Summary
Denne protokol beskriver en hurtig og enkel metode til fremstilling af bakteriel lysat til cellefri genekspression ved hjælp af en konstrueret stamme af Escherichia coli og kræver kun standard laboratorieudstyr.
Abstract
Cellefri genekspression giver kraften i biologi uden komplikationer af en levende organisme. Selv om mange sådanne genekspressionssystemer findes, de fleste er ret dyre at købe og / eller kræver særligt udstyr og fint finpudset ekspertise til at producere effektivt. Denne protokol beskriver en metode til fremstilling af bakteriecellefri lysat, der understøtter høje niveauer af genekspression, kun ved hjælp af standard laboratorieudstyr og kræver minimal behandling. Metoden bruger en Escherichia coli stamme producerer en endolysin, der ikke påvirker væksten, men som effektivt lyses en høstet celle pellet efter en simpel fryse-optø cyklus. Den eneste yderligere behandling, der kræves, er en kort inkubation efterfulgt af centrifugering for at rydde autolysatet af cellulære snavs. Dynamiske genkredsløb kan opnås gennem heterologt udtryk for ClpX protease i cellerne før høst. En E. coli stamme mangler lacZ genet kan bruges til høj følsomhed, cellefri biosensing applikationer ved hjælp af en colorimetric eller fluorescerende udlæsning. Hele protokollen kræver så få som 8-9 timer, med kun 1-2 timers praktisk arbejde fra podning til færdiggørelse. Ved at reducere omkostningerne og tiden til at opnå cellefri lysat, bør denne metode øge overkommeligheden af celle-fri genekspression for forskellige applikationer.
Introduction
Genekspression i cellefrie lysater har flere fordele ved at bruge levende celler1,2,3,4. Lysater kan let ændres biokemisk og anvendes under forhold, der kan være skadelige for eller umulige at opnå i levende celler. Genekspression kredsløb behøver ikke at kæmpe eller konkurrere med vært biologiske processer, og afprøvning af nye genetiske kredsløb er så simpelt som at tilføje DNA. Af disse grunde har cellefri genekspression fundet forskellige anvendelser, fra biosensorer5,6 til hurtigt prototyper syntetiske genkredsløb7,8 til udvikling af kunstige celler9. De fleste cellefri genekspression anvender cellulære lysater, der er blevet stærkt behandlet, hvilket generelt kræver lange og komplekse protokoller, specialiseret udstyr og /eller følsomme trin, der kan føre til betydelig variation mellem brugere og batches10,11.
Dette papir beskriver en enkel og effektiv metode til fremstilling af cellefri lysat, der kræver minimal behandling og ekspertise (Figur 1A)12. Metoden er afhængig af E. coli celler, der er konstrueret til at lyse efter en simpel fryse-optø cyklus. Cellerne udtrykker en endolysin fra phage lambda, der nedbryder cellevæggen. Efterhånden som cellerne vokser, forbliver denne endolysin i cytoplasmaet, der er afsondret fra cellevæggen. Men en simpel fryse-optø cyklus forstyrrer cytoplasmisk membran, frigive endolysin i periferien, hvor det nedbryder cellevæggen, hvilket resulterer i hurtig celle lysis. Protokollen kan afsluttes med kun et par timers praktisk arbejde og kræver kun en fryser, en centrifuge, der er i stand til 30.000 × g (for optimale resultater; lavere hastigheder kan bruges med mere omhu for ikke at forstyrre pellet), en vortex mixer og en simpel bufferløsning. Funktionelt lysat kan endda produceres ved frysetørring af cellerne og rehydrere dem in situ. Denne metode producerer dog lysater med lavere aktivitet, formodentlig på grund af de resterende cellerester.
Lysaterne er meget aktive for cellefri genekspression, og de kan forbedres på forskellige måder afhængigt af slutanvendelsen. Hastigheden af proteinsyntese kan øges yderligere ved at koncentrere lysatet ved hjælp af standard spin koncentratorer. Lineært DNA kan beskyttes mod nedbrydning ved at tilsætte renset GamS-protein. Proteinforringelse, der er nødvendig for mere komplekse kredsløbsdynamikker såsom svingning, kan opnås ved at co-udtrykke en ClpX hexamer i den autolysatproducerende stamme13. Endelig aktiveres LacZ-baserede visuelle udlæsninger ved hjælp af en autolysatstamme, der mangler lacZ. Samlet set producerer denne metode meget aktiv cellefri lysat, der er egnet til en bred vifte af applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered medier og buffere.
