Isolement de l’extrait nucléaire actif de Caenorhabditis elegans et reconstitution pour la transcription in vitro

Summary

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour isoler l’extrait nucléaire actif de C. elegans au stade larvaire 4 et visualiser l’activité de transcription dans un système in vitro .

Abstract

Caenorhabditis elegans est un système modèle important pour la recherche biologique depuis son introduction en 1963. Cependant, C. elegans n’a pas été pleinement utilisé dans l’étude biochimique des réactions biologiques utilisant ses extraits nucléaires tels que la transcription in vitro et la réplication de l’ADN. Un obstacle important à l’utilisation de C. elegans dans les études biochimiques est de perturber l’épaisse cuticule externe du nématode sans sacrifier l’activité de l’extrait nucléaire. Bien que plusieurs méthodes soient utilisées pour casser la cuticule, telles que l’homogénéisation ou la sonication de Dounce, elles conduisent souvent à une instabilité des protéines. Il n’existe pas de protocole établi pour isoler les protéines nucléaires actives de la larve ou de C. elegans adulte pour les réactions in vitro . Ici, le protocole décrit en détail l’homogénéisation de C. elegans larvaire de stade 4 à l’aide d’un homogénéisateur Balch. L’homogénéisateur Balch utilise la pression pour forcer lentement les animaux à traverser un espace étroit brisant la cuticule dans le processus. La conception uniforme et l’usinage précis de l’homogénéisateur Balch permettent un meulage cohérent des animaux entre les expériences. Le fractionnement de l’homogénat obtenu à partir de l’homogénéisateur Balch donne un extrait nucléaire fonctionnellement actif qui peut être utilisé dans une méthode in vitro pour tester l’activité de transcription de C. elegans.

Introduction

Le petit nématode libre Caenorhabditis elegans est un organisme modèle simple mais puissant pour répondre à un large éventail de questions biologiques. Depuis son introduction en 1963, les nématodes ont été inestimables pour répondre aux questions de neurobiologie, de métabolisme, de vieillissement, de développement, d’immunité et de ^génétique1. Certaines des nombreuses caractéristiques de l’animal qui en font un organisme modèle idéal comprennent le temps de génération court, l’efficacité de l’interférence ARN, le corps transparent et les cartes complètes de sa lignée cellulaire et de son système nerveux.

Bien que les contributions du nématode à la science soient vastes, elles ont été sous-utilisées pour élucider le système de transcription eucaryote, la plupart de notre compréhension de ces mécanismes provenant d’études utilisant l’extrait nucléaire de levure, de mouche des fruits et de culture cellulaire de ^mammifères2. Le plus grand obstacle qui dissuade les chercheurs d’extraire de l’extrait nucléaire fonctionnel est la cuticule externe dure du nématode. Cet exosquelette comprend des collagènes réticulés, des cuticlines, des glycoprotéines et des lipides, ce qui rend C. elegans du stade larvaire à l’âge adulte résistant à l’extraction des protéines par des forces chimiques ou ^mécaniques3. Un système de transcription in vitro utilisant l’extrait nucléaire de C. elegans a déjà été développé mais n’a pas été largement adopté en raison de la portée limitée du système, et l’utilisation de l’homogénéisateur Dounce pour la préparation de l’extrait pourrait entraîner une instabilité des protéines4,5.

Contrairement au protocole précédent pour l’isolation des extraits nucléaires qui utilisait un homogénéisateur Dounce pour casser C. elegans, ce protocole utilise un homogénéisateur Balch. L’homogénéisateur Balch se compose de deux composants principaux: une bille en carbure de tungstène et un bloc en acier inoxydable avec un canal percé d’une extrémité à l’autre. L’homogénéisateur Balch est chargé avec la bille de carbure de tungstène et bouché de chaque côté pour sceller la chambre de broyage. Les seringues peuvent être chargées sur les deux orifices verticaux menant à la chambre de broyage. Lorsque le matériau est passé d’une seringue à l’autre à travers la chambre de broyage, la pression des seringues force le matériau à travers un espace étroit entre la bille et la paroi de la chambre. Cette pression lente et constante brise le matériau jusqu’à ce qu’il atteigne une taille constante capable de traverser facilement l’espace étroit. Forcer C. elegans à traverser l’étroit espace via une pression constante mais douce brise les animaux, libérant leur contenu dans le tampon environnant. Changer la taille des billes resserre encore l’écart, brisant les cellules nouvellement libérées et libérant les noyaux dans le tampon. De multiples cas de centrifugation séparent les noyaux du reste des débris cellulaires, ce qui permet la collecte d’un extrait nucléaire propre. L’homogénéisateur Balch est préféré à l’homogénéisateur Dounce pour plusieurs raisons : le système peut traiter un grand nombre d’animaux, ce qui permet d’extraire une grande quantité de protéines actives en une seule tentative ; l’usinage précis des billes et du bloc d’acier permet un meulage cohérent entre plusieurs échantillons; le bloc d’acier lourd agit comme un dissipateur de chaleur, éloignant uniformément la chaleur de la chambre de broyage, empêchant ainsi la dénaturation.

