Isolamento da Caenorhabditis Ativa elegans Extrato Nuclear e Reconstituição para Transcrição In Vitro

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para isolar o extrato nuclear ativo do estágio 4 C. elegans larval e visualizar a atividade de transcrição em um sistema in vitro .

Abstract

Caenorhabditis elegans tem sido um importante sistema modelo de pesquisa biológica desde que foi introduzido em 1963. No entanto, C. elegans não foi totalmente utilizado no estudo bioquímico de reações biológicas usando seus extratos nucleares, como transcrição in vitro e replicação de DNA. Um obstáculo significativo para o uso de C. elegans em estudos bioquímicos é interromper a grossa cutícula externa do nematoide sem sacrificar a atividade do extrato nuclear. Embora vários métodos sejam usados para quebrar a cutícula, como homogeneização de Dounce ou sonicação, eles muitas vezes levam à instabilidade proteica. Não há protocolos estabelecidos para isolar proteínas nucleares ativas de larvas ou adultos C. elegans para reações in vitro . Aqui, o protocolo descreve detalhadamente a homogeneização do estágio larval 4 C. elegans utilizando um homogeneizador Balch. O homogeneizador Balch usa pressão para forçar lentamente os animais através de uma estreita abertura quebrando a cutícula no processo. O design uniforme e a usinagem precisa do homogeneizador Balch permitem uma moagem consistente de animais entre experimentos. Fracionar o homogeneizador obtido a partir do homogeneizador Balch produz extrato nuclear funcionalmente ativo que pode ser usado em um método in vitro para avaliar a atividade de transcrição de C. elegans.

Introduction

O pequeno nematode caenorhabditis elegans é um organismo modelo simples, mas poderoso, para abordar uma ampla gama de questões biológicas. Desde sua introdução em 1963, os nematoides têm sido inestimáveis para responder perguntas em neurobiologia, metabolismo, envelhecimento, desenvolvimento, imunidade e ^genética1. Algumas das muitas características do animal que o tornam um organismo modelo ideal incluem o curto tempo de geração, a eficácia da interferência do RNA, o corpo transparente e os mapas completos de sua linhagem celular e sistema nervoso.

Embora as contribuições do nematode para a ciência sejam vastas, elas têm sido subutilizados para elucidar o sistema de transcrição eucariótica, com a maioria de nosso entendimento sobre esses mecanismos provenientes de estudos que usam extrato nuclear de levedura, mosca-das-frutas e cultura celular de ^mamíferos2. O maior obstáculo que dissuade os pesquisadores de extrair extrato nuclear funcional é a dura cutícula externa do nematode. Este exoesqueleto compreende collagens transversais, cuticlins, glicoproteínas e lipídios, tornando C. elegans do estágio larval à idade adulta resistente à extração de proteínas através de forças químicas ou ^mecânicas3. Um sistema de transcrição in vitro usando extrato nuclear C. elegans já foi desenvolvido, mas não amplamente adotado devido ao escopo limitado do sistema, e o uso de homogeneizador Dounce para a preparação do extrato poderia levar à instabilidade proteica4,5.

Ao contrário do protocolo anterior para isolamento de extrato nuclear que utilizava um homogeneizador do Dounce para quebrar C. elegans, este protocolo usa um homogeneizador Balch. O homogeneizador Balch consiste em dois componentes principais: uma bola de carboneto de tungstênio e um bloco de aço inoxidável com um canal entediado de uma extremidade para outra. O homogeneizador Balch é carregado com a bola de carboneto de tungstênio e tampado em ambos os lados para selar a câmara de moagem. As seringas podem ser carregadas nas duas portas verticais que levam à câmara de moagem. À medida que o material é passado de uma seringa para a outra através da câmara de moagem, a pressão das seringas força o material através de uma estreita distância entre a bola e a parede da câmara. Esta pressão lenta e constante quebra o material até atingir um tamanho consistente que é capaz de passar pela estreita lacuna facilmente. Forçando C. elegans através da estreita lacuna através de uma pressão constante, mas suave, quebra os animais abertos, liberando seu conteúdo no buffer circundante. A troca de tamanhos de esfera aperta ainda mais a lacuna, quebrando as células recém-liberadas e libera os núcleos para o buffer. Vários casos de centrifugação separam os núcleos do resto dos detritos celulares, permitindo a coleta de um extrato nuclear limpo. O homogeneizador Balch é preferido em vez do homogeneizador do Dounce por várias razões: o sistema pode lidar com um grande número de animais, possibilitando extrair uma alta quantidade de proteínas ativas em uma única tentativa; a usinagem precisa das bolas e do bloco de aço permite uma moagem consistente entre múltiplas amostras; o bloco de aço pesado age como um dissipador de calor, afastando uniformemente o calor da câmara de moagem, impedindo a desnaturação.

