活性 秀丽隐杆线 虫核提取物的分离及重建用于 体外 转录

Summary

在这里，我们描述了从幼虫4 C. elegans 中分离活性核提取物并在 体外 系统中可视化转录活性的详细方案。

Abstract

秀丽隐杆线虫 自1963年推出以来，一直是生物学研究的重要模型系统。然而， 秀丽隐杆线虫 尚未充分利用其核提取物（如 体外 转录和DNA复制）进行生物反应的生化研究。在生化研究中使用 秀丽隐杆线虫 的一个重大障碍是破坏线虫厚厚的外角质层，而不会牺牲核提取物的活性。虽然有几种方法用于破坏角质层，例如Dounce均质化或超声处理，但它们通常会导致蛋白质不稳定。没有建立从幼虫或成年 秀丽隐杆线虫 中分离活性核蛋白用于 体外 反应的方案。在这里，该协议详细描述了使用Balch均质机对幼虫4 C.秀丽隐杆线虫的 均质化。Balch均质机使用压力缓慢地迫使动物通过狭窄的间隙，在此过程中破坏角质层。Balch 均质机的统一设计和精密加工允许在实验之间对动物进行一致的研磨。分馏从Balch均质机获得的匀浆产生功能活性核提取物，可用于 体外 方法测定 秀丽隐杆线虫的转录活性。

Introduction

小型，自由生活的线虫 秀丽隐杆线虫 是一种简单而强大的模式生物，用于解决广泛的生物学问题。自1963年引入以来，线虫对于回答神经生物学，新陈代谢，衰老，发育，免疫和遗传学方面的问题非常宝贵¹。该动物的许多特征使其成为理想的模式生物，包括较短的生成时间，RNA干扰的有效性，透明的身体以及其细胞谱系和神经系统的完整图谱。

虽然线虫对科学的贡献是巨大的，但它们在阐明真核转录系统方面没有得到充分利用，我们对这些机制的大部分理解来自使用酵母，果蝇和哺乳动物细胞培养物的核提取物^的研究2。阻止研究人员提取功能性核提取物的最大障碍是线虫坚韧的外角质层。这种外骨骼由交联的胶原蛋白、角质层、糖蛋白和脂质组成，使秀丽隐杆线虫从幼虫期到成年期都耐通过化学或机械力提取蛋白质³。使用秀丽隐杆线虫核提取物的体外转录系统曾经开发出来，但由于系统范围有限，未被广泛采用，使用Dounce均质机制备提取物可能导致蛋白质不稳定^4，5。

与先前利用Dounce均质机破坏 秀丽隐杆线虫 的核提取物分离协议不同，该协议使用Balch均质机。Balch均质机由两个主要部件组成：一个碳化钨球和一个不锈钢块，其通道从一端钻到另一端。Balch均质机装有碳化钨球，并在两侧盖上盖子以密封研磨室。注射器可以装载在通往研磨室的两个垂直端口上。当材料通过研磨室从一个注射器传递到另一个注射器时，来自注射器的压力迫使材料通过球和腔室壁之间的狭窄间隙。这种缓慢而恒定的压力会破坏材料，直到它达到能够轻松穿过狭窄间隙的一致尺寸。通过恒定而温和的压力迫使 秀丽隐杆线虫 穿过狭窄的间隙，使动物打开，将它们的内容释放到周围的缓冲区中。切换球的大小进一步收紧间隙，破坏新释放的细胞并将细胞核释放到缓冲液中。多次离心将细胞核与其余的细胞碎片分开，从而可以收集干净的核提取物。Balch均质机优于Dounce均质机，原因如下：该系统可以处理大量动物，从而可以在一次尝试中提取大量活性蛋白;滚珠和钢块的精确加工允许在多个样品之间进行一致的磨削;重型钢块充当散热器，均匀地将热量从研磨室中吸走，防止变性。

