sincronización de lejía en los animales adultos grávidos de tipo salvaje sincronizados y bien alimentados.
27. Coloque los animales L1 sincronizados en diez placas NGM de 150 mm sembradas con E. coli OP50, con aproximadamente 1.000 animales por placa.
28. Permita que los nuevos animales L1 sincronizados crezcan durante 48 h a 20 °C hasta que alcancen la etapa L4.
    NOTA: El objetivo es obtener un pellet de aproximadamente 700 - 800 μL de animales L4. Demasiados animales pueden dificultar el uso del homogeneizador Balch; esto puede provocar tensión muscular durante el funcionamiento del homogeneizador y una posible fuga de las jeringas debido al aumento de la presión.

3. Preparación del homogeneizador Balch

1. Prepare los tampones hipotónicos e hipertónicos como se menciona en la Tabla 3 y la Tabla 4.
   NOTA: Los tampones hipotónicos e hipertónicos se pueden preparar con anticipación y almacenar de forma segura a 4 °C.
2. Limpie el homogeneizador Balch inundando la cámara de molienda con etanol al 70%, luego enjuague la cámara con agua desionizada para eliminar el exceso de etanol.
   NOTA: Evite el uso de agentes cáusticos para limpiar el homogeneizador Balch. El enjuague completo con etanol y agua desionizada debe ser suficiente para limpiarlo.
3. Inserte la bola de carburo de tungsteno de 7,9820 mm (espacio libre de 18 μm) en la cámara de molienda.
4. Tapa cada extremo del cañón del homogeneizador Balch y asegura las tapas con los tornillos de pulgar proporcionados.
5. Preparar 5 mL de 'tampón hipotónico completo' por muestra: Añadir 5 μL de 1 M de TDT (concentración final: 1 mM de TDT) y 100 μL de inhibidor de la proteasa 100x, cóctel de un solo uso (concentración final: 2x). Mantenga el amortiguador en hielo.
6. Preparar 5 mL de 'buffer hipertónico completo' por muestra: Añadir 5 μL de 1 M de TDT (concentración final: 1 mM de TDT) y 100 μL de inhibidor de proteasa 100x, cóctel de un solo uso (concentración final: 2x). Mantenga el amortiguador en hielo.
   NOTA: Utilice el tampón hipotónico e hipertónico completo el mismo día de preparación. No lo guarde para su uso posterior. Conservar 1 M de TDT como alícuotas de un solo uso a -20 °C. Guarde el cóctel de un solo uso del inhibidor de la proteasa a 4 °C.
7. Llene una jeringa estéril de 2 ml con 1 ml de "tampón hipotónico completo" y enjuague suavemente la cámara de molienda del homogeneizador Balch. Deje aproximadamente 500 μL de "tampón hipotónico completo" en la cámara.
8. Guarde el homogeneizador enjuagado sobre hielo y déjelo enfriar durante 30 minutos.
   NOTA: El homogeneizador debe estar helado antes de moler a los animales. El proceso de molienda puede producir calor debido a la fricción y desnaturalizar las proteínas nucleares. Asegúrese de que el homogeneizador de metal esté helado para ayudar a evitar que esto suceda. Asegúrese de evitar que el agua del hielo circundante entre en el homogeneizador. Use dos jeringas estériles para tapar los orificios en el homogeneizador y bloquear cualquier líquido no intencional que entre en la cámara de molienda.

4. Recogida de animales

NOTA: Se proporciona una guía de referencia rápida, que marca los principales pasos para la recolección, interrupción y fraccionamiento de los animales (Figura 1).