Após o isolamento, a atividade transcricional do extrato nuclear deve ser verificada antes de ser usada em qualquer experimento bioquímico. Tradicionalmente, a atividade de transcrição era medida usando nucleotídeos radiolabelados para rastrear e visualizar o RNA recém-sintetizado. No entanto, a rotulagem radioativa pode ser pesada, pois requer precaução durante o uso e ^descarte6. Os avanços tecnológicos permitem que os pesquisadores de hoje usem métodos muito menos prejudiciais ou problemáticos para medir até mesmo pequenas quantidades de RNA usando técnicas como PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR)⁷. Aqui, o protocolo descreve um método para isolar o extrato nuclear ativo do estágio larval 4 (L4) C. elegans e visualizar a atividade de transcrição em um sistema in vitro.

Protocol

1. Preparações de mídia

1. Prepare placas de ágar estéril (LB) e mídia líquida seguindo as instruções do fabricante.
2. Streak Escherichia coli (E. coli) cepa OP50 em uma placa de ágar LB. Incubar a raia das bactérias a 37 °C durante a noite.
3. Armazene a placa de raia E. coli OP50 a 4 °C após a incubação. A placa E. coli OP50 pode ser armazenada com segurança a 4 °C por 2 semanas se embrulhada em parafilme para evitar a perda de umidade.
4. Prepare 2 L de Nematode Growth Media (NGM) utilizando a receita na Tabela 1.
   NOTA: Nystatin é opcional. A nystatina ajuda a evitar que o mofo e outros contaminantes fúngicos cresçam nas placas de GNM. As grandes placas de 150 mm de diâmetro têm maior chance de pegar esporos fúngicos quando a tampa é removida para derramamento e semeadura E. coli OP50. A nystatina pode ser adquirida em solução estéril de fornecedores a 10.000 unidades/mL ou pode ser comprada como pó estéril e misturada com água estéril. A nystatina não pode ser autoclavada, nem pode ser efetivamente filtrada esterilizada. A atenção à técnica asséptica é crucial ao misturar uma solução de nystatina no laboratório. Autoclave 1 M _CaCl2, 1 M _KPO4 pH 6.0 e 1 M MgSO4 a 121 °C por 15 min. O filtro esteriliza o colesterol através de um filtro de 0,22 μm após ser dissolvido em 95% de etanol.
5. Depois de adicionar os reagentes à mídia, despeje NGM em 40 pratos petri de 150 mm. Cada prato de 150 mm requer 50 mL para encher. Deixe as placas de NGM esfriarem durante a noite à temperatura ambiente.
6. Inocula dois tubos cônicos de 50 mL contendo 25 mL de LB estéril com E. coli OP50 da placa de raia anterior. Incubar o caldo a 37 °C por 24 h em uma incubadora de agitação mantida a 200 rpm.
   NOTA: Para consistência, inocular ambos os tubos com a mesma colônia única da placa de raia. Se isso se mostrar difícil, inocular 5 mL de LB estéril com uma única colônia em um tubo cônico de 50 mL e incubar a cultura por 16 h a 37 °C em uma incubadora de agitação mantida a 200 rpm um dia antes de preparar as placas de NGM. Armazene a cultura líquida fresca a 4 °C por até dois dias. Inocular os dois 25 mL de caldo com 25 μL de cultura líquida e incubar nas mesmas condições mencionadas acima.
7. Sementes placas de NGM frescas com 1 mL de cultura líquida E. coli OP50 fresca e espalhadas com uma chama esterilizada espalhador uniformemente pela superfície da placa asepticamente para criar um grande gramado de bactérias que cobre a maioria da placa, tomando cuidado para não espalhar as bactérias de borda a borda. Permita que o E. coli OP50 cresça à temperatura ambiente por 72-96 h ou até que um gramado visivelmente grosso apareça.
   NOTA: Após 24 horas, mova as placas de GNM recém-semeadas para um recipiente coberto para reduzir a perda de umidade e prolongar a vida útil das placas.