分离后，核提取物转录活性必须在用于任何生化实验之前进行验证。传统上，使用放射性标记的核苷酸来测量转录活性，以跟踪和可视化新合成的RNA。然而，放射性标签可能很繁琐，因为它在使用和处置过程中需要采取预防措施⁶。技术进步使今天的研究人员能够使用危害性更小或麻烦得多的方法，使用定量实时荧光定量PCR（qRT-PCR）⁷等技术来测量即使是很小的RNA量。在这里，该协议描述了一种从幼虫4期（L4） 秀丽隐杆线虫 中分离活性核提取物并在 体外 系统中可视化转录活性的方法。

Protocol

1. 媒体准备

1. 按照制造商的说明准备无菌溶菌汤（LB）琼脂平板和液体培养基。
2. 条纹 大肠杆菌 （大肠杆菌）菌株OP50在LB琼脂平板上。将细菌条纹在37°C下孵育过夜。
3. 孵育后将 大肠杆菌 OP50条纹板储存在4°C。如果用parafilm包裹， 大肠杆菌 OP50板可以在4°C下安全储存2周，以防止水分流失。
4. 使用 表1中的配方准备2L线虫生长培养基（NGM）。
   注：制霉菌素是可选的。制霉菌素有助于防止霉菌和其他真菌污染物在NGM板上生长。当取下盖子进行浇注和播种 大肠杆菌 OP50时，直径为150毫米的大板具有更高的捕获真菌孢子的机会。制霉菌素可以以10，000单位/mL的价格从供应商处购买预混合在无菌溶液中，也可以作为无菌粉末购买并与无菌水混合。制霉菌素不能被高压灭菌，也不能被有效地过滤灭菌。在实验室中混合制霉菌素溶液时，注意无菌技术至关重要。高压灭菌器1M _CaCl2，1M _KPO4 pH 6.0和1 M _MgSO4 在121°C下15分钟。过滤溶解在95%乙醇中后，通过0.22μm过滤器对胆固醇进行灭菌。
5. 将试剂加入培养基后，将NGM倒入40个150mm培养皿中。每个 150 mm 培养皿需要 50 mL 才能灌装。让NGM板在室温下冷却过夜。
6. 接种两个50 mL锥形管，其中含有25 mL无菌LB和先前条纹板 中的大肠杆菌 OP50。将肉汤在37°C下在保持200rpm的振荡培养箱中孵育24小时。
   注意：为了保持一致性，请用条纹板中的相同菌落接种两个管。如果这被证明是困难的，请在50 mL锥形管中接种5mL无菌LB和单个集落，并在制备NGM板前一天在37°C下在保持200rpm的振荡培养箱中孵育培养物16小时。将新鲜液体培养物储存在4°C下长达两天。将两个25mL的肉汤与25μL液体培养物接种，并在上述相同条件下孵育。
7. 用1 mL新鲜 大肠杆菌 OP50液体培养物播种新鲜的NGM板，并用火焰灭菌的撒布机无菌均匀地撒在板的表面上，以形成覆盖大部分板的大细菌草坪，注意不要将细菌从边缘传播到另一边缘。让 大肠杆菌 OP50在室温下生长72-96小时，或直到出现明显厚的草坪。
   注意：24小时后，将新鲜播种的NGM板移动到有盖的容器中，以减少水分损失并延长板的使用寿命。