Après isolement, l’activité transcriptionnelle de l’extrait nucléaire doit être vérifiée avant d’être utilisée dans des expériences biochimiques. Traditionnellement, l’activité de transcription était mesurée à l’aide de nucléotides radiomarqués pour suivre et visualiser l’ARN nouvellement synthétisé. Cependant, l’étiquetage radioactif peut être fastidieux car il nécessite des précautions lors de l’utilisation et de l’élimination6. Les progrès technologiques permettent aux chercheurs d’aujourd’hui d’utiliser des méthodes beaucoup moins nocives ou gênantes pour mesurer même de petites quantités d’ARN à l’aide de techniques telles que la PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR)⁷. Ici, le protocole décrit une méthode pour isoler l’extrait nucléaire actif du stade larvaire 4 (L4) C. elegans et visualiser l’activité de transcription dans un système in vitro.

Protocol

1. Préparations médiatiques

1. Préparez des plaques de gélose stériles en lysogénie (LB) et des milieux liquides en suivant les instructions du fabricant.
2. Streak Escherichia coli (E. coli) souche OP50 sur une plaque de gélose LB. Incuber les bactéries à 37 °C pendant la nuit.
3. Conserver la plaque de stries e. coli OP50 à 4 °C après l’incubation. La plaque E. coli OP50 peut être conservée en toute sécurité à 4 °C pendant 2 semaines si elle est enveloppée dans un parafilm pour éviter la perte d’humidité.
4. Préparer 2 L de milieux de croissance des nématodes (NGM) à l’aide de la recette du tableau 1.
   REMARQUE: Nystatin est facultatif. La nystatine aide à empêcher la moisissure et d’autres contaminants fongiques de se développer sur les plaques NGM. Les grandes plaques de 150 mm de diamètre ont plus de chances d’attraper des spores fongiques lorsque le couvercle est retiré pour verser et ensemencer E. coli OP50. Nystatin peut être acheté prémélangé dans une solution stérile auprès de vendeurs à 10 000 unités / mL ou peut être acheté sous forme de poudre stérile et mélangé avec de l’eau stérile. La nystatine ne peut pas être autoclavée, ni stérilisée efficacement. L’attention portée à la technique aseptique est cruciale lors du mélange d’une solution de nystatine en laboratoire. Autoclave 1 M _CaCl2, 1 M _KPO4 pH 6,0 et 1 M MgSO4 à 121 °C pendant 15 min. Filtrer le cholestérol à travers un filtre de 0,22 μm après avoir été dissous dans de l’éthanol à 95%.
5. Après avoir ajouté les réactifs au support, versez du NGM dans quarante boîtes de Petri de 150 mm. Chaque plat de 150 mm nécessite 50 mL pour être rempli. Laissez les plaques NGM refroidir pendant la nuit à température ambiante.
6. Inoculer deux tubes coniques de 50 mL contenant 25 mL de LB stérile avec E. coli OP50 de la plaque de traînée précédente. Incuber le bouillon à 37 °C pendant 24 h dans un incubateur à agitation maintenu à 200 tr/min.
   REMARQUE: Pour plus de cohérence, inoculez les deux tubes avec la même colonie unique à partir de la plaque de traînée. Si cela s’avère difficile, inoculer 5 mL de LB stérile avec une seule colonie dans un tube conique de 50 mL et incuber la culture pendant 16 h à 37 °C dans un incubateur à agitation maintenu à 200 tr/min la veille de la préparation des plaques NGM. Conserver la culture liquide fraîche à 4 °C jusqu’à deux jours. Inoculer les deux 25 mL de bouillon avec 25 μL de culture liquide et incuber dans les mêmes conditions que celles mentionnées ci-dessus.
7. Plantez des plaques de NGM fraîches avec 1 mL de culture liquide fraîche d’E. coli OP50 et étalez-les uniformément à l’aide d’un épandeur stérilisé à la flamme sur la surface de la plaque de manière aseptique pour créer une grande pelouse bactérienne qui recouvre la majorité de la plaque, en prenant soin de ne pas propager les bactéries d’un bord à l’autre. Laissez l’E. coli OP50 pousser à température ambiante pendant 72 à 96 h ou jusqu’à ce qu’une pelouse visiblement épaisse apparaisse.
   REMARQUE: Après 24 h, déplacez les plaques de NGM fraîchement ensemencées dans un récipient couvert pour réduire la perte d’humidité et prolonger la durée de vie des plaques.