2. Preparações para animais e sincronização alvejante

1. Transfira 5 c . elegans adultos bem alimentados, do tipo selvagem e gravid para cada uma das 10 placas de NGM frescos semeadas com E. coli OP50, para um total de 50 animais.
2. Permita que os animais coloquem ovos. Deixe a prole crescer a 20 °C até chegar ao estágio adulto gravid.
3. Use 15 mL de tampão M9 (Tabela 2) para coletar os novos adultos de tipo selvagem bem alimentados das dez placas de manutenção e transferir os animais para um tubo cônico de 15 mL rotulado.
4. Centrifugar os animais a 1.000 x g por 3 min para pelotar todos os animais na parte inferior do tubo.
5. Em um tubo cônico separado, rotulado de 15 mL, misture 2 mL de alvejante com 5 mL de 1 N NaOH para sincronização alvejante. Vórtice a solução para misturar completamente.
   NOTA: Use a solução alvejante + NaOH no mesmo dia em que estiver preparada para ser eficaz.
6. Remova suavemente o supernatante dos animais centrifugados usando uma pipeta estéril de 10 mL. Tente remover o máximo de tampão M9 possível para melhorar a quebra de animais.
7. Adicione 500 μL da solução de alvejante + NaOH à pelota animal e inicie um temporizador por 4 min.
8. Seja à mão ou usando um roqueiro, balance suavemente o tubo para quebrar completamente a pelota animal e deixe os animais se moverem livremente na solução alvejante + NaOH. Continue balançando o tubo durante toda a duração de 4 minutos.
   NOTA: A quantidade de alvejante + solução NaOH necessária pode variar dependendo do tamanho da pelota animal ser sincronizada. Otimize esta técnica de antemão com quantidades variadas de animais e solução de alvejante + NaOH.
9. Após 4 min, verifique a eficiência de quebra sob um microscópio de dissecção. Certifique-se de que a maioria dos animais adultos gravid são quebrados, e seus conteúdos internos liberados, incluindo os ovos.
10. Se os animais não estiverem abertos, bata brevemente o tubo em velocidade máxima e verifique novamente sob o microscópio.
    NOTA: Embora os ovos sejam resistentes à solução de alvejante + NaOH, eles não são impermeáveis. Os ovos não devem ser expostos à solução de alvejante + NaOH por mais tempo do que o necessário. Enrolar por muito tempo durante a etapa de quebra de animais pode levar a problemas de desenvolvimento para a prole.
11. Adicione 10 mL do tampão M9 à solução animal quebrada.
12. Centrifugar os ovos e os restos em 1.000 x g por 3 min.
13. Pipeta o supernante para longe, certificando-se de não tocar a nova pelota contendo todos os ovos na parte inferior do tubo.
14. Adicione mais 10 mL do tampão M9 e centrífuga novamente por 3 min a 1.000 x g.
15. Repita as etapas 2.13-2.14 mais duas vezes para garantir que nenhuma solução de alvejante + NaOH permaneça.
16. Após a terceira lavagem tampão M9, remova o sobrenadante e adicione 10 mL do tampão S-basal (Tabela 2).
17. Inverta o tubo para quebrar a pelota na parte inferior para suspender os ovos igualmente no tampão.
18. Coloque o tubo em um roqueiro e balance suavemente o tubo por 22 h a 20 °C para permitir que os ovos eclodam e alcancem a parada do estágio 1 (L1).
19. Após 22 h, centrifugar o tubo contendo animais L1 sincronizados por 3 min a 1000 x g.
20. Pipeta e descarte o supernatante deixando aproximadamente 1 mL de tampão no tubo.
21. Usando uma micropipette, perturbe a pelota animal para fazer uma suspensão homogênea de animais L1 no buffer restante.
22. Transfira uma única gota da suspensão homogênea dos animais L1 para uma placa NGM de 150 mm rotulada semeada com E. coli OP50.
23. Calcule a densidade animal por gota contando visualmente o número de animais L1 por gota usando um microscópio de dissecção. Uma placa de NGM de 150 mm com um gramado totalmente cultivado de E. coli OP50 pode suportar até 500 animais do estágio L1 para chegar ao estágio adulto gravid.
24. Transfira os animais L1 para seis placas de NGM de 150 mm com E. coli OP50. Certifique-se de não sobrecarregar a placa.
    NOTA: Se não estiver claro se os animais terão alimento suficiente para o desenvolvimento entre L1 e adulto árida, adicione menos animais a cada prato e use mais pratos.
25. Deixe os animais crescerem por 72 h a 20 °C até chegarem à fase adulta e começarem a colocar ovos.
26. Realize uma segunda rodada de sincronização alvejante nos animais adultos gravid sincronizados e bem alimentados.
27. Coloque os animais L1 sincronizados em dez placas de NGM de 150 mm semeadas com E. coli OP50, com aproximadamente 1.000 animais por placa.
28. Permita que os novos animais L1 sincronizados cresçam por 48 h a 20 °C até chegarem ao estágio L4.
    NOTA: O objetivo é obter uma pelota de aproximadamente 700 - 800 μL de animais L4. Muitos animais podem dificultar o uso do homogeneizador Balch; isso pode levar à tensão muscular durante o funcionamento do homogeneizador e possível vazamento das seringas devido ao aumento da pressão.