2. 动物制剂与漂白剂同步

1. 将5个喂养良好的野生型，妊娠的成年 秀丽隐杆线虫 转移到10个用 大肠杆菌 OP50播种的新鲜NGM板中的每一个，总共50只动物。
2. 让动物产卵。让后代在20°C下生长，直到它们达到妊娠成虫阶段。
3. 使用15 mL M9缓冲液（表2）从10个维护板中收集新的喂养良好的野生型妊娠成虫，并将动物转移到标记的15 mL锥形管中。
4. 将动物以1，000× g 离心3分钟，以在管的底部沉淀所有动物。
5. 在另一个单独的，标记的15 mL锥形管中，将2 mL漂白剂与5 mL 1 N NaOH混合以进行漂白同步。涡旋溶液以彻底混合。
   注意：在准备有效的当天使用漂白剂+ NaOH溶液。
6. 使用10 mL无菌移液管从离心动物中轻轻除去上清液。尝试去除尽可能多的M9缓冲液，以改善动物的断裂。
7. 向动物沉淀中加入500μL漂白剂+ NaOH溶液，并启动计时器4分钟。
8. 用手或使用摇杆，轻轻摇晃管子以完全打破动物颗粒，让动物在漂白剂+ NaOH溶液中自由移动。继续摇晃管子整整4分钟。
   注意：所需的漂白剂+ NaOH溶液的量可能因同步动物颗粒的大小而异。事先用不同数量的动物和漂白剂+ NaOH溶液优化这种技术。
9. 4分钟后，在解剖显微镜下检查破碎效率。确保大部分受肉的成年动物破碎，并释放其内部内容物，包括卵。
10. 如果动物没有分开，以最大速度短暂涡旋管，然后在显微镜下再次检查。
    注意：虽然鸡蛋对漂白剂+ NaOH溶液具有抗性，但它们并非不透水。鸡蛋不得暴露于漂白剂+ NaOH溶液中超过必要的时间。在动物破碎步骤中停滞太长时间会导致后代的发育问题。
11. 将10mL M9缓冲液加入破碎的动物溶液中。
12. 将鸡蛋和剩余的物以1，000× g 离心3分钟。
13. 移液上清液，确保不要触摸管底部含有所有卵的新沉淀。
14. 再加入10mL的M9缓冲液，并在1，000×g下再次离心3分钟 。
15. 重复步骤2.13-2.14两次，以确保没有漂白剂+ NaOH溶液残留。
16. 第三次M9缓冲液洗涤后，除去上清液并加入10mL的S基底缓冲液（表2）。
17. 倒置管子以打破底部的沉淀，以将卵均匀地悬浮在缓冲液中。
18. 将管子放在摇臂上，在20°C下轻轻摇动管子22小时，以使卵孵化并达到幼虫1期（L1）停止。
19. 22小时后，将含有同步L1动物的管子在1000× g下离心3分钟。
20. 移液并弃去上清液，在试管中留下约1mL缓冲液。
21. 使用微量移液管，扰乱动物沉淀，使L1动物在剩余的缓冲液中均匀悬浮液。
22. 将L1动物均质悬浮液的单个液滴转移到用 大肠杆菌 OP50播种的标记的150mm NGM板中。
23. 通过使用解剖显微镜直观地计算每滴L1动物的数量，计算每滴动物的动物密度。带有完全生长的大 肠杆菌 OP50草坪的150毫米NGM板可以支持L1阶段的多达500只动物达到妊娠成虫阶段。
24. 将L1动物转移到六个带有 大肠杆菌 OP50的150 mm NGM板中。确保板不会过载。
    注意：如果不清楚动物是否有足够的食物在L1和妊娠成体之间发育，请在每个盘子中添加更少的动物并使用更多的盘子。
25. 让动物在20°C下生长72小时，直到它们达到妊娠成虫阶段并开始产卵。
26. 对同步的、喂养良好的野生型妊娠成年动物进行第二轮漂白同步。
27. 将同步的L1动物放在十个150毫米NGM板上，接种了 大肠杆菌 OP50，每个板约1，000只动物。
28. 让新的同步L1动物在20°C下生长48小时，直到它们达到L4阶段。
    注意：目标是获得约700 - 800μLLLLL动物的沉淀。太多的动物会使使用Balch均质机变得困难;这可能导致操作均质机时肌肉拉伤，并且由于压力增加而可能导致注射器泄漏。