1. Recoger los animales L4 bien alimentados con tampón M9 en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a los animales a 1000 x g durante 3 min. Retire el sobrenadante y continúe lavando el pellet animal hasta que el sobrenadante esté claro.
2. Lavar los animales con 3 mL de tampón hipotónico de 4 °C y centrifugar de nuevo a 1000 x g durante 3 min.
   NOTA: Durante el lavado final con el tampón hipotónico de 4 °C, los animales pueden pegarse al costado del tubo. Esto es normal y puede resultar en una pequeña pérdida de animales durante la eliminación del sobrenadante.
3. Retire el tampón hipotónico y agregue 1 ml de "tampón hipotónico completo" al pellet animal. Transfiera la suspensión animal a una nueva jeringa estéril de 2 ml.
   NOTA: Mientras transfiere los animales a la jeringa usando una micropipeta, pipetee suavemente una solución estéril de Tween20 al 0.1% para cubrir el interior de la punta de la pipeta para reducir la cantidad de animales perdidos debido a la adherencia a las paredes de la punta de la pipeta.

5. Fraccionamiento

1. En hielo, homogeneice a los animales empujando suavemente a los animales a través de la cámara de molienda del homogeneizador Balch cargado con la bola de 7.9820 mm y en una nueva jeringa estéril. Repita empujando a los animales a través de la cámara de molienda durante 30 ciclos completos.
   NOTA: Un "ciclo completo" se define como el movimiento completo hacia arriba y hacia abajo del émbolo de una jeringa.
   Este paso de molienda utiliza una bola de 7,9820 mm (rodamiento de bolas de 18 μm).
2. Después de 30 ciclos, retire la mayor cantidad posible de la suspensión animal del homogeneizador Balch y guarde la jeringa, inclinándola hacia abajo en un microtubo de 1,7 ml.
3. Retire la bola de 7.9820 mm de la cámara de molienda y límpiela con agua desionizada. Seque y devuelva la bola a su tubo etiquetado.
4. Inserte la bola de 7,9880 mm (espacio libre de 12 μm) en la cámara de molienda y vuelva a sellar el homogeneizador.
5. Enjuague la cámara de molienda nuevamente con 1 ml de "tampón hipotónico completo" helado.
6. Moler la suspensión durante 25 ciclos completos.
7. Después de 25 ciclos, retire la suspensión animal del homogeneizador Balch, transfiera la suspensión a un microtubo limpio de 1,7 ml y guárdela en hielo.
   NOTA: Desmonta y limpia el homogeneizador Balch con etanol al 70% y agua desionizada. Asegúrese de devolver la bola de 7,9880 mm a su tubo adecuado.
8. Granular los cuerpos de los animales y los escombros centrifugando la suspensión a 500 x g, 4 °C durante 5 min.
9. Pipetear 40 μL del sobrenadante a un tubo etiquetado como "fracción de entrada" y almacenarlo en hielo.
   NOTA: Escriba todas las etiquetas con un bolígrafo a prueba de alcohol para evitar untarlas más tarde.
10. Transfiera el sobrenadante restante a un nuevo tubo de 1,7 ml, teniendo cuidado de evitar tocar el pellet en la parte inferior del tubo y luego deseche el pellet.
11. Centrifugar el sobrenadante para granular los núcleos a 4.000 x g, 4 °C durante 5 min.
12. Transfiera el sobrenadante, con cuidado de no perturbar los núcleos granulados, a un nuevo tubo de 1,7 ml y etiquete el tubo como "fracción citosólica".
    NOTA: Centrifugar la fracción citosólica a 17.000 x g, 4 °C durante 30 min para eliminar cualquier material insoluble restante, y utilizarlo como un control negativo para western blots (específicamente para proteínas nucleares).
13. Lave el pellet de núcleos con 500 μL de "tampón hipotónico completo" y transfiera el pellet a un nuevo tubo de 1,7 ml. Centrifugar el pellet suspendido a 4.000 x g, 4 °C durante 5 min.
14. Deseche el sobrenadante y agregue 500 μL de "tampón hipotónico completo" fresco al gránulo nuclear y transfiera la suspensión a un nuevo tubo de 1,7 ml. Centrifugar la muestra de nuevo a 4.000 x g, 4 °C durante 5 min.
15. Retire el sobrenadante y disuelva el pellet en 40 μL de "tampón hipertónico completo". Transfiera la nueva suspensión nuclear a un nuevo tubo de 1,7 ml, etiquete el tubo como "fracción nuclear" y guárdelo en hielo.
16. Determine la concentración de proteínas de las tres fracciones utilizando un kit de cuantificación fluorescente.
    NOTA: La cantidad de proteína nuclear adquirida a partir de este método puede variar de 1-2 μg/μL.
17. Alícuota las fracciones nucleares en tubos de un solo uso que contengan 6 μg de la proteína nuclear y congele en un baño de hielo seco y etanol. Conservar a -80 °C hasta su uso posterior.