3. Preparação do homogeneizador balch

1. Prepare tampões hipotônicos e hipertônicos como mencionados na Tabela 3 e Tabela 4.
   NOTA: Os tampões hipotônicos e hipertônicos podem ser preparados com antecedência e armazenados com segurança a 4 °C.
2. Limpe o homogeneizador balch inundando a câmara de moagem com 70% de etanol, depois enxágue a câmara com água deionizada para remover o excesso de etanol.
   NOTA: Evite usar quaisquer agentes cáusticos para limpar o homogeneizador balch. A lavagem completa com etanol e água desionizada deve ser suficiente para limpá-lo.
3. Insira a bola de carboneto de 18 μm na câmara de moagem.
4. Tampe cada extremidade do cano do homogeneizador Balch e fixe as tampas com as parafusos de polegar fornecidos.
5. Prepare 5 mL de 'tampão hipotônico completo' por amostra: Adicione 5 μL de 1 M DTT (concentração final: 1 mM DTT) e 100 μL de inibidor de protease 100x, coquetel de uso único (concentração final: 2x). Mantenha o tampão no gelo.
6. Prepare 5 mL de 'tampão hipertônico completo' por amostra: Adicione 5 μL de 1 M DTT (concentração final: 1 mM DTT) e 100 μL de inibidor de protease 100x, coquetel de uso único (concentração final: 2x). Mantenha o tampão no gelo.
   NOTA: Use o tampão hipotônico completo e hipertônico no mesmo dia da preparação. Não armazene para uso posterior. Armazene 1 M DTT como alíquotas de uso único a -20 °C. Armazene o coquetel de uso único do inibidor de protease a 4 °C.
7. Encha uma seringa estéril de 2 mL com 1 mL de "tampão hipotônico completo" e lave suavemente a câmara de moagem do homogeneizador Balch. Deixe aproximadamente 500 μL de "tampão hipotônico completo" na câmara.
8. Guarde o homogeneizador lavado no gelo e deixe esfriar por 30 minutos.
   NOTA: O homogeneizador deve estar gelado antes de moer os animais. O processo de moagem pode produzir calor devido ao atrito e desnaturação das proteínas nucleares. Certifique-se de que o homogeneizador de metal está gelado para ajudar a evitar que isso aconteça. Certifique-se de evitar que qualquer água do gelo circundante entre no homogeneizador. Use duas seringas estéreis para tapar os orifícios no homogeneizador e bloquear que quaisquer líquidos não intencionais entrem na câmara de moagem.

4. Coleta de animais

NOTA: É fornecido um guia de referência rápido, marcando os principais passos para a coleta, interrupção e fracionamento dos animais (Figura 1).

1. Colete os animais L4 bem alimentados com tampão M9 em um tubo cônico de 15 mL e centrifugar os animais a 1000 x g por 3 min. Remova o sobrenatante e continue lavando a pelota animal até que o sobrenatante esteja limpo.
2. Lave os animais com 3 mL de tampão hipotônico de 4 °C e centrífuga novamente a 1000 x g por 3 min.
   NOTA: Durante a lavagem final com o tampão hipotônico de 4 °C, os animais podem grudar na lateral do tubo. Isso é normal e pode resultar em uma pequena perda de animais durante a remoção do supernante.
3. Remova o tampão hipotônico e adicione 1 mL de "tampão hipotônico completo" à pelota animal. Transfira a suspensão animal para uma nova seringa estéril de 2 mL.
   NOTA: Ao transferir os animais para a seringa usando uma micropipette, pipeta suavemente uma solução estéril de 0,1% Tween20 para revestir o interior da ponta da pipeta para reduzir o número de animais perdidos devido à aderência às paredes da ponta da pipeta.

5. Fracionamento

1. No gelo, homogeneize os animais empurrando suavemente os animais através da câmara de moagem do homogeneizador balch carregado com a bola de 7,9820 mm e em uma nova seringa estéril. Repita empurrando os animais através da câmara de moagem por 30 ciclos completos.
   NOTA: Um 'ciclo completo' é definido como o movimento completo para cima e para baixo do êmbolo de uma seringa.
   Esta etapa de moagem usa bola de 7,9820 mm (rolamento de esfera de 18 μm).
2. Após 30 ciclos, remova o máximo possível de suspensão animal do homogeneizador balch e armazene a seringa, abaixe-se em um microtubo de 1,7 mL.
3. Retire a bola de 7,9820 mm da câmara de moagem e limpe-a com água deionizada. Seque e devolva a bola ao seu tubo rotulado.
4. Insira a bola de 7,9880 mm (12 μm gap clearance) na câmara de moagem e reseal o homogeneizador.
5. Lave novamente a câmara de moagem com 1 mL de "tampão hipotônico completo".
6. Triture a suspensão por 25 ciclos completos.
7. Após 25 ciclos, remova a suspensão animal do homogeneizador Balch, transfira a suspensão para um microtubo limpo de 1,7 mL e armazene-a no gelo.
   NOTA: Desmonte e limpe o homogeneizador Balch com 70% de etanol e água desionizada. Certifique-se de devolver a bola de 7,9880 mm ao seu tubo adequado.
8. Pelota os corpos e detritos dos animais centrifugando a suspensão a 500 x g, 4 °C por 5 min.
9. Pipeta 40 μL do supernante a um tubo rotulado de "fração de entrada" e armazená-lo no gelo.
   NOTA: Escreva todos os rótulos com uma caneta à prova de álcool para evitar manchá-los mais tarde.
10. Transfira o restante do supernante para um novo tubo de 1,7 mL, tomando cuidado para evitar tocar a pelota na parte inferior do tubo e, em seguida, descarte a pelota.
11. Centrifugar o supernasce para pelotar os núcleos a 4.000 x g, 4 °C por 5 min.
12. Transfira o supernante, cuidado para não perturbar os núcleos de pelotização, para um novo tubo de 1,7 mL e rotule o tubo como "fração citosolica".
    NOTA: Centrifugar a fração citosórica ainda mais a 17.000 x g, 4 °C por 30 min para remover qualquer material insolúvel restante, e usá-lo como um controle negativo para manchas ocidentais (especificamente para proteínas nucleares).
13. Lave a pelota dos núcleos com 500 μL de "tampão hipotônico completo" e transfira a pelota para um novo tubo de 1,7 mL. Centrifugar a pelota suspensa a 4.000 x g, 4 °C por 5 min.
14. Descarte o supernasciente e adicione 500 μL de "tampão hipotônico completo" fresco à pelota nuclear e transfira a suspensão para um novo tubo de 1,7 mL. Centrifugar a amostra novamente a 4.000 x g, 4 °C por 5 min.
15. Remova o supernatante e dissolva a pelota em 40 μL de "tampão hipertônico completo". Transfira a nova suspensão nuclear para um novo tubo de 1,7 mL, rotule o tubo como "fração nuclear", e armazene-o no gelo.
16. Determine a concentração proteica das três frações usando um kit de quantificação fluorescente.
    NOTA: A quantidade de proteína nuclear adquirida a partir deste método pode variar de 1-2 μg/μL.
17. Alíquotar as frações nucleares em tubos de uso único contendo 6 μg da proteína nuclear e congelar em um banho seco de gelo e etanol. Armazene a -80 °C até que use mais.