2. Préparations animales et synchronisation de l’eau de Javel

1. Transférer 5 C. elegans adultes gravides de type sauvage bien nourris dans chacune des 10 assiettes de NGM fraîches ensemencées avec E. coli OP50, pour un total de 50 animaux.
2. Laissez les animaux pondre des œufs. Laissez la progéniture croître à 20 °C jusqu’à ce qu’elle atteigne le stade adulte gravide.
3. Utilisez 15 mL de tampon M9 (tableau 2) pour recueillir les nouveaux adultes gravides de type sauvage bien nourris dans les dix plaques d’entretien et transférer les animaux dans un tube conique étiqueté de 15 mL.
4. Centrifugez les animaux à 1 000 x g pendant 3 min pour granuler tous les animaux au fond du tube.
5. Dans un tube conique séparé étiqueté de 15 mL, mélanger 2 mL d’eau de Javel avec 5 mL de NaOH 1 N pour la synchronisation de l’eau de Javel. Vortex la solution à bien mélanger.
   REMARQUE: Utilisez la solution d’eau de Javel + NaOH le jour même où elle est préparée pour être efficace.
6. Retirez doucement le surnageant des animaux centrifugés à l’aide d’une pipette stérile de 10 mL. Essayez d’enlever autant de tampon M9 que possible pour améliorer la rupture des animaux.
7. Ajouter 500 μL de la solution d’eau de Javel + NaOH à la pastille animale et démarrer une minuterie pendant 4 min.
8. Soit à la main, soit à l’aide d’une bascule, secouez doucement le tube pour casser complètement la pastille animale et laissez les animaux se déplacer librement dans la solution d’eau de Javel + NaOH. Continuez à balancer le tube pendant toute la durée de 4 minutes.
   REMARQUE: La quantité d’eau de Javel + solution de NaOH nécessaire peut varier en fonction de la taille de la pastille animale synchronisée. Optimisez cette technique au préalable avec des quantités variables d’animaux et de solution d’eau de Javel + NaOH.
9. Après 4 min, vérifiez l’efficacité de rupture sous un microscope à dissection. Assurez-vous que la majorité des animaux adultes gravides sont brisés et que leur contenu interne est libéré, y compris les œufs.
10. Si les animaux ne sont pas fendus, vortex brièvement le tube à la vitesse maximale, puis vérifiez à nouveau au microscope.
    REMARQUE: Bien que les œufs soient résistants à la solution d’eau de Javel + NaOH, ils ne sont pas imperméables. Les œufs ne doivent pas être exposés à la solution d’eau de Javel + NaOH plus longtemps que nécessaire. Le blocage trop longtemps pendant l’étape de rupture de l’animal peut entraîner des problèmes de développement pour la progéniture.
11. Ajouter 10 mL du tampon M9 à la solution animale brisée.
12. Centrifuger les œufs et les restes à 1 000 x g pendant 3 min.
13. Pipettez le surnageant, en veillant à ne pas toucher la nouvelle pastille contenant tous les œufs au fond du tube.
14. Ajouter encore 10 mL de tampon M9 et centrifuger à nouveau pendant 3 min à 1 000 x g.
15. Répétez les étapes 2.13-2.14 deux fois de plus pour vous assurer qu’il ne reste aucune solution d’eau de Javel + NaOH.
16. Après le troisième lavage du tampon M9, retirer le surnageant et ajouter 10 mL du tampon basal S (tableau 2).
17. Inverser le tube pour casser la pastille au fond pour suspendre les œufs également dans le tampon.
18. Placez le tube sur une bascule et secouez doucement le tube pendant 22 h à 20 °C pour permettre aux œufs d’éclore et d’atteindre le stade larvaire 1 (L1) d’arrêt.
19. Après 22 h, centrifuger le tube contenant des animaux L1 synchronisés pendant 3 min à 1000 x g.
20. Pipette et jeter le surnageant en laissant environ 1 mL de tampon dans le tube.
21. À l’aide d’une micropipette, dérangez la pastille animale pour obtenir une suspension homogène d’animaux L1 dans le tampon restant.
22. Transférer une seule gouttelette de la suspension homogène d’animaux L1 dans une plaque NGM étiquetée de 150 mm ensemencée avec E. coli OP50.
23. Calculez la densité animale par goutte en comptant visuellement le nombre d’animaux L1 par goutte à l’aide d’un microscope à dissection. Une plaque NGM de 150 mm avec une pelouse entièrement développée d’E. coli OP50 peut supporter jusqu’à 500 animaux du stade L1 pour atteindre le stade adulte gravide.
24. Transférer les animaux L1 sur six plaques NGM de 150 mm avec E. coli OP50. Assurez-vous de ne pas surcharger la plaque.
    REMARQUE: S’il n’est pas clair si les animaux auront suffisamment de nourriture pour le développement entre L1 et l’adulte gravide, ajoutez moins d’animaux à chaque assiette et utilisez plus d’assiettes.
25. Laissez les animaux grandir pendant 72 h à 20 °C jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade adulte gravide et commencent à pondre.
26. Effectuez une deuxième série de synchronisation de l’eau de Javel sur les animaux adultes gravides de type sauvage synchronisés et bien nourris.
27. Placer les animaux L1 synchronisés sur dix plaques NGM de 150 mm ensemencées avec E. coli OP50, avec environ 1 000 animaux par plaque.
28. Laissez les nouveaux animaux L1 synchronisés grandir pendant 48 h à 20 °C jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade L4.
    REMARQUE: L’objectif est d’obtenir une pastille d’environ 700 à 800 μL d’animaux L4. Trop d’animaux peuvent rendre difficile l’utilisation de l’homogénéisateur Balch; cela peut entraîner une tension musculaire lors de l’utilisation de l’homogénéisateur et une fuite possible des seringues en raison de l’augmentation de la pression.