3. 巴尔奇均质机制备

1. 准备低渗和高渗缓冲液，如 表3 和 表4所述。
   注意：低渗和高渗缓冲液可以提前制备并安全储存在4°C。
2. 用70%乙醇淹没研磨室来清洁Balch均质机，然后用去离子水冲洗室以除去多余的乙醇。
   注意：避免使用任何腐蚀剂清洁Balch均质机。用乙醇和去离子水彻底冲洗应足以清洁它。
3. 将7.9820 mm（18 μm间隙）的碳化钨球插入研磨室。
4. 盖上Balch均质机枪管的每一端，并用提供的指旋螺钉固定盖子。
5. 每个样品准备5mL"完全低渗缓冲液"：加入5μL1M DTT（终浓度：1mM DTT）和100μL100x蛋白酶抑制剂，一次性鸡尾酒（终浓度：2x）。将缓冲液保持在冰上。
6. 每个样品准备5mL"完全高渗缓冲液"：加入5μL1M DTT（终浓度：1mM DTT）和100μL100x蛋白酶抑制剂，一次性鸡尾酒（终浓度：2x）。将缓冲液保持在冰上。
   注意：在制备当天使用完整的低渗和高渗缓冲液。请勿将其存储以供日后使用。将 1 M DTT 作为一次性等分试样储存在 -20 °C。 将蛋白酶抑制剂一次性使用混合物储存在4°C。
7. 在无菌的2 mL注射器中加入1 mL"完全低渗缓冲液"，然后轻轻冲洗Balch均质机的研磨室。在腔室中留下约500μL"完全低渗缓冲液"。
8. 将冲洗过的均质机存放在冰上，冷却30分钟。
   注意：在研磨动物之前，均质机必须是冰冷的。研磨过程会因摩擦而产生热量，并使核蛋白变性。确保金属均质机是冰冷的，以帮助防止这种情况发生。确保避免周围冰中的任何水进入均质机。使用两个无菌注射器堵塞均质机中的孔，并阻止任何无意的液体进入研磨室。

4. 动物收集

注：提供了快速参考指南，标记了收集、破坏和分馏动物的主要步骤（图1）。

1. 将喂养良好的L4动物与M9缓冲液收集在15mL锥形管中，并以1000× g 离心动物3分钟。除去上清液并继续洗涤动物沉淀，直到上清液清除。
2. 用3mL的4°C低渗缓冲液洗涤动物，并在1000× g 下再次离心3分钟。
   注意：在用4°C低渗缓冲液进行最终洗涤期间，动物可能会粘在管的侧面。这是正常的，在去除上清液期间可能导致动物的小幅损失。
3. 除去低渗缓冲液，并向动物沉淀中加入1mL"完全低渗缓冲液"。将动物悬浮液转移到新的2 mL无菌注射器中。
   注意：使用微量移液管将动物转移到注射器时，轻轻移取无菌的0.1%吐温20溶液以覆盖移液器吸头的内部，以减少由于粘附在移液器吸头壁而丢失的动物数量。

5. 分馏

1. 在冰上，通过轻轻地将动物推过装有7.9820毫米球的Balch均质机的研磨室并放入新的无菌注射器中，使动物均质化。重复推动动物通过研磨室30个完整的周期。
   注意："完整循环"定义为注射器柱塞的完整上下运动。
   该磨削步骤使用 7.9820 mm 球（18 μm 滚珠轴承）。
2. 30个循环后，从Balch均质机中取出尽可能多的动物悬浮液并储存注射器，倒入1.7 mL微管中。
3. 从研磨室中取出7.9820 mm的球，并用去离子水清洁。干燥并将球放回其标记的管中。
4. 将7.9880 mm（12 μm间隙）的球插入研磨室并重新密封均质机。
5. 用1 mL冰冷的"完全低渗缓冲液"再次冲洗研磨室。
6. 研磨悬浮液25个完整的周期。
7. 25个循环后，从Balch均质机中取出动物悬浮液，将悬浮液转移到干净的1.7 mL微管中，并将其储存在冰上。
   注：用70%乙醇和去离子水拆卸并清洁Balch均质机。确保将7.9880 mm的球返回到其正确的管中。
8. 通过将悬浮液在500× g， 4°C下离心5分钟来沉淀动物体和碎屑。
9. 将40μL上清液移液到标有"输入级分"的管中，并将其储存在冰上。
   注意：用防酒精笔写下所有标签，以避免以后涂抹它们。
10. 将剩余的上清液转移到新的1.7mL管中，注意避免接触管底部的沉淀，然后丢弃沉淀。
11. 离心上清液以4，000× g，4°C沉淀细胞核5分钟。
12. 将上清液转移到新的1.7 mL管中，小心不要干扰沉淀的细胞核，并将管标记为"胞质部分"。
    注意：将细胞质级分在17，000× g，4°C下进一步离心30分钟以除去任何剩余的不溶性物质，并将其用作蛋白质印迹（特别是核蛋白）的阴性对照。
13. 用500μL"完全低渗缓冲液"洗涤细胞核沉淀，并将沉淀转移到新的1.7mL管中。将悬浮沉淀在4，000× g， 4°C下离心5分钟。
14. 弃去上清液，向核沉淀中加入500μL新鲜的"完全低渗缓冲液"，并将悬浮液转移到新的1.7mL管中。再次将样品在4，000× g， 4°C下离心5分钟。
15. 除去上清液并将沉淀溶解在40μL"完全高渗缓冲液"中。将新的核悬浮液转移到新的1.7 mL管中，将管标记为"核部分"，并将其储存在冰上。
16. 使用荧光定量试剂盒测定三个组分的蛋白质浓度。
    注意：从该方法获得的核蛋白量范围为1-2μg/ μL。
17. 将核级分等分到含有6μg核蛋白的一次性管中，并在干冰和乙醇浴中快速冷冻。储存在-80°C直至进一步使用。