- Forbered 2xYTPG medium.
- Bland 62 g 2xYT pulver, 5,99 g kaliumphosphat monobasisk, 13,93 g kaliumphosphat dibasic og deioniseret vand til 2 L.
- Autoklave på flydende cyklus med en eksponeringstid på 30 min14.
- Til 400 mL 2xYTP-medier fra 1.1.2 tilsættes 7,2 g D-glukose (dextrose) og blandes, indtil det er opløst.
- Filtersterilaliseres gennem et 0,2 μm filter.
- Forbered S30A buffer.
- Bland Tris-HCl (pH 7,7, 50 mM endelig koncentration), kaliumglutamat (60 mM endelig) og magnesiumglutamat (14 mM endelig).
- Juster pH-skærmen til 7,7 ved hjælp af 10 M KOH.
- Forbered løsning 1 (se tabel 1).
- Resuspend 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonsyre (HEPES) i 2 ml vand.
- Juster pH-skærmen til 8.0 ved hjælp af KOH.
- Tilføj alle andre komponenter fra tabel 1.
- Juster pH-skærmen til 7,6 ved hjælp af 10 M KOH. Filtersteriliseres.
- Klargør 2,5x forblandingsopløsning (se tabel 2).
- Bland alle komponenterne i tabel 2.
- Juster pH-skærmen til 7,5 ved hjælp af KOH.
- Aliquot og fryse ved -80 °C.
BEMÆRK: En 20 μL-reaktion bruger 8,9 μL forblanding.
2. Forbered celler.
- Træk autolyserecellerne over på LB-agarplader, der indeholder 50 μg/mL ampicillin, ved hjælp af en podende løkke, og knyt ved 37 °C (se note 1).
- Vælg en enkelt koloni i en starterkultur af LB/ampicillin medium ved hjælp af en pipetspids og vokse ved 37 °C natten over.
- Pod 400 mL 2xYTPG medium indeholdende 50 μg/mL ampicillin med 400 μL starterkultur og vokser ved 37 °C i en 1 L Erlenmeyer kolbe, ryster ved 300 o/min.
- Mål med jævne mellemrum kulturens optiske tæthed ved 600 nm (OD600)ved hjælp af et spektrofotometer til at læse et optisk cuvette med en 1 cm stilængde. Når OD600 overstiger 1, skal du begynde at fortynde kulturen 5 gange før målinger for at sikre, at målingerne forbliver inden for det lineære område af et typisk laboratoriespektrofotometer. Fortsæt med at dyrke cellerne, indtil den 5-dobbelte fortyndede kultur når OD600 af 0,3 (svarende til en kultur OD600 af 1,5).
3. Forbered lysatet.
- Forbered S30A buffer suppleret med 2 mM dithiothreitol (DTT). Bland 3 mL S30A buffer med 6 μL DTT lageropløsning ved 1 M. Placer på is til brug i trin 3.7.
- Høst cellerne ved centrifugering ved 1800 × g i 15 min ved stuetemperatur.
- Kassér supernatanten ved at hælde den af og bruge en pipet til at fjerne eventuel resterende væske.
- Resuspend pellet i 45 mL af kulde (4-10 °C) S30A buffer ved hjælp af en vortex mixer.
- Veje et tomt 50 mL centrifugerør, overfør cellerne ind i det, og gentag trin 3.2-3.3 for at vaske cellerne.
- Afvej pelleten, der trækker vægten af et tomt 50 mL rør. Sørg for omhyggeligt at aspirere eventuelle resterende supernatant for at sikre en nøjagtig måling af pellet vægt.
BEMÆRK: Et typisk udbytte er ~ 1,3 g celle pellet fra 400 mL af produktionskulturen. - Tilsæt 2 volumener kold S30A buffer suppleret med 2 mM dithiothreitol, dvs 2 mL buffer for hver 1 g celle pellet, og resuspend cellerne ved kraftigt vortex blanding.
- Frys cellerne. Anbring det 50 mL-rør, der indeholder cellerne, i en fryser på -20 °C eller -80 °C, indtil pelleten er grundigt frosset.
BEMÆRK: Frysetrinnet er et godt stoppested for dagen. - Optø cellerne i et vandbad med stuetemperatur.
- Vortex kraftigt i 2-3 min.
- Inkuberes ved 37 °C i 45 min med rysten ved 300 omdrejninger.