6. Ensaio de transcrição

1. Ligue e pré-aqueça um bloco de calor a 30 °C.
2. Remova o seguinte do sistema de transcrição in vitro Extrato Nulcear: 50 mM _MgCl2, Nuclear Extract 1x Transcription Buffer, 100 mM rATP, 100 mM rCTP, 100 mM rGTP, 100 mM rUTP e o modelo de controle positivo do promotor cmv. Descongele no gelo.
   NOTA: Amplie o modelo de DNA de controle positivo usando uma polimerase de alta fidelidade e armazene-o como alíquotas de uso único normalizadas.
3. Misture e centrifufique os rNTPs descongelados antes de preparar uma solução de trabalho de 10 mM.
   NOTA: Adicione 2 μL de cada rATP, rCTP, rGTP e rUTP a 12 μL de _H2O para alcançar 10 mM de cada rNTP. Esta composição pode ser ampliada, se necessário.
4. Aliquot a mistura rNTP para tubos de uso único rotulados e armazene a -20 °C para uso futuro.
5. Em um tubo fresco de 1,5 mL rotulado "Mastermix" adicione os reagentes por reação como mencionado na Tabela 5
6. Transfira 14 μL do Mastermix para cada tubo de reação
7. Adicione 11 μL menos (volume para 5 μg do extrato nuclear) de 1x Tampão de Transcrição a cada tubo de reação.
8. Adicione 5 μg do extrato nuclear a cada tubo de reação.
9. Toque suavemente no tubo de reação para misturar o conteúdo interno e pulso centrífuga os tubos após a mistura para garantir que nenhum material de reação esteja preso à parede dos tubos.
10. Incubar as reações a 30 °C por 30 min.
11. Pare imediatamente a reação adicionando 400 μL de tampão RLT fornecido pelo kit de extração de RNA.
    NOTA: Neste momento, é seguro parar. As amostras podem ser armazenadas a -80 °C até limpar ainda mais com o kit de extração de RNA.