6. 转录试验

1. 打开并将加热块预热至30°C。
2. 从Nulcear提取物体外转录系统中除去以下内容：50 mM MgCl2，核提取物1x转录缓冲液，100 mM rATP，100 mM rCTP，100 mM rGTP，100 mM rUTP和CMV启动子阳性对照模板。在冰上解冻。
   注意：使用高保真聚合酶扩增阳性对照DNA模板，并将其存储为标准化的一次性等分试样。
3. 在制备10 mM工作溶液之前，混合并离心解冻的rNTPs。
   注意：将每个rATP，rCTP，rGTP和rUTP的2μL加入12μL的_H2O中，以实现每个rNTP的10 mM。如有必要，可以按比例放大此组合。
4. 将rNTP混合物等分到标记的一次性管中，并储存在-20°C以备将来使用。
5. 在标有"Mastermix"的新鲜1.5 mL管中，按表5所述为每个反应添加试剂
6. 将14μL母混液转移到每个反应管中
7. 向每个反应管中加入11μL减去（5μg核提取物的体积）的1x转录缓冲液。
8. 向每个反应管中加入5μg核提取物。
9. 轻轻敲击反应管以混合内部内容物，并在混合后脉冲离心管，以确保没有反应材料粘在管壁上。
10. 将反应在30°C孵育30分钟。
11. 通过加入RNA提取试剂盒提供的400μLRLT缓冲液立即停止反应。
    注意：此时，可以安全地停止。样品可以储存在-80°C，直到用RNA提取试剂盒进一步清理。

7. 核糖核酸净化

1. 使用RNA提取试剂盒中提供的无RNase DNase套装制备DNase I储备溶液。将冻干的DNase I溶解在550μL无RNase水中。轻轻混合溶液。不要涡旋 。将DNase I溶液等分到10μL一次性管中，并将等分试样储存在-20°C。
2. 使用分子级乙醇和不含RNase的水制备70%和80%乙醇。
3. 在开始纯化之前，将样品和试剂移动到无RNase的工作空间。
4. 向每个样品中加入400μL70%乙醇，并轻轻移液以充分混合。
5. 将400μL样品转移到带有2mL收集管的标记RNA提取离心柱中，并将样品以8，500× g 离心30秒。丢弃流出。
6. 对剩余的样品重复步骤7.5，并丢弃流经的液体。
7. 向每色谱柱中加入350μLRW1缓冲液（RNA提取试剂盒）。将色谱柱以8，500 x g 离心30秒。丢弃流出。
8. 将70μLRDD缓冲液（RNA提取试剂盒）加入单个10μL等分试样的DNase I储备溶液中，并轻轻混合。不要涡旋。
9. 将DNase I孵育混合物（80μL）直接加入离心柱膜中。将色谱柱在室温下孵育15分钟。
   注意：确保将DNase I溶液添加到膜中。避免将部分溶液流失到立柱壁或O形圈上。
10. 15分钟后，向色谱柱中加入350μLRW1缓冲液。在8，500 x g下离心30 秒。 丢弃流出。
11. 将色谱柱放入新的 2 mL 收集管中。向离心柱中加入500μLRPE缓冲液（RNA提取试剂盒）。将色谱柱以8，500× g 离心30秒以洗涤膜。丢弃流出。
12. 向每个色谱柱中加入500μL80%乙醇，并以8，500× g 离心柱30秒。丢弃流出。
13. 将色谱柱放入新的 2 mL 收集管中。打开色谱柱盖，以17，900× g 离心柱子5分钟。丢弃流出。
14. 将色谱柱放入标记的 1.7 mL 离心管中。将17μL无RNase水直接加入离心柱膜的中心。让色谱柱在室温下静置1分钟。将色谱柱以17，900× g 离心1分钟。
15. 弃去色谱柱，将1.7 mL管与新鲜纯化的RNA样品一起保存。