6. Ensayo de transcripción

1. Encienda y precaliente un bloque de calor a 30 °C.
2. Elimine lo siguiente del sistema de transcripción in vitro Nulcear Extract: 50 mM _MgCl2, Nuclear Extract 1x Transcription Buffer, 100 mM rATP, 100 mM rCTP, 100 mM rGTP, 100 mM rUTP y la plantilla de control positivo del promotor CMV. Descongelar sobre hielo.
   NOTA: Amplifique la plantilla de ADN de control positivo utilizando una polimerasa de alta fidelidad y guárdela como alícuotas normalizadas de un solo uso.
3. Mezcle y centrifugue los rNTP descongelados antes de preparar una solución de trabajo de 10 mM.
   NOTA: Agregue 2 μL de cada rATP, rCTP, rGTP y rUTP a 12 μL de _H2O para lograr 10 mM de cada rNTP. Esta composición se puede ampliar si es necesario.
4. Alícuota la mezcla rNTP en tubos de un solo uso etiquetados y guárdela a -20 °C para su uso futuro.
5. En un tubo fresco de 1,5 ml con la etiqueta "Mastermix", agregue los reactivos por reacción como se menciona en la Tabla 5
6. Transfiera 14 μL del Mastermix a cada tubo de reacción
7. Añadir 11 μL menos (volumen para 5 μg del extracto nuclear) de 1x Transcription Buffer a cada tubo de reacción.
8. Añadir 5 μg del extracto nuclear a cada tubo de reacción.
9. Golpee suavemente el tubo de reacción para mezclar el contenido en el interior y centrifugue por pulso los tubos después de mezclarlos para asegurarse de que ningún material de reacción se pegue a la pared de los tubos.
10. Incubar las reacciones a 30 °C durante 30 min.
11. Detenga inmediatamente la reacción agregando 400 μL de tampón RLT proporcionado por el kit de extracción de ARN.
    NOTA: En este punto, es seguro detenerse. Las muestras se pueden almacenar a -80 °C hasta su posterior limpieza con el kit de extracción de ARN.