7. RNA limpar

1. Prepare a solução de estoque DNase I usando o conjunto DNase Livre de RNase fornecido no kit de extração de RNA. Dissolva o DNase I liofilizado em 550 μL de água sem RNase. Misture suavemente a solução. Não vórtice. Aliquot a solução DNase I em tubos de uso único de 10 μL e armazene as alíquotas a -20 °C.
2. Prepare 70% e 80% de etanol usando etanol de grau molecular e água sem RNase.
3. Mova as amostras e reagentes para um espaço de trabalho sem RNase antes de iniciar a limpeza.
4. Adicione 400 μL de 70% de etanol a cada amostra e cano suavemente para misturar bem.
5. Transfira 400 μL da amostra para uma coluna de spin de extração de RNA rotulada com um tubo de coleta de 2 mL e centrífugue a amostra a 8.500 x g para 30 s. Descarte o fluxo.
6. Repita o passo 7.5 com a amostra restante e descarte o fluxo através.
7. Adicione 350 μL de tampão RW1 (kit de extração de RNA) a cada coluna. Centrifugar as colunas a 8.500 x g para 30 s. Descarte o fluxo.
8. Adicione 70 μL de buffer RDD (kit de extração de RNA) a uma única alíquota de 10 μL da solução de estoque DNase I e misture suavemente. Não vórtice.
9. Adicione a mistura de incubação DNase I (80 μL) diretamente à membrana da coluna de giro. Incubar as colunas em temperatura ambiente por 15 minutos.
   NOTA: Certifique-se de adicionar a solução DNase I à membrana. Evite perder parte da solução para a parede da coluna ou o-ring.
10. Após 15 min, adicione 350 μL de tampão RW1 às colunas. Centrifugar para 30 s a 8.500 x g. Descarte o fluxo.
11. Coloque as colunas em novos tubos de coleta de 2 mL. Adicione 500 μL de tampão RPE (kit de extração de RNA) à coluna de giro. Centrifugar as colunas a 8.500 x g por 30 s para lavar a membrana. Descarte o fluxo.
12. Adicione 500 μL de 80% de etanol a cada coluna e centrifugar as colunas a 8.500 x g para 30 s. Descarte o fluxo.
13. Coloque as colunas em novos tubos de coleta de 2 mL. Deixando as tampas da coluna abertas, centrifugar as colunas a 17.900 x g por 5 min. Descarte o fluxo.
14. Coloque as colunas em tubos de 1,7 mL rotulados. Adicione 17 μL de água sem RNase diretamente ao centro da membrana da coluna de giro. Deixe as colunas descansarem em temperatura ambiente por 1 min. Centrifugar as colunas a 17.900 x g por 1 min.
15. Descarte a coluna e mantenha o tubo de 1,7 mL com a amostra de RNA recém-purificada.

8. Digestão de DNA

1. Pré-aqueça dois blocos de calor a 37 °C e 65 °C.
2. Adicione 2 μL de 10x de buffer de reação a cada amostra.
3. Adicione 1 μL (1 MBU) de DNase a cada amostra.
4. Coloque uma pipeta em 10 μL e pipeta a nova solução para cima e para baixo para misturar suavemente. Não vórtice.
5. Incubar as amostras de RNA a 37 °C por 30 minutos para digerir qualquer DNA restante.
6. Inativar o DNase incubando as amostras no bloco de calor a 65 °C por 10 min.
   NOTA: É seguro parar nesta etapa e armazenar o RNA a -80 °C para realizar transcrição reversa mais tarde.

9. Transcrição reversa

1. Ao programar o termociclador, adicione um passo adicional de 1 h, 37 °C antes da incubação para pré-aqueça o termociclador. Execute o programa com o 'passo pré-aquecido' enquanto prepara as amostras e deixe o termociclador chegar a 37 °C. Quando as amostras para transcrição reversa estiverem prontas, pule a etapa pré-aqueça de 37 °C e prossiga para a etapa de incubação real (Tabela 6). Se o termociclador não tiver um recurso de salto, adicione um passo de 1 min 37 °C antes da incubação. Deixe o termociclador aquecer à temperatura adequada antes de pausar o sistema e adicionar as amostras preparadas.
2. Prepare uma solução de trabalho de 10 μM de primer reversa de transcrição em _H2O sem RNase e armazene-a no gelo.
3. Descongele no gelo, tampão de 10x do kit de transcrição reversa, mix de dNTP (5 mM cada dNTP), Inibidor de RNase e transcriptase reversa.
4. Prepare um Mastermix (por reação) adicionando os constituintes mencionados na Tabela 7 em um tubo PCR limpo de 0,2 mL.
5. Alíquota de 18 μL do Mastermix em novos tubos PCR de 0,2 mL para cada amostra.
6. Adicione 2 μL do RNA tratado DNase para cada amostra em seus tubos rotulados respectivamente.
7. Incubar as amostras a 37 °C por 1 h em um termociclador pré-aquecido.
8. Mova as amostras para o -20 °C para armazenamento após transcrição reversa ou proceda diretamente para a próxima etapa.
   NOTA: É seguro parar nesta etapa; armazenar o cDNA a -20 °C para uso posterior.

10. Amplificação específica do produto

1. Descongele no gelo: cDNA, transcrição de 10 μM para a frente e primers de transcrição de 10 μM, e o PCR 2x Premix A.
   NOTA: Aliquot o PCR 2x Premix A em volumes menores para reduzir o tempo de degelo.
2. Crie um Mastermix (por reação) adicionando os constituintes mencionados na Tabela 8 em um tubo PCR limpo de 0,2 mL.
3. Alíquota 24 μL de Mastermix para cada amostra em tubos PCR de 0,2 mL rotulados limpos.
4. Adicione 1 μL de cDNA de cada amostra em seus respectivos tubos.
5. Incubar as amostras no termociclador utilizando as condições do programa mencionadas na Tabela 9
6. Após a incubação, armazene os produtos PCR a 4 °C ou -20 °C para armazenamento a longo prazo.

11. Análise de gel

1. Use tampão TAE 1x para preparar um gel que contenha 2% de w/v de agarose e 1x de mancha de gel.
2. Execute os produtos PCR a 50 V e 300 mA por 1h ou até que haja uma separação clara da banda.
3. Imagem do gel usando o programa de exposição automatizada pré-carregado no imager gel.