3. Préparation de l’homogénéisateur Balch

1. Préparer les tampons hypotoniques et hypertoniques comme mentionné dans les tableaux 3 et 4.
   REMARQUE: Les tampons hypotoniques et hypertoniques peuvent être préparés à l’avance et stockés en toute sécurité à 4 ° C.
2. Nettoyez l’homogénéisateur Balch en inondant la chambre de broyage avec 70% d’éthanol, puis rincez la chambre à l’eau désionisée pour éliminer l’excès d’éthanol.
   REMARQUE: Évitez d’utiliser des agents caustiques pour nettoyer l’homogénéisateur Balch. Un rinçage complet à l’éthanol et à l’eau désionisée devrait suffire à le nettoyer.
3. Insérez la bille de carbure de tungstène de 7,9820 mm (jeu d’espace de 18 μm) dans la chambre de broyage.
4. Boucher chaque extrémité du canon de l’homogénéisateur Balch et fixer les bouchons avec les vis à pouce fournies.
5. Préparer 5 mL de « tampon hypotonique complet » par échantillon : Ajouter 5 μL de 1 M TNT (concentration finale : 1 mM TNT) et 100 μL d’inhibiteur de protéase 100x, cocktail à usage unique (concentration finale : 2x). Gardez le tampon sur la glace.
6. Préparer 5 mL de « tampon hypertonique complet » par échantillon : Ajouter 5 μL de 1 M TNT (concentration finale : 1 mM TNT) et 100 μL d’inhibiteur de protéase 100x, cocktail à usage unique (concentration finale : 2x). Gardez le tampon sur la glace.
   REMARQUE: Utilisez le tampon hypotonique et hypertonique complet le jour même de la préparation. Ne le conservez pas pour une utilisation ultérieure. Conserver 1 M TNT sous forme d’aliquotes à usage unique à -20 °C. Conserver le cocktail à usage unique inhibiteur de protéase à 4 °C.
7. Remplissez une seringue stérile de 2 mL avec 1 mL de « tampon hypotonique complet » et rincez doucement la chambre de broyage de l’homogénéisateur Balch. Laissez environ 500 μL de « tampon hypotonique complet » dans la chambre.
8. Conservez l’homogénéisateur rincé sur de la glace et laissez-le refroidir pendant 30 min.
   REMARQUE: L’homogénéisateur doit être glacé avant de broyer les animaux. Le processus de broyage peut produire de la chaleur due au frottement et dénaturer les protéines nucléaires. Assurez-vous que l’homogénéisateur métallique est glacé pour éviter que cela ne se produise. Assurez-vous d’éviter que l’eau de la glace environnante ne pénètre dans l’homogénéisateur. Utilisez deux seringues stériles pour boucher les trous de l’homogénéisateur et empêcher tout liquide involontaire de pénétrer dans la chambre de broyage.

4. Collecte d’animaux

REMARQUE : Un guide de référence rapide est fourni, indiquant les principales étapes de la collecte, de la perturbation et du fractionnement des animaux (figure 1).

1. Recueillir les animaux L4 bien nourris avec un tampon M9 dans un tube conique de 15 mL et centrifuger les animaux à 1000 x g pendant 3 min. Retirez le surnageant et continuez à laver la pastille animale jusqu’à ce que le surnageant soit clair.
2. Laver les animaux avec 3 mL de tampon hypotonique à 4 °C et centrifuger à nouveau à 1000 x g pendant 3 min.
   REMARQUE: Lors du lavage final avec le tampon hypotonique à 4 °C, les animaux peuvent coller sur le côté du tube. Ceci est normal et peut entraîner une petite perte d’animaux lors de l’enlèvement du surnageant.
3. Retirez le tampon hypotonique et ajoutez 1 mL de « tampon hypotonique complet » à la pastille animale. Transférer la suspension animale dans une nouvelle seringue stérile de 2 mL.
   REMARQUE: Lors du transfert des animaux à la seringue à l’aide d’une micropipette, pipettez doucement une solution stérile de Tween20 à 0,1% pour recouvrir l’intérieur de la pointe de la pipette afin de réduire le nombre d’animaux perdus en raison de l’adhérence aux parois de la pointe de la pipette.

5. Fractionnement

1. Sur la glace, homogénéisez les animaux en les poussant doucement à travers la chambre de broyage de l’homogénéisateur Balch chargé de la bille de 7,9820 mm et dans une nouvelle seringue stérile. Répétez en poussant les animaux à travers la chambre de broyage pendant 30 cycles complets.
   REMARQUE: Un « cycle complet » est défini comme le mouvement complet de haut en bas du piston d’une seringue.
   Cette étape de meulage utilise une bille de 7,9820 mm (roulement à billes de 18 μm).
2. Après 30 cycles, retirez autant que possible la suspension animale de l’homogénéisateur Balch et rangez la seringue dans un microtube de 1,7 mL.
3. Retirez la bille de 7,9820 mm de la chambre de broyage et nettoyez-la à l’eau désionisée. Sécher et remettre la balle dans son tube étiqueté.
4. Insérez la bille de 7,9880 mm (jeu d’espace de 12 μm) dans la chambre de broyage et refermez l’homogénéisateur.
5. Rincer à nouveau la chambre de broyage avec 1 mL de « tampon hypotonique complet » glacé.
6. Broyer la suspension pendant 25 cycles complets.
7. Après 25 cycles, retirez la suspension animale de l’homogénéisateur Balch, transférez la suspension dans un microtube propre de 1,7 mL et stockez-la sur de la glace.
   REMARQUE: Démontez et nettoyez l’homogénéisateur Balch avec 70% d’éthanol et d’eau désionisée. Assurez-vous de retourner la bille de 7,9880 mm dans son tube approprié.
8. Pelleter les corps et les débris des animaux en centrifugant la suspension à 500 x g, 4 °C pendant 5 min.
9. Pipette 40 μL du surnageant dans un tube étiqueté « fraction d’entrée » et le stocker sur de la glace.
   REMARQUE: Écrivez toutes les étiquettes avec un stylo anti-alcool pour éviter de les enduire plus tard.
10. Transférer le surnageant restant dans un nouveau tube de 1,7 mL, en prenant soin d’éviter de toucher le granulé au fond du tube, puis jeter le granulé.
11. Centrifuger le surnageant pour granuler les noyaux à 4 000 x g, 4 °C pendant 5 min.
12. Transférer le surnageant, en prenant soin de ne pas perturber les noyaux en granulés, dans un nouveau tube de 1,7 mL et étiqueter le tube comme « fraction cytosolique ».
    REMARQUE: Centrifuger la fraction cytosolique à 17 000 x g, 4 °C pendant 30 min pour éliminer tout matériau insoluble restant, et l’utiliser comme témoin négatif pour les transferts occidentaux (en particulier pour les protéines nucléaires).
13. Lavez la pastille de noyau avec 500 μL de « tampon hypotonique complet » et transférez la pastille dans un nouveau tube de 1,7 mL. Centrifuger la pastille en suspension à 4 000 x g, 4 °C pendant 5 min.
14. Jeter le surnageant et ajouter 500 μL de « tampon hypotonique complet » frais à la pastille nucléaire et transférer la suspension dans un nouveau tube de 1,7 mL. Centrifuger à nouveau l’échantillon à 4 000 x g, 4 °C pendant 5 min.
15. Retirer le surnageant et dissoudre la pastille dans 40 μL de « tampon hypertonique complet ». Transférez la nouvelle suspension nucléaire dans un nouveau tube de 1,7 mL, étiquetez le tube comme « fraction nucléaire » et stockez-le sur de la glace.
16. Déterminez la concentration en protéines des trois fractions à l’aide d’un kit de quantification fluorescente.
    REMARQUE: La quantité de protéine nucléaire acquise à partir de cette méthode peut varier de 1 à 2 μg / μL.
17. Aliquoter les fractions nucléaires dans des tubes à usage unique contenant 6 μg de protéine nucléaire et les congeler dans un bain de glace sèche et d’éthanol. Conserver à -80 °C jusqu’à nouvel usage.