8. 基因消化

1. 在37°C和65°C下预热两个加热块。
2. 向每个样品中加入2μL10x反应缓冲液。
3. 向每个样品中加入1μL（1 MBU）的DNA酶。
4. 将移液器设置为10μL，并上下移取新溶液以轻轻混合。不要涡旋。
5. 将RNA样品在37°C下孵育30分钟以消化任何剩余的DNA。
6. 通过将样品在65°C的热块上孵育10分钟来灭活DNase。
   注意：在此步骤停止并将RNA储存在-80°C以稍后进行逆转录是安全的。

9. 逆转录

1. 当对热循环仪进行编程时，在孵育前再加入1小时，37°C步骤以预热热循环器。在制备样品时，使用"预热步骤"运行程序，让热循环仪达到37°C。 当用于逆转录的样品准备就绪时，跳过37°C预热步骤，进入实际的孵育步骤（表6）。如果热循环器没有跳跃功能，请在孵育前加入1分钟37°C步骤。让热循环仪加热到适当的温度，然后暂停系统并添加准备好的样品。
2. 在不含RNase的_H2O中制备10μM转录反向引物的工作溶液，并将其储存在冰上。
3. 在冰上解冻，从逆转录试剂盒中取出10x缓冲液，dNTP混合物（每个dNTP5mM），RNase抑制剂和逆转录酶。
4. 通过将 表7 中提到的成分加入干净的0.2 mL PCR管中来制备预混液（每个反应）。
5. 将18μL的预混液等分到新的0.2mL PCR管中，用于每个样品。
6. 将每个样品的2μLDNase处理RNA加入其各自标记的管中。
7. 将样品在预热的热循环器中在37°C下孵育1小时。
8. 将样品移至-20°C进行逆转录后储存或直接进入下一步。
   注意：在此步骤停止是安全的;将cDNA储存在-20°C供以后使用。

10. 特定产品扩增

1. 冰解冻：cDNA、10 μM正向转录和10 μM转录反向引物，以及PCR 2x预混A。
   注：将PCR 2x预混料A等分到较小的体积中，以减少解冻时间。
2. 通过将 表8 中提到的成分加入干净的0.2 mL PCR管中来创建预混液（每个反应）。
3. 将每个样品的24μL预混液等分到清洁标记的0.2 mL PCR管中。
4. 将每个样品的1μLcDNA加入其各自的管中。
5. 使用表9中提到的程序条件在热循环器中孵育样品
6. 孵育后，将PCR产物储存在4°C或-20°C以进行长期储存。

11. 凝胶分析

1. 使用1x TAE缓冲液制备含有2%w / v琼脂糖和1x凝胶染色剂的凝胶。
2. 将PCR产物在50 V和300 mA下运行1小时或直到有明确的条带分离。
3. 使用凝胶成像仪中预加载的自动曝光程序对凝胶进行成像。