7. Limpieza de ARN

1. Prepare la solución madre de DNasa I utilizando el conjunto de DNasa sin RNasa proporcionado en el kit de extracción de ARN. Disolver la DNasa I liofilizada en 550 μL de agua libre de RNasa. Mezcle suavemente la solución. No vórtice. Alícuota la solución de DNasa I en tubos de un solo uso de 10 μL y almacene las alícuotas a -20 °C.
2. Prepare etanol al 70% y 80% utilizando etanol de grado molecular y agua libre de RNasa.
3. Mueva las muestras y los reactivos a un espacio de trabajo sin RNasa antes de comenzar la limpieza.
4. Agregue 400 μL de etanol al 70% a cada muestra y pipetee suavemente para mezclar bien.
5. Transfiera 400 μL de la muestra a una columna de espín de extracción de ARN etiquetada con un tubo de recolección de 2 ml y centrífuga la muestra a 8.500 x g durante 30 s. Descarta el flujo.
6. Repita el paso 7.5 con la muestra restante y descarte el flujo.
7. Agregue 350 μL de tampón RW1 (kit de extracción de ARN) a cada columna. Centrifugar las columnas a 8.500 x g durante 30 s. Descarta el flujo.
8. Añadir 70 μL de tampón RDD (kit de extracción de ARN) a una sola alícuota de 10 μL de solución madre de DNasa I y mezclar suavemente. No vórtice.
9. Añadir la mezcla de incubación de DNasa I (80 μL) directamente a la membrana de la columna de espín. Incubar las columnas a temperatura ambiente durante 15 min.
   NOTA: Asegúrese de agregar la solución de DNasa I a la membrana. Evite perder parte de la solución en la pared de la columna o la junta tórica.
10. Después de 15 min, agregue 350 μL de búfer RW1 a las columnas. Centrífuga para 30 s a 8.500 x g. Descarta el flujo.
11. Coloque las columnas en nuevos tubos de recolección de 2 ml. Agregue 500 μL de tampón RPE (kit de extracción de ARN) a la columna de espín. Centrifugar las columnas a 8.500 x g durante 30 s para lavar la membrana. Descarta el flujo.
12. Añadir 500 μL de etanol al 80% a cada columna y centrifugar las columnas a 8.500 x g durante 30 s. Descarta el flujo.
13. Coloque las columnas en nuevos tubos de recolección de 2 ml. Dejando las tapas de las columnas abiertas, centrifuga las columnas a 17.900 x g durante 5 min. Descarta el flujo.
14. Coloque las columnas en tubos etiquetados de 1,7 ml. Agregue 17 μL de agua libre de RNasa directamente al centro de la membrana de la columna de espín. Deje reposar las columnas a temperatura ambiente durante 1 min. Centrifugar las columnas a 17.900 x g durante 1 min.
15. Deseche la columna y mantenga el tubo de 1,7 ml con la muestra de ARN recién purificada.

8. Digestión del ADN

1. Precaliente dos bloques de calor a 37 °C y 65 °C.
2. Añadir 2 μL de buffer de reacción 10x a cada muestra.
3. Añadir 1 μL (1 MBU) de DNasa a cada muestra.
4. Ajuste una pipeta a 10 μL y pipetee la nueva solución hacia arriba y hacia abajo para mezclar suavemente. No vórtice.
5. Incubar las muestras de ARN a 37 °C durante 30 min para digerir cualquier ADN restante.
6. Inactivar la DNasa incubando las muestras en el bloque de calor a 65 °C durante 10 min.
   NOTA: Es seguro detenerse en este paso y almacenar el ARN a -80 ° C para realizar la transcripción inversa más adelante.

9. Transcripción inversa

1. Al programar el termociclador, agregue un paso adicional de 1 h, 37 ° C antes de la incubación para precalentar el termociclador. Ejecute el programa con el 'paso de precalentamiento' mientras prepara las muestras y deje que el termociclador alcance los 37 °C. Cuando las muestras para la transcripción inversa estén listas, omita el paso de precalentamiento de 37 °C y continúe con el paso de incubación real (Tabla 6). Si el termociclador no tiene una función de salto, agregue un paso de 1 min 37 °C antes de la incubación. Permita que el termociclador se caliente a la temperatura adecuada antes de pausar el sistema y agregar las muestras preparadas.
2. Prepare una solución de trabajo de 10 μM de imprimación inversa de transcripción en _H2O libre de RNasa y guárdela en hielo.
3. Deshielo en hielo, tampón 10x del kit de transcripción inversa, mezcla de dNTP (5 mM cada dNTP), inhibidor de la RNasa y la transcriptasa inversa.
4. Prepare una Mastermix (por reacción) agregando los componentes mencionados en la Tabla 7 en un tubo de PCR limpio de 0.2 ml.
5. Alícuota 18 μL del Mastermix en nuevos tubos PCR de 0,2 mL para cada muestra.
6. Añadir 2 μL del ARN tratado con DNasa para cada muestra en sus tubos marcados respectivamente.
7. Incubar las muestras a 37 °C durante 1 h en un termociclador precalentado.
8. Mueva las muestras a -20 °C para su almacenamiento después de la transcripción inversa o continúe directamente con el siguiente paso.
   NOTA: Es seguro detenerse en este paso; conservar el ADNc a -20 °C para su uso posterior.