- Prøven ryddes ved centrifugering i gennemsigtige centrifugerør ved 30.000 × g i 45 min ved 4 °C.
BEMÆRK: Hvis der ikke er en centrifuge på 30.000 x g, er centrifuge i 45 min ved 21.000 × g, og vær forsigtig i trin 3.13, da pellet vil være mindre kompakt. - Overfør forsigtigt supernatanten til et nyt rør med en pipet, så du undgår at forstyrre pellet så meget som muligt. Hvis det overførte supernatant er forurenet med materiale fra pelleten, gentages det foregående trin.
- Supernatanten overføres til 1,5 mL centrifugerør og centrifuge igen ved 21.000 × g (eller den maksimale hastighed på en bordpladecentrifuge) i 5 min.
- Aliquot den ryddede autolysate i de ønskede mængder, omhyggeligt undgå eventuelle resterende pellet, og fryse ved -80 °C eller brug straks.
BEMÆRK: En enkelt 20 μL-reaktion bruger 8 μL autolysat.
4. Cellefri genekspression
BEMÆRK: Autolysatet er nu klar til det ønskede slutforbrug. Følgende er et eksempel på standardprotokol for cellefri genekspression.
- For en 20 μL-reaktion blandes på is 8 μL autolysat og 8,9 μL forblanding. Se NOTE i slutningen af protokolafsnittet om optimering af magnesiumglutamatkoncentrationer og PEG 8000-koncentrationer.
- Tilsættes DNA (f.eks. pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 til en endelig koncentration på 8 nM), andre reagenser og vand til 20 μL.
- Anbring reaktionen i en 384-brønd mikroplade, og mål fluorescensenskurset og/eller slutpunkterne ved hjælp af en pladelæser. For grønt fluorescerende protein (GFP) skal du bruge en excitationsbølgelængde på 485 nm og en emissionsbølgelængde på 520 nm.
5. Protokolændringer
BEMÆRK: Følgende ændringer af protokollen gør det muligt at betjene andre programmer.
- Cellefri genekspression ved hjælp af lineære DNA-skabeloner
- Udfør trinene i punkt 4 og supplere reaktionen med 2,2 μM renset GamS-protein (udtrykt og renset som beskrevet12) før tilsætning af det lineære DNA.
- Cellefri genekspression, der inkorporerer proteinforringelse
- I trin 2.1 skal du bruge autolysatceller, der indeholder plasmid pACYC-FLAG-dN6-His (se materialetabellen). I alle vækstmedier omfatter derudover 34 μg/mL chloramphenicol.
- I trin 2.3, omfatter 40 μM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) i vækstmediet for at fremkalde udtryk fra plasmid.
- Gentag trin 3.2-3.4 (vask) yderligere to gange (for i alt tre vaske) for at sikre fuldstændig fjernelse af chloramphenicol, som er en oversættelseshæmmer. For de to første vaske (trin 3.4) erstatteS S30A-bufferen med fosfatbufferet saltvand (pH 7.4).
- I trin 4.2 suppleres med yderligere 3 mM ATP (tilsættes fra en lageropløsning på 100 mM ATP i vand, pH 7.2) og 4,5 mM magnesiumglutamat (ved hjælp af en 1 M lageropløsning i vand) (endelige koncentrationer) for at kompensere for høj ATP-brug af ClpXP samt kelation af magnesium ved den ekstra ATP.
- Cellefri genekspression ved hjælp af LacZ-baserede udlæsninger (herunder farvemetrisk)
- I trin 2.1 skal du bruge autolysatceller, der ikke indbygget udtrykker LacZ (se materialetabellen).
- Alternativt kan du forberede lysatet direkte fra frysetørrede celler.
- Udfør alle trin fra 1,1 til 3,7.
- Bland 8 μL celleaffjedring med 8,9 μL forblanding.
- Tilsæt plasmid DNA (hvis det ønskes), andre brugerdefinerede reagenser og vand for at nå et sidste volumen på 20 μL.
- Overfør reaktionen på en 384-brønd mikroplade og frysetørre den.
BEMÆRK: Frysetørrede prøver kan opbevares i op til en uge og muligvis længere. - For at begynde reaktionen skal du rehydrere den med 18 μL deioniseret vand suppleret med ønsket DNA eller andre reagenser.
- Følg fluorescensdynamikken i en pladelæser.
NOTE 1: Autolysatceller er designet til at lyse på en fryse-optø cyklus, så det er især vigtigt at bruge kryobeskyttende, når du laver frosne lagre. Vi frøs lagre i 24% wt/vol glycerol og lagrede dem ved -80 °C.