6. Essai de transcription

1. Allumez et préchauffez un bloc chauffant à 30 °C.
2. Retirez les éléments suivants du système de transcription in vitro Nulcear Extract : 50 mM _MgCl2, Nuclear Extract 1x Transcription Buffer, 100 mM rATP, 100 mM rCTP, 100 mM rGTP, 100 mM rUTP et le modèle de contrôle positif du promoteur CMV. Dégel sur glace.
   REMARQUE: Amplifier le gabarit d’ADN témoin positif à l’aide d’une polymérase haute fidélité et le stocker sous forme d’aliquotes normalisées à usage unique.
3. Mélanger et centrifuger les GNR décongelés avant de préparer une solution de travail de 10 mM.
   REMARQUE: Ajouter 2 μL de chaque rATP, rCTP, rGTP et rUTP à 12 μL de _H2O pour obtenir 10 mM de chaque rNTP. Cette composition peut être augmentée si nécessaire.
4. Aliquoter le mélange de rNTP dans des tubes à usage unique étiquetés et le conserver à -20 °C pour une utilisation future.
5. Dans un tube frais de 1,5 mL portant la mention « Mastermix », ajouter les réactifs par réaction, comme indiqué dans le tableau 5.
6. Transférer 14 μL du Mastermix dans chaque tube de réaction
7. Ajouter 11 μL moins (volume pour 5 μg de l’extrait nucléaire) de 1x tampon de transcription à chaque tube de réaction.
8. Ajouter 5 μg d’extrait nucléaire à chaque tube de réaction.
9. Tapotez doucement le tube de réaction pour mélanger le contenu à l’intérieur et centrifugez les tubes après le mélange pour vous assurer qu’aucun matériau de réaction n’est collé à la paroi des tubes.
10. Incuber les réactions à 30 °C pendant 30 min.
11. Arrêtez immédiatement la réaction en ajoutant 400 μL de tampon RLT fourni par le kit d’extraction d’ARN.
    REMARQUE: À ce stade, il est prudent de s’arrêter. Les échantillons peuvent être conservés à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient nettoyés avec le kit d’extraction d’ARN.