10. Amplificación específica del producto

1. Deshielo sobre hielo: cDNA, cebadores de transcripción hacia adelante de 10 μM y de transcripción inversa de 10 μM, y la premezcla A PCR 2x.
   NOTA: Alícuota la PCR 2x Premix A en volúmenes más pequeños para reducir el tiempo de deshielo.
2. Cree una Mastermix (por reacción) agregando los componentes mencionados en la Tabla 8 en un tubo de PCR limpio de 0.2 ml.
3. Alícuota de 24 μL de Mastermix para cada muestra en tubos PCR de 0,2 ml etiquetados limpios.
4. Añadir 1 μL de ADNc de cada muestra en sus respectivos tubos.
5. Incubar las muestras en el termociclador utilizando las condiciones del programa mencionadas en la Tabla 9
6. Después de la incubación, almacene los productos de PCR a 4 °C o -20 °C para un almacenamiento a largo plazo.

11. Análisis de gel

1. Use 1x tampón TAE para preparar un gel que contenga 2% p/v de agarosa y 1x tinción de gel.
2. Ejecute los productos de PCR a 50 V y 300 mA durante 1 h o hasta que haya una separación de banda clara.
3. Tome una imagen del gel utilizando el programa de exposición automatizado precargado en el generador de imágenes de gel.

Representative Results

Siguiendo los pasos descritos se debe producir extracto nuclear funcional (Figura 1), la desviación en los pasos de molienda o lavado puede conducir a una actividad deficiente o bajos rendimientos. Si se obtiene extracto nuclear funcional de C. elegans , transcribirá la región aguas abajo del promotor cmv en la plantilla de ADN cuando se agregue al ensayo in vitro descrito anteriormente. La transcripción de ARN resultante se puede purificar a partir de las proteínas nucleares y la plantilla de ADN utilizando métodos convencionales. Sin la plantilla de ADN, la transcripción inversa y el producto de PCR posterior solo pueden ser el resultado del ARN transcrito por el extracto nuclear. Los productos de PCR se pueden visualizar en un gel de agarosa, la intensidad de la banda de ADN puede ser indicativa de la calidad de la proteína nuclear y el aislamiento de ARN. Una intensidad de banda débil puede ser causada por la inactivación del extracto nuclear, ya sea por calor o por una mala preparación tampón. Una intensidad de banda excesivamente fuerte puede ser el resultado de la contaminación del ADN, ya sea debido a una mala purificación del ARN o a una digestión inadecuada de la DNasa. Los aislamientos nucleares consistentes y exitosos producirán bandas de intensidades similares, y tanto los controles transcripcionales como los negativos de PCR no deben tener un producto de PCR visible (Figura 2).

Figura 1. Un esquema del aislamiento de extractos nucleares. El diagrama de flujo describe los principales pasos para aislar el extracto nuclear de C. elegans. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. El extracto nuclear de C. elegans conserva su actividad. La imagen del gel muestra los productos de transcripción del extracto nuclear de larvas de C. elegans L4 utilizando la plantilla de ADN promotor de CMV. El aislamiento exitoso de proteínas nucleares activas dará como resultado un producto de PCR de 132 pb después de la transcripción in vitro, como se ve en los carriles 1 y 2. El aislamiento fallido dará como resultado una banda débil o la ausencia de un producto de PCR similar al carril 3. Esta visualización de la actividad de transcripción a través de la amplificación por PCR es una forma sencilla de evaluar la calidad del aislamiento de extracción nuclear. El control positivo de PCR se produce agregando la plantilla de ADN promotor de CMV a la reacción de PCR, y el control negativo carece de la plantilla de ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Placas de medios de crecimiento de nematodos
Agar-agar	20,4 g
Cloruro de sodio	2,8 g
Peptona bacto	2,3 g
dH2O	975 ml
Autoclave a 121 °C durante 30 min
Deje que el medio se enfríe a 50 °C antes de agregar lo siguiente
1 m De CaCl2 (Estéril)	1 ml
1 m mgSO4 (estéril)	1 ml
10.000 unidades/ml de nistatina (estéril)	3 ml
5 mg/ml de colesterol en etanol al 95% (filtro esterilizado)	1 ml
1M KPO4 pH 6.0 (Estéril)	25 ml