Representative Results

Seguindo as etapas descritas deve produzir extrato nuclear funcional (Figura 1), o desvio nas etapas de moagem ou lavagem pode levar a má atividade ou baixos rendimentos. Se o extrato nuclear C. elegans funcional for obtido, ele transcreverá a região a jusante do promotor do CMV no modelo de DNA quando adicionado ao ensaio in vitro descrito anteriormente. A transcrição resultante do RNA pode ser purificada a partir das proteínas nucleares e modelo de DNA usando métodos convencionais. Sem o DNA do modelo, a transcrição reversa e o produto PCR subsequente só podem ser o resultado do RNA transcrito pelo extrato nuclear. Os produtos PCR podem ser visualizados em um gel de agarose, a intensidade da banda de DNA pode ser indicativa da qualidade da proteína nuclear e isolamento do RNA. Uma intensidade fraca de banda pode ser causada pela inativação do extrato nuclear, seja pelo calor ou pela má preparação do buffer. Uma intensidade de banda excessivamente forte pode ser o resultado da contaminação do DNA, seja devido à má purificação do RNA ou à digestão inadequada do DNase. Isolamentos nucleares consistentes e bem sucedidos produzirão faixas de intensidades semelhantes, e tanto os controles negativos transcricionais quanto os PCR não devem ter nenhum produto PCR visível (Figura 2).

Figura 1. Um esboço de isolamento de extrato nuclear. O fluxograma descreve os principais passos para isolar o extrato nuclear de C. elegans. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. O extrato nuclear de C. elegans mantém sua atividade. A imagem em gel mostra os produtos de transcrição do extrato nuclear de larvas L4 de C. elegans usando o modelo de DNA do promotor do CMV. O isolamento bem-sucedido de proteínas nucleares ativas resultará em um produto PCR de 132 bps após transcrição in vitro, como visto nas faixas 1 e 2. O isolamento sem sucesso resultará em uma banda fraca ou na ausência de um produto PCR semelhante à faixa 3. Esta visualização da atividade de transcrição via amplificação PCR é uma maneira simples de avaliar a qualidade do isolamento da extração nuclear. O controle positivo do PCR é produzido adicionando o modelo de DNA do promotor cmv à reação do PCR, e o controle negativo está faltando o DNA do modelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Placas de mídia de crescimento de nematode
Ágar	20,4 g
Cloreto de sódio	2,8 g
Pepton bacto	2,3 g
dH2O	975 mL
Autoclave a 121 °C por 30 min
Deixe a mídia esfriar a 50 °C antes de adicionar o seguinte
1 M CaCl2 (estéril)	1 mL
1 M MgSO4 (estéril)	1 mL
10.000 unidades/mL Nystatin (estéril)	3 mL
5 mg/mL Colesterol em 95% de etanol (filtro esterilizado)	1 mL
1M KPO4 pH 6.0 (estéril)	25 mL

Mesa 1.

Tampão M9
KH2PO4	3 g
Na2HPO4	6 g
NaCl	5 g
dH2O	1.000 mL
Autoclave a 121 °C por 15 min
1 M MgSO4 (estéril)	1 mL (adicionar após a autoclavagem)
Tampão S-basal
KH2PO4	6 g
K2HPO4	1 g
NaCl	5,85 g
dH2O	1.000 mL
Autoclave a 121 °C por 15 min
Colesterol 5 mg/mL (estéril)	1 mL (adicionar após a autoclavagem)

Mesa 2.

Tampão hipotônico
Solução de Estoque	Volume	Concentração final
1 M HEPES KOH pH 7.6	7,5 mL	15 mM
1 M KCL	5,0 mL	10 mM
1 M MgCl2	2,5 mL	5 mM
0,5 M EDTA	0,1 mL	0,1 mM
1 M sacarose	175 mL	350 mM
dH2O	309,9 mL
Esterilizar filtro

Mesa 3.

Tampão hipertônico
Solução de Estoque	Volume	Concentração Final
1 M HEPES KOH pH 7.6	7,5 mL	15 mM
1 M KCL	200 mL	400 mM
1 M MgCl2	2,5 mL	5 mM
0,5 M EDTA	0,1 mL	0,1 mM
10% Tween 20	5 mL	0.10%
50% de Glicerol	100 mL	10%
dH2O	184,9 mL
Esterilizar filtro

Mesa 4.

MgCl2, 50 mM	1,5 μL
mistura rNTP, 10 mM cada	1,0 μL
DNA de modelo, 25 ng/μL	4.0 μL
H2O sem RNase	7,5 μL

Mesa 5.

Passo	Temp	Hora	Número do ciclo
Pré-aquecer	37 °C	60 min.	1x
Transcrição reversa	37 °C	60 min.	1x
Segurar	10 °C		1x

Mesa 6.