7. Nettoyage de l’ARN

1. Préparez la solution mère DNase I à l’aide de l’ensemble DNase sans RNase fourni dans le kit d’extraction d’ARN. Dissoudre la DNase I lyophilisée dans 550 μL d’eau sans RNase. Mélanger doucement la solution. Ne pas vortex . Aliquoter la solution de DNase I dans des tubes à usage unique de 10 μL et conserver les aliquotes à -20 °C.
2. Préparez 70 % et 80 % d’éthanol à l’aide d’éthanol de qualité moléculaire et d’eau sans RNase.
3. Déplacez les échantillons et les réactifs vers un espace de travail sans RNase avant de commencer le nettoyage.
4. Ajouter 400 μL d’éthanol à 70 % à chaque échantillon et pipeter doucement pour bien mélanger.
5. Transférer 400 μL de l’échantillon dans une colonne de spin d’extraction d’ARN marquée avec un tube de prélèvement de 2 mL et centrifuger l’échantillon à 8 500 x g pendant 30 s. Jetez le flux.
6. Répétez l’étape 7.5 avec l’échantillon restant et jetez le flux à travers.
7. Ajoutez 350 μL de tampon RW1 (kit d’extraction d’ARN) à chaque colonne. Centrifuger les colonnes à 8 500 x g pendant 30 s. Jetez le flux.
8. Ajouter 70 μL de tampon RDD (kit d’extraction d’ARN) à une seule aliquote de 10 μL de solution mère de DNase I et mélanger doucement. Ne pas vortex.
9. Ajouter le mélange d’incubation de la DNase I (80 μL) directement à la membrane de la colonne de spin. Incuber les colonnes à température ambiante pendant 15 min.
   REMARQUE: Assurez-vous d’ajouter la solution DNase I à la membrane. Évitez de perdre une partie de la solution sur le mur de la colonne ou le joint torique.
10. Après 15 min, ajoutez 350 μL de tampon RW1 aux colonnes. Centrifugeuse pendant 30 s à 8 500 x g. Jetez le flux.
11. Placez les colonnes dans de nouveaux tubes de collecte de 2 mL. Ajoutez 500 μL de tampon RPE (kit d’extraction d’ARN) à la colonne de spin. Centrifugez les colonnes à 8 500 x g pendant 30 s pour laver la membrane. Jetez le flux.
12. Ajouter 500 μL d’éthanol à 80 % à chaque colonne et centrifuger les colonnes à 8 500 x g pendant 30 s. Jetez le flux.
13. Placez les colonnes dans de nouveaux tubes de collecte de 2 mL. En laissant les couvercles des colonnes ouverts, centrifugez les colonnes à 17 900 x g pendant 5 min. Jetez le flux.
14. Placez les colonnes dans des tubes étiquetés de 1,7 mL. Ajouter 17 μL d’eau sans RNase directement au centre de la membrane de la colonne de spin. Laissez les colonnes reposer à température ambiante pendant 1 min. Centrifuger les colonnes à 17 900 x g pendant 1 min.
15. Jetez la colonne et conservez le tube de 1,7 mL avec l’échantillon d’ARN fraîchement purifié.

8. Digestion de l’ADN

1. Préchauffer deux blocs de chaleur à 37 °C et 65 °C.
2. Ajouter 2 μL de tampon de réaction 10x à chaque échantillon.
3. Ajouter 1 μL (1 MBU) de DNase à chaque échantillon.
4. Réglez une pipette à 10 μL et pipetez la nouvelle solution de haut en bas pour mélanger doucement. Ne pas vortex.
5. Incuber les échantillons d’ARN à 37 °C pendant 30 min pour digérer l’ADN restant.
6. Inactiver la DNase en incubant les échantillons sur le bloc thermique à 65 °C pendant 10 min.
   REMARQUE: Il est prudent de s’arrêter à cette étape et de stocker l’ARN à -80 ° C pour effectuer une transcription inverse plus tard.

9. Transcription inverse

1. Lors de la programmation du thermocycleur, ajoutez une étape supplémentaire de 1 h et 37 °C avant l’incubation pour préchauffer le thermocycleur. Exécutez le programme avec l’étape de préchauffage lors de la préparation des échantillons et laissez le thermocycleur atteindre 37 ° C. Lorsque les échantillons pour la transcription inverse sont prêts, sautez l’étape de préchauffage à 37 °C et passez à l’étape d’incubation proprement dite (tableau 6). Si le thermocycleur n’a pas de fonction de saut, ajoutez une étape de 1 min 37 °C avant l’incubation. Laissez le thermocycleur chauffer à la bonne température avant de mettre le système en pause et d’ajouter les échantillons préparés.
2. Préparez une solution de travail de 10 μM d’amorce inverse de transcription dans du _H2O sans RNase et stockez-la sur de la glace.
3. Dégel sur glace, tampon 10x du kit de transcription inverse, mélange dNTP (5 mM chaque dNTP), inhibiteur de RNase et transcriptase inverse.
4. Préparer un Mastermix (par réaction) en ajoutant les constituants mentionnés au tableau 7 dans un tube PCR propre de 0,2 mL.
5. Aliquote 18 μL du Mastermix dans de nouveaux tubes PCR de 0,2 mL pour chaque échantillon.
6. Ajouter 2 μL de l’ARN traité à la DNase pour chaque échantillon dans leurs tubes marqués respectivement.
7. Incuber les échantillons à 37 °C pendant 1 h dans un thermocycleur préchauffé.
8. Déplacez les échantillons à -20 °C pour le stockage après la transcription inverse ou passez directement à l’étape suivante.
   REMARQUE: Il est prudent de s’arrêter à cette étape; stocker l’ADNc à -20 °C pour une utilisation ultérieure.

10. Amplification spécifique du produit

1. Dégel sur glace : ADNc, amorces de transcription avant de 10 μM et amorces de transcription inverse de 10 μM, et prémélange PCR 2x A.
   REMARQUE: Aliquote le prémélange PCR 2x A en plus petits volumes pour réduire le temps de dégel.
2. Créer un Mastermix (par réaction) en ajoutant les constituants mentionnés dans le tableau 8 dans un tube PCR propre de 0,2 mL.
3. Aliquote 24 μL de Mastermix pour chaque échantillon dans des tubes PCR de 0,2 mL étiquetés propres.
4. Ajouter 1 μL d’ADNc de chaque échantillon dans leurs tubes respectifs.
5. Incuber les échantillons dans le thermocycleur en utilisant les conditions de programme mentionnées dans le tableau 9
6. Après l’incubation, conservez les produits PCR à 4 °C ou -20 °C pour un stockage à plus long terme.