Tabla 1.

Búfer M9
KH2PO4	3 g
Na2HPO4	6 g
NaCl	5 g
dH2O	1.000 ml
Autoclave a 121 °C durante 15 min
1 m mgSO4 (estéril)	1 ml (añadir después del autoclave)
Tampón S-basal
KH2PO4	6 g
K2HPO4	1 g
NaCl	5,85 g
dH2O	1.000 ml
Autoclave a 121 °C durante 15 min
Colesterol 5 mg/ml (estéril)	1 ml (añadir después del autoclave)

Tabla 2.

Tampón hipotónico
Solución de stock	Volumen	Concentración final
1 M HEPES KOH pH 7,6	7,5 ml	15 mM
1 M KCl	5,0 ml	10 mM
1 m MgCl2	2,5 ml	5 mM
0,5 M EDTA	0,1 ml	0,1 mM
1 M sacarosa	175 ml	350 metros
dH2O	309,9 ml
Esterilizar el filtro

Tabla 3.

Búfer hipertónico
Solución de stock	Volumen	Concentración final
1 M HEPES KOH pH 7,6	7,5 ml	15 mM
1 M KCl	200 ml	400 metros
1 m MgCl2	2,5 ml	5 mM
0,5 M EDTA	0,1 ml	0,1 mM
10% Preadolescentes 20	5 ml	0.10%
50% glicerol	100 ml	10%
dH2O	184,9 ml
Esterilizar el filtro

Tabla 4.

MgCl2, 50 mM	1,5 μL
Mezcla rNTP, 10 mM cada una	1,0 μL
ADN de plantilla, 25 ng/μL	4,0 μL
H2O libre de RNasa	7,5 μL

Tabla 5.

Paso	Temp	Hora	Número de ciclo
Precalentar	37 °C	60 minutos	1x
Transcripción inversa	37 °C	60 minutos	1x
Sostener	10 °C		1x

Tabla 6.

Búfer de transcripción inversa 10x	2,0 μL
Mezcla dNTP (5 mM cada dNTP)	2,0 μL
Imprimación inversa de transcripción (10 μM)	2,0 μL
Inhibidor de la RNasa	1,0 μL
Transcriptasa inversa de Sensiscript	1,0 μL
H2O libre de RNasa	10,0 μL

Tabla 7.

H2O sin rnasa	6,25 μL
Imprimación de transcripción hacia adelante (10 μM)	2,5 μL
Imprimación inversa de transcripción (10 μM)	2,5 μL
PCR 2X Premezcla A	12,5 μL
Mezcla de enzimas pcr	0,25 μL

Tabla 8.

Paso	Temp	Hora	Número de ciclo
Dentadura inicial	92 °C	Años 60 s	1x
Desnaturalizar	92 °C	30 s
Recocer	59 °C	30 s	35x
Extensión	72 °C	30 s
Sostener	10 °C		1x

Tabla 9.