Tampão de transcrição reversa de 10x	2,0 μL
dNTP Mix (5 mM cada dNTP)	2,0 μL
Primer reverso de transcrição (10 μM)	2,0 μL
Inibidor de RNase	1,0 μL
Transcriptase reversa de sensiscript	1,0 μL
H2O sem RNase	10,0 μL

Mesa 7.

H2O sem RNase	6,25 μL
Primer forward transcription (10 μM)	2,5 μL
Primer reverso de transcrição (10 μM)	2,5 μL
PCR 2X Premix A	12,5 μL
Mistura de enzima PCR	0,25 μL

Mesa 8.

Passo	Temp	Hora	Número do ciclo
Denaturação Inicial	92 °C	60 s	1x
Desnaturar	92 °C	30 s
Temperar	59 °C	30 s	35x
Extensão	72 °C	30 s
Segurar	10 °C		1x

Mesa 9.

Discussion

C. elegans é um organismo modelo atraente para estudar o sistema de transcrição eucariótica devido à sua manutenção de baixo custo e à facilidade de manipulação genética. Aqui é descrito um protocolo para o isolamento consistente do extrato nuclear funcionalmente ativo de L4 C. elegans . Embora este protocolo tenha se concentrado em visualizar a atividade de transcrição, o cDNA produzido após a transcrição pode ser quantificado usando o RT-qPCR para obter uma medição mais precisa da atividade de ^{transcrição8}. Este método de isolar proteínas nucleares de C. elegans pode ajudar a expandir o estudo da máquina de transcrição eucariótica. Uma vez que C. elegans não é uma cultura de células em um prato ou uma colônia de leveduras, mas sim um animal de livre-roaming, isolando e pesquisando seu extrato nuclear pode dar uma visão mais clara de como o maquinário transcricional pode mudar ao longo do tempo ou em vários ambientes. Isso permite que os pesquisadores aproveitem c. elegans baixo custo e resiliência. C. elegans, ao contrário de outros organismos modelo ou culturas celulares, é muito mais indulgente quando a contaminação bacteriana ou de levedura aparece. Uma população de C. elegans pode ser facilmente limpa da contaminação usando protocolos estabelecidos, economizando tempo e esforço quando a contaminação ^ocorre9. No geral, o uso de extrato nuclear de C. elegans para ensaios bioquímicos pode ser uma opção mais acessível e flexível em comparação com a compra de extrato nuclear de um fornecedor ou lidar com organismos modelos menos tolerantes.

Embora este protocolo seja relativamente simples, ainda existem medidas críticas que requerem atenção especial para o isolamento bem sucedido do extrato nuclear. É importante que durante a preparação dos tampões hipotônicos e hipertônicos completos, as duas soluções sejam claramente rotuladas e separadas. Se os buffers forem trocados em qualquer momento durante o isolamento, isso pode levar à inativação das proteínas nucleares ou ao fracionamento ruim das proteínas citossóicas das proteínas nucleares. Proteínas nucleares isoladas também devem, se necessário, ser diluídas em tampão hipertônico, não água ou qualquer outra solução. A alta concentração de sal ajuda a preservar a atividade das proteínas, e uma solução hipotônica pode matar essa ^atividade10.

Outro desafio que pode surgir durante a porção de moagem deste protocolo vem de detritos aderindo à superfície das bolas de tungstênio. Embora seja declarado que as bolas devem ser lavadas e secas após cada ciclo de moagem, o material se ligará à superfície lisa das bolas. Este material geralmente aparece como anéis cor de ferrugem ao redor da circunferência das bolas e é espesso o suficiente para bloquear a distância entre a bola e a parede da câmara de moagem. Esse bloqueio é perceptível à medida que se torna cada vez mais difícil empurrar os animais através do moedor, o que pode eventualmente levar a lesões musculares ou ruptura da seringa. Se as bolas de tungstênio começarem a mostrar descoloração, mergulhe-as em água quente por 5 minutos e limpe a superfície com uma nova almofada de limpeza. Evite usar soluções ácidas ou básicas de limpeza. Depois de polir suavemente, as bolas de tungstênio devem retornar ao seu brilho original, e será visivelmente mais fácil moer amostras.

Este protocolo foi projetado para isolar todo o extrato nuclear de C. elegans. Não foi testado para uso em outros organismos modelo. O extrato nuclear de outros organismos pode exigir diferentes buffers, e o promotor do CMV pode não ser suficiente para conduzir a transcrição em outras amostras não-mamíferas. O extrato nuclear coletado usando este método também não é específico de tecido ou célula; qualquer atividade de transcrição medida usando este método olha para os animais como um todo que pode esconder as mudanças sutis entre os tecidos.

Os usos futuros deste protocolo podem estar medindo a máquina de reparação de DNA ou replicação de C. elegans após danos no DNA. A fração citosolítica coletada durante o processo de isolamento poderia ser utilizada para medir a quantidade de proteínas solúveis e quantificar a atividade dessas proteínas de forma semelhante à transcrição de medição.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010