11. Analyse des gels

1. Utilisez 1x tampon TAE pour préparer un gel qui contient 2% p / v d’agarose et 1x tache de gel.
2. Exécutez les produits PCR à 50 V et 300 mA pendant 1 h ou jusqu’à ce qu’il y ait une séparation de bande claire.
3. Imagez le gel à l’aide du programme d’exposition automatisé préchargé dans l’imageur de gel.

Representative Results

En suivant les étapes décrites devrait donner un extrait nucléaire fonctionnel (Figure 1), un écart dans les étapes de broyage ou de lavage peut entraîner une mauvaise activité ou de faibles rendements. Si l’extrait nucléaire fonctionnel de C. elegans est obtenu, il transcrira la région en aval du promoteur du CMV sur le gabarit d’ADN lorsqu’il sera ajouté au test in vitro décrit précédemment. Le transcrit d’ARN résultant peut être purifié à partir des protéines nucléaires et du modèle d’ADN à l’aide de méthodes conventionnelles. Sans l’ADN modèle, la transcription inverse et le produit PCR ultérieur ne peuvent être que le résultat de l’ARN transcrit par l’extrait nucléaire. Les produits pcR peuvent être visualisés sur un gel d’agarose, l’intensité de la bande d’ADN peut être indicative de la qualité de la protéine nucléaire et de l’isolement de l’ARN. Une faible intensité de bande peut être causée par l’inactivation de l’extrait nucléaire soit par la chaleur, soit par une mauvaise préparation du tampon. Une intensité de bande excessivement forte peut être le résultat d’une contamination de l’ADN due à une mauvaise purification de l’ARN ou à une mauvaise digestion de la DNase. Des isolements nucléaires cohérents et réussis produiront des bandes d’intensités similaires, et les témoins négatifs transcriptionnels et PCR ne devraient pas avoir de produit PCR visible (Figure 2).

Graphique 1. Un aperçu de l’isolement des extraits nucléaires. L’organigramme décrit les principales étapes de l’isolement de l’extrait nucléaire de C. elegans. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 2. L’extrait nucléaire de C. elegans conserve son activité. L’image du gel montre les produits de transcription de l’extrait nucléaire des larves de C. elegans L4 à l’aide du modèle d’ADN promoteur du CMV. L’isolement réussi des protéines nucléaires actives se traduira par un produit pcR de 132 pb après transcription in vitro , comme on le voit dans les voies 1 et 2. Une isolation infructueuse entraînera une bande faible ou l’absence d’un produit pcrif similaire à la voie 3. Cette visualisation de l’activité de transcription via l’amplification PCR est un moyen simple d’évaluer la qualité de l’isolement d’extraction nucléaire. Le contrôle PCR positif est produit en ajoutant le modèle d’ADN promoteur CMV à la réaction PCR, et le contrôle négatif manque de l’ADN modèle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Plaques de milieux de croissance des nématodes
Agar-agar	20,4 g
Chlorure de sodium	2,8 g
Bacto peptone	2,3 g
dH2O	975 mL
Autoclave à 121 °C pendant 30 min
Laisser refroidir le média à 50 °C avant d’ajouter ce qui suit
1 m CaCl2 (stérile)	1 mL
1 m mgSO4 (stérile)	1 mL
10 000 unités/mL de nystatine (stérile)	3 mL
5 mg/mL de cholestérol dans de l’éthanol à 95 % (filtre stérilisé)	1 mL
1M KPO4 pH 6,0 (stérile)	25 mL

Tableau 1.

Tampon M9
KH2PO4	3 g
Na2HPO4	6 g
NaCl	5 g
dH2O	1 000 mL
Autoclave à 121 °C pendant 15 min
1 m mgSO4 (stérile)	1 mL (ajouter après autoclavage)
Tampon S-basal
KH2PO4	6 g
K2HPO4	1 g
NaCl	5,85 g
dH2O	1 000 mL
Autoclave à 121 °C pendant 15 min
Cholestérol 5 mg/mL (stérile)	1 mL (ajouter après autoclavage)

Tableau 2.

Tampon hypotonique
Stock Solution	Volume	Concentration finale
1 M HEPES KOH pH 7,6	7,5 mL	15 mM
1 M KCl	5,0 mL	10 mM
1 M MgCl2	2,5 mL	5 mM
0,5 m EDTA	0,1 mL	0,1 mM
1 M Saccharose	175 mL	350 mM
dH2O	309,9 mL
Stériliser le filtre

Tableau 3.

Tampon hypertonique
Stock Solution	Volume	Concentration finale
1 M HEPES KOH pH 7,6	7,5 mL	15 mM
1 M KCl	200 mL	400 mM
1 M MgCl2	2,5 mL	5 mM
0,5 m EDTA	0,1 mL	0,1 mM
10% Préadolescent 20	5 mL	0.10%
50% Glycérol	100 mL	10%
dH2O	184,9 mL
Stériliser le filtre

Tableau 4.

MgCl2, 50 mM	1,5 μL
Mélange rNTP, 10 mM chacun	1,0 μL
MODÈLE D’ADN, 25 ng/μL	4,0 μL
H2O sans RNase	7,5 μL

Tableau 5.

Pas	Intérimaire	Heure	Numéro de cycle
Préchauffer	37 °C	60 min	1x
Transcription inverse	37 °C	60 min	1x
Tenir	10 °C		1x

Tableau 6.