NOTE 2: Magnesiumioner og PEG 8000 er afgørende for lysatydelsen. Basen 2.5x premix, baseret på tidligere offentliggjorte data, indeholder 6 mM magnesium glutamat og 4,8% wt /vol PEG 8000, som bliver 2,4 mM og 1,9%, henholdsvis i den endelige reaktion. Den autolysate udarbejdet med protokollen her typisk klarer sig bedst med en ekstra 5 mM Mg-glutamat og 1,5% PEG 8000 i den endelige reaktion. Dette kan dog optimeres i intervallet af yderligere 0-10 mM Mg glutamat og yderligere 0-3% PEG 8000 (sammenlignet med basisforblandingen). For at forberede forblandingen med de anbefalede yderligere 5 mM Mg-glutamat og 1,5% PEG 8000 (endelige koncentrationer) blandes 380 μL forblanding med 4,75 μL magnesiumglutamat ved 1 M og 36,1 μL PEG 8000 ved 40% vægt/volumen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative resultater kan observeres ved at bruge autolysat til at udtrykke GFP fra en konstituerende udtrykke plasmid, her pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, og registrering af et tidsforløb af GFP fluorescens i en pladelæser (Figur 1B). En fortyndingsserie af plasmid-DNA fandt stærkt udtryk selv ved 1 nM DNA. Sammenlignet med et kommercielt tilgængeligt lysat kan autolysat producere et større samlet udbytte og opnå en større maksimal produktionsrate, beregnet som tidsderivater for GFP-tidskurset (Figur 1C, D). Yderligere resultater ved hjælp af denne metode finder du i Didovyk et al.12. Denne protokol har relativt få fejlpunkter. der kan dog opnås suboptimale resultater, hvis autolysat ikke er tilstrækkeligt renset for cellerester. Optimale resultater kan også kræve optimering af koncentrationerne af PEG-8000 og Mg2+ for hvert parti lysat (se note 2).
Figur 1: Repræsentative resultater. (A) Visuel repræsentation af protokollen. (B) Eksempel tidsforløb af GFP udtryk fra pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 i en fryse-optø autolysat. Maksimal GFP-produktion (C) og maksimal produktionshastighed (D) af autolysat fremstillet i 2 forskellige laboratorier af 2 forskellige forskere ved hjælp af en 30.000 x g centrifuge (blå og orange) eller en 20.000 x g centrifuge (lilla), sammenlignet med et kommercielt referencelyt (orange, MYtxtl-70-960M fra MYcroarray). Alle fejllinjer betyder absolut fejl af to tekniske replikeringer. Dette tal er blevet ændret fra 12. Copyright 2017 American Chemical Society. Forkortelse: GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Løsning 1: Tilsæt vand til 4 mL i alt | |
| Navn | Vægt (mg) |
| 3-PGA | 386.4 |
| ATP | 52 |
| lejr | 13.8 |
| CoA | 11.2 |
| CTP | 28.4 |
| Folinsyre | 1.9 |
| GTP | 47.6 |
| HEPES | 667.2 |
| NAD | 12.3 |
| Spermidin | 8.1 |
| tRNAs | 11.2 |
| UTP | 29.5 |
Tabel 1: Løsning 1. Komponenter af opløsning 1.
| 2,5 x forblanding | |
| Reagens | Volumen (μL) |
| Aminosyreblanding, der indeholder 24 mM hver, undtagen leucin, som ligger ved 20 mM | 2500 |
| dithiothreitol (DTT) ved 100 mM | 100 |
| Magnesium glutamat på 1 M | 25 |
| PEG-8000 ved 40% wt/vol | 500 |
| Kaliumglutamat ved 2 M | 303 |
| Løsning 1 (se tabel 1) | 714.3 |
Tabel 2: Forblanding. Komponenter i forblandingsopløsningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den protokol, der er beskrevet her, giver meget aktivt bakterielt lysat til cellefri genekspression. Nøglen er at bruge celler, der bærer plasmid pAD-LyseR, som udtrykker lambda phage endolysin kytosolically. Disse celler er potentiated at lyse sig selv på permeabilization af den indre membran, så endolysin adgang til cellevæggen, som metoden opnår gennem en simpel fryse-optø cyklus. Fordi cellerne effektivt lyse sig selv, produktet kaldes autolysate. Efter at cellerne har tændt, er de eneste tilbageværende trin inkubation og centrifugering for at rydde autolysat af cellulære snavs.