Discussion

C. elegans es un organismo modelo atractivo para estudiar el sistema de transcripción eucariota debido a su bajo costo de mantenimiento y la facilidad de manipulación genética. Aquí se describe un protocolo para el aislamiento consistente del extracto nuclear funcionalmente activo de L4 C. elegans . Aunque este protocolo se centró en visualizar la actividad de transcripción, el ADNc producido post-transcripcionalmente se puede cuantificar mediante RT-qPCR para obtener una medición más precisa de la actividad de ^{transcripción8}. Este método de aislamiento de proteínas nucleares de C. elegans puede ayudar a ampliar el estudio de la maquinaria de transcripción eucariota. Dado que C. elegans no es un cultivo de células en un plato o una colonia de levadura, sino más bien un animal que deambula libremente, aislar e investigar su extracto nuclear puede dar una idea más clara de cómo la maquinaria transcripcional puede cambiar con el tiempo o en varios entornos. Esto permite a los investigadores aprovechar el bajo costo y la resiliencia de C. elegans . C. elegans, a diferencia de otros organismos modelo o cultivos celulares, es mucho más indulgente cuando aparece contaminación bacteriana o por levaduras. Una población de C. elegans se puede limpiar fácilmente de la contaminación utilizando protocolos establecidos, ahorrando tiempo y esfuerzo cuando se produce la ^{contaminación9}. En general, el uso de extracto nuclear de C. elegans para ensayos bioquímicos puede ser una opción más asequible y flexible en comparación con la compra de extracto nuclear de un proveedor o el trato con organismos modelo menos indulgentes.

Si bien este protocolo es relativamente simple, todavía hay pasos críticos que requieren especial atención para el aislamiento exitoso del extracto nuclear. Es importante que durante la preparación de los tampones hipotónicos e hipertónicos completos, las dos soluciones estén claramente etiquetadas y separadas. Si los tampones se cambian en cualquier punto durante el aislamiento, esto podría conducir a la inactivación de las proteínas nucleares o a un fraccionamiento deficiente de las proteínas citosólicas de las proteínas nucleares. Las proteínas nucleares aisladas también deben, si es necesario, diluirse en tampón hipertónico, no en agua o cualquier otra solución. La alta concentración de sal ayuda a preservar la actividad de las proteínas, y una solución hipotónica puede matar esta ^actividad10.

Otro desafío que puede surgir durante la parte de molienda de este protocolo proviene de los escombros que se adhieren a la superficie de las bolas de tungsteno. Si bien se establece que las bolas deben lavarse y secarse después de cada ciclo de molienda, el material se unirá a la superficie lisa de las bolas. Este material generalmente aparece como anillos de color óxido alrededor de la circunferencia de las bolas y es lo suficientemente grueso como para bloquear el espacio entre la bola y la pared de la cámara de molienda. Este bloqueo es notable a medida que se vuelve cada vez más difícil empujar a los animales a través de la amoladora, lo que eventualmente puede provocar lesiones musculares o la ruptura de la jeringa. Si las bolas de tungsteno comienzan a mostrar decoloración, sumérjalas en agua caliente durante 5 minutos y luego limpie la superficie con una nueva almohadilla para estropear. Evite el uso de soluciones de limpieza ácidas o básicas. Después de pulir suavemente, las bolas de tungsteno deben volver a su brillo original, y será notablemente más fácil moler las muestras.

Este protocolo está diseñado para aislar el extracto nuclear entero de C. elegans. No ha sido probado para su uso en otros organismos modelo. El extracto nuclear de otros organismos puede requerir diferentes tampones, y el promotor del CMV puede no ser suficiente para impulsar la transcripción en otras muestras no mamíferas. El extracto nuclear recogido mediante este método tampoco es específico de tejidos o células; cualquier actividad de transcripción medida utilizando este método mira a los animales como un todo que puede ocultar los cambios sutiles entre los tejidos.

Los usos futuros de este protocolo podrían ser medir la maquinaria de reparación o replicación del ADN de C. elegans después del daño del ADN. La fracción citosólica recolectada durante el proceso de aislamiento podría utilizarse para medir la cantidad de proteínas solubles y cuantificar la actividad de estas proteínas de una manera similar a la medición de la transcripción.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010