Representative Results

按照概述的步骤应产生功能性核提取物 （图1），研磨或洗涤步骤的偏差可能导致活性差或产量低。如果获得功能性 秀丽隐杆线虫 核提取物，当添加到前面描述的 体外测定中 时，它将转录DNA模板上CMV启动子下游的区域。所得RNA转录本可以使用常规方法从核蛋白和DNA模板中纯化。如果没有模板DNA，逆转录和随后的PCR产物只能是核提取物转录的RNA的结果。PCR产物可以在琼脂糖凝胶上可视化，DNA条带的强度可以指示核蛋白和RNA分离的质量。弱能带强度可能是由于加热或缓冲液制备不良而使核提取物失活引起的。过强的条带强度可能是由于RNA纯化不良或DNA酶消化不当而导致的DNA污染的结果。一致且成功的核分离将产生相似强度的条带，转录和PCR阴性对照均不应具有可见的PCR产物（图2）。

图 1.核提取物隔离概述。 该流程图概述了从 秀丽隐杆线虫中分离核提取物的主要步骤。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 2. 秀丽隐杆线虫 核提取物保持其活性。 凝胶图像显示了使用CMV启动子DNA模板的 秀丽隐杆线虫 L4幼虫核提取物的转录产物。成功分离活性核蛋白将在 体外 转录后产生132 bp PCR产物，如泳道1和2所示。分离不成功将导致窄带或缺乏类似于泳道3的PCR产物。通过PCR扩增对转录活性进行可视化是评估核提取分离质量的简单方法。通过将CMV启动子DNA模板添加到PCR反应中产生阳性PCR对照，阴性对照缺少模板DNA。 请点击此处查看此图的放大版本。

线虫生长培养基板
琼脂	20.4克
氯化钠	2.8克
巴豆蛋白胨	2.3克
dH2O	975 毫升
在121°C高压灭菌30分钟
让培养基冷却至50°C，然后添加以下
1 M 氯化钙 2 （无菌）	1 毫升
1 M 毫克SO4 （无菌）	1 毫升
10，000 单位/mL 制霉菌素（无菌）	3 毫升
5毫克/毫升胆固醇在95%乙醇（过滤灭菌）	1 毫升
100 万 KPO4 pH 6.0 （无菌）	25 毫升

表 1.

M9 缓冲器
KH2PO4	3 克
4-氯乙酸钠	6 克
氯化钠	5 克
dH2O	1，000 毫升
在121°C高压灭菌15分钟
1 M 毫克SO4 （无菌）	1 mL（高压灭菌后加入）
S-基础缓冲液
KH2PO4	6 克
K2HPO4	1 克
氯化钠	5.85克
dH2O	1，000 毫升
在121°C高压灭菌15分钟
胆固醇 5 毫克/毫升 （无菌）	1 mL（高压灭菌后加入）

表 2.

低渗缓冲液
库存解决方案	卷	最终浓度
1 M 高等碱性肝素 pH 7.6	7.5 毫升	15毫米
1 M 千氯化物	5.0 毫升	10 毫米
1 M 氯化镁2	2.5 毫升	5 毫米
0.5 M 艾迪安达	0.1 毫升	0.1 毫米
1 M 蔗糖	175 毫升	350 毫米
dH2O	309.9 毫升
过滤器灭菌

表 3.

高渗缓冲液
库存解决方案	卷	最终浓度
1 M 高等碱性肝素 pH 7.6	7.5 毫升	15毫米
1 M 千氯化物	200 毫升	400 平方米
1 M 氯化镁2	2.5 毫升	5 毫米
0.5 M 艾迪安达	0.1 毫升	0.1 毫米
10% 吐温 20	5 毫升	0.10%
50%甘油	100 毫升	10%
dH2O	184.9 毫升
过滤器灭菌

表 4.

氯化镁2，50 mM	1.5 μL
rNTP 混合物，每个 10 mM	1.0 μL
模板DNA，25纳克/μL	4.0 μL
不含 RNase 的 H2O	7.5 μL

表 5.

步	临时	时间	周期数
预热	37 °C	60 分	1 倍
反转录	37 °C	60 分	1 倍
拿	10 °C		1 倍

表 6.