10x Tampon de transcription inverse	2,0 μL
dNTP Mix (5 mM par dNTP)	2,0 μL
Amorce inverse de transcription (10 μM)	2,0 μL
Inhibiteur de la RNase	1,0 μL
Transcription inverse Sensiscript	1,0 μL
H2O sans RNase	10,0 μL

Tableau 7.

H2O sans RNase	6,25 μL
Amorce de transcription directe (10 μM)	2,5 μL
Amorce inverse de transcription (10 μM)	2,5 μL
PCR 2X Prémélange A	12,5 μL
Mélange d’enzymes PCR	0,25 μL

Tableau 8.

Pas	Intérimaire	Heure	Numéro de cycle
Dénature initiale	92 °C	60 s	1x
Dénaturer	92 °C	30 s
Recuire	59 °C	30 s	35x
Extension	72 °C	30 s
Tenir	10 °C		1x

Tableau 9.

Discussion

C. elegans est un organisme modèle attrayant pour étudier le système de transcription eucaryote en raison de son faible coût d’entretien et de la facilité de manipulation génétique. Ici, un protocole pour l’isolement cohérent de l’extrait nucléaire fonctionnellement actif de L4 C. elegans est décrit. Bien que ce protocole se soit concentré sur la visualisation de l’activité de transcription, l’ADNc produit post-transcriptionnellement peut être quantifié à l’aide de la RT-qPCR pour obtenir une mesure plus précise de l’activité de ^{transcription8}. Cette méthode d’isolement des protéines nucléaires de C. elegans peut aider à élargir l’étude de la machinerie de transcription eucaryote. Étant donné que C. elegans n’est pas une culture de cellules dans une boîte ou une colonie de levure, mais plutôt un animal en liberté, l’isolement et la recherche de son extrait nucléaire peuvent donner un aperçu plus clair de la façon dont la machinerie transcriptionnelle peut changer au fil du temps ou dans divers environnements. Cela permet aux chercheurs de tirer parti du faible coût et de la résilience de C. elegans . C. elegans, contrairement à d’autres organismes modèles ou cultures cellulaires, est beaucoup plus indulgent lorsque la contamination bactérienne ou de levure apparaît. Une population de C. elegans peut être facilement nettoyée de la contamination à l’aide de protocoles établis, ce qui permet d’économiser du temps et des efforts lorsque la contamination se ^produit9. Dans l’ensemble, l’utilisation d’extrait nucléaire de C. elegans pour des essais biochimiques peut être une option plus abordable et plus flexible que l’achat d’extrait nucléaire auprès d’un fournisseur ou le traitement d’organismes modèles moins indulgents.

Bien que ce protocole soit relativement simple, il existe encore des étapes critiques qui nécessitent une attention particulière pour l’isolement réussi de l’extrait nucléaire. Il est important que lors de la préparation des tampons hypotoniques et hypertoniques complets, les deux solutions soient clairement étiquetées et séparées. Si les tampons sont commutés à n’importe quel moment pendant l’isolement, cela pourrait entraîner l’inactivation des protéines nucléaires ou un mauvais fractionnement des protéines cytosoliques des protéines nucléaires. Les protéines nucléaires isolées doivent également, si nécessaire, être diluées dans un tampon hypertonique, et non dans de l’eau ou toute autre solution. La forte concentration en sel aide à préserver l’activité des protéines, et une solution hypotonique peut tuer cette ^activité10.

Un autre défi qui peut survenir pendant la partie broyage de ce protocole provient des débris adhérant à la surface des billes de tungstène. Bien qu’il soit indiqué que les billes doivent être lavées et séchées après chaque cycle de broyage, le matériau se fixera à la surface lisse des billes. Ce matériau apparaît généralement sous forme d’anneaux de couleur rouille autour de la circonférence des billes et est suffisamment épais pour bloquer l’espace entre la bille et la paroi de la chambre de broyage. Ce blocage est perceptible car il devient de plus en plus difficile de pousser les animaux à travers le broyeur, ce qui peut éventuellement entraîner des blessures musculaires ou une rupture de la seringue. Si les boules de tungstène commencent à montrer une décoloration, faites-les tremper dans de l’eau chaude pendant 5 minutes, puis nettoyez la surface avec un nouveau tampon à récurer. Évitez d’utiliser des solutions de nettoyage acides ou basiques. Après un polissage en douceur, les billes de tungstène devraient retrouver leur éclat d’origine et il sera nettement plus facile de broyer les échantillons.

Ce protocole est conçu pour isoler l’extrait nucléaire entier de C. elegans. Il n’a pas été testé pour une utilisation sur d’autres organismes modèles. L’extrait nucléaire d’autres organismes peut nécessiter différents tampons, et le promoteur du CMV peut ne pas être suffisant pour conduire la transcription dans d’autres échantillons non mammifères. L’extrait nucléaire recueilli à l’aide de cette méthode n’est pas non plus spécifique aux tissus ou aux cellules; toute activité de transcription mesurée à l’aide de cette méthode examine les animaux dans leur ensemble, ce qui peut cacher les changements subtils entre les tissus.

Les utilisations futures de ce protocole pourraient être la mesure de la machinerie de réparation ou de réplication de l’ADN de C. elegans après des dommages à l’ADN. La fraction cytosolique recueillie au cours du processus d’isolement pourrait être utilisée pour mesurer la quantité de protéines solubles et quantifier l’activité de ces protéines d’une manière similaire à la mesure de la transcription.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010