10x 逆转录缓冲液	2.0 μL
dNTP 混合 （每个 dNTP 5 mM）	2.0 μL
转录反向引物 （10 μM）	2.0 μL
RNase 抑制剂	1.0 μL
敏感性逆转录酶	1.0 μL
不含 RNase 的 H2O	10.0 μL

表 7.

不含 RNase 的 H2O	6.25 μL
转录正向引物 （10 μM）	2.5 μL
转录反向引物 （10 μM）	2.5 μL
PCR 2X 预混料 A	12.5 μL
聚合酶链酶制剂	0.25 μL

表 8.

步	临时	时间	周期数
初始变性	92 °C	60 秒	1 倍
变性	92 °C	30 秒
退火	59 °C	30 秒	35 倍
外延	72 °C	30 秒
拿	10 °C		1 倍

表 9.

Discussion

秀丽隐杆线虫 是一种研究真核转录系统的有吸引力的模式生物，因为它的维护成本低，易于遗传操作。这里描述了从L4 C. elegans 中一致分离功能活性核提取物的方案。虽然该协议侧重于可视化转录活性，但转录后产生的cDNA可以使用RT-qPCR进行定量，以获得更精确的转录活性测量⁸。这种从 秀丽隐杆线虫 中分离核蛋白的方法可以帮助扩大真核转录机制的研究。由于 秀丽隐杆线虫 不是培养皿或酵母菌落中的细胞培养物，而是一种自由漫游的动物，因此分离和研究其核提取物可以更清楚地了解转录机制如何随时间或各种环境而变化。这使得研究人员能够利用 秀丽隐杆线虫的 低成本和弹性。 秀丽隐杆线虫 与其他模式生物或细胞培养物不同，当细菌或酵母污染出现时，秀丽隐杆线虫会更加宽容。秀 丽隐杆线虫 的种群可以使用既定的协议轻松清除污染，在污染发生时节省时间和精力⁹。总体而言，与从供应商处购买核提取物或处理不太宽容的模式生物相比，使用秀 丽隐杆线虫 的核提取物进行生化测定可能是一种更实惠，更灵活的选择。

虽然该协议相对简单，但仍有一些关键步骤需要特别注意才能成功分离核提取物。重要的是，在制备完整的低渗和高渗缓冲液期间，两种溶液被清楚地标记和分离。如果在分离过程中的任何一点切换缓冲液，这可能导致核蛋白失活或细胞质蛋白从核蛋白中分离不良。如有必要，分离的核蛋白也应在高渗缓冲液中稀释，而不是在水或任何其他溶液中稀释。高盐浓度有助于保持蛋白质的活性，低渗溶液可以杀死这种活性¹⁰。

在该协议的研磨部分可能出现的另一个挑战来自粘附在钨球表面的碎屑。虽然声明球应在每个研磨周期后清洗和干燥，但材料将附着在球的光滑表面上。这种材料通常表现为球周周围的锈色环，并且足够厚，可以阻挡球和研磨室壁之间的间隙。这种堵塞是显而易见的，因为推动动物通过研磨机变得越来越困难，这最终可能导致肌肉损伤或注射器破裂。如果钨球开始变色，请将其浸泡在热水中5分钟，然后用新的擦洗垫清洁表面。避免使用酸性或碱性清洁溶液。轻轻抛光后，钨球应恢复到原来的光泽，并且研磨样品将明显更容易。

该协议旨在从 秀丽隐杆线虫中分离出整个核提取物。它尚未经过测试可用于其他模式生物。来自其他生物体的核提取物可能需要不同的缓冲液，并且CMV启动子可能不足以驱动其他非哺乳动物样品中的转录。使用这种方法收集的核提取物也不是组织或细胞特异性的;使用这种方法测量的任何转录活性都将动物视为一个整体，这可能隐藏组织之间的微妙变化。

该协议的未来用途可能是测量DNA损伤后 秀丽隐杆线虫 的DNA修复或复制机制。在分离过程中收集的胞质部分可用于测量可溶性蛋白质的量，并以类似于测量转录的方式量化这些蛋白质的活性。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010