Sammenlignet med andre metoder til fremstilling af bakteriel lysat er denne tilgang særlig enkel og hurtig, men den ofrer ikke lysatets kvalitet. Protokollen kan udfyldes i 8-9 timer efter podning af produktionskulturen, med kun 1-2 timers praktisk arbejde. Det eneste anbefalede stykke udstyr, der ikke er helt standard for molekylærbiologiske laboratorier, er en centrifuge, der kan opnå 30.000 × g. Autolysat af sammenlignelig kvalitet kan dog produceres selv med en centrifuge med lavere hastighed (Figur 1C, D); brugeren ville bare nødt til at være mere forsigtig med at fjerne lysatet fra pellet, måske efterlader lidt mere væske for at sikre rene prøver. Denne enkelhed er ikke blot et spørgsmål om bekvemmelighed; mindre komplicerede protokoller har tendens til at give mere reproducerbare resultater, med mindre variation, når de udføres med forskellige hænder. Ændringen, der præsenteres i trin 5.4, hvor cellerne frysetørres sammen med alle andre reagenser, præsenterer en endnu enklere protokol, dog med reducerede proteinproduktionsudbytter. Især i denne ændring springes centrifugeringstrinnene for at rydde lysatet af cellulære snavs over, hvilket yderligere reducerer behandlingsarbejdsen; De resterende snavs reducerer dog udtrykket fralysatet 12.
I de senere år er mange tilgange til fremstilling af cellefri lysate blevet offentliggjort, sammenfattet for nylig af Cole et al.15. Disse undersøgelser har undersøgt forskellige strategier for celletype, vækstbetingelser, lysis metoder, og efterbehandling. De fleste andre metoder til lysis har krævet specialiseret udstyr såsom en fransk presse, homogenizer, perle tæppebanker, eller sonicator. Fujiwara og Doi udeladt dette udstyr til fordel for en fryse-tø cyklus svarende til den, der er beskrevet her, bortset fra at de gjorde cellerne modtagelige for lysis ved at behandle dem med lysozyme snarere end at udtrykke en endolysin16. Selv om dette er omtrent lige så enkel en protokol som den, der er beskrevet her, skal de lysozymbehandlede celler vaskes, mens de er i deres skrøbelige tilstand uden at forstyrre dem for tidligt, hvilket kan kræve eksperimentel finesse og indføre en kilde til variabilitet.
Ud over lysat kræver cellefri genekspression en forblandingsopløsning, der indeholder energikilder, RNA og proteinmonomerer og andre små molekyler. Forblandingsopskriften blev beskrevet og optimeret tidligere17- med et par modifikationer. Den forblanding, der blev anvendt her, indeholdt ca. 4 gange højere koncentrationer af aminosyrer samt yderligere magnesiumglutamat og PEG 8000 svarende til de endelige reaktionskoncentrationer på henholdsvis 7,5 mM og 3,5% vægt /volumen. Optimale resultater kan kræve justering af koncentrationerne af supplerende magnesiumglutamat og PEG 8000 for hvert nyt parti lysat, selv om ovenstående koncentrationer konsekvent gav gode resultater (se note 2). Unikke applikationer kan kræve reoptimizing disse koncentrationer, for eksempel ved brug af ClpX-suppleret lysat13.
En standard E. coli-stamme til fremstilling af cellefri lysat er BL21-Gold (DE3). Et derivat af disse celler, der indeholder autolyse plasmid pAD-LyseR er blevet deponeret i en stamme og plasmid repository (se tabellen af materialer). Også tilgængelige er et derivat mangler genomisk lacZ til dramatisk at reducere baggrunden for kredsløb, der bruger LacZ-baserede output og et udtryk plasmid pAD-GamS, der skal anvendes til rensning af GamS protein, der kan beskytte lineære DNA fra nedbrydning. Disse cellestammer og plasmider bør være nyttige til en række anvendelser i cellefri genekspression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J.H. er medstifter af GenCirq Inc, der fokuserer på kræftbehandling. Han sidder i bestyrelsen og har egenkapital i GenCirq.
Acknowledgments
Forfatterne takker Zachary Sun og Richard Murray (California Institute of Technology) for venligt at give plasmid P_araBAD-gamS, og Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) for venligt at give en højhastighedskøling centrifuge. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health og fra ARO MURI-programmet og blev delvist støttet af det førende initiativ for fremragende unge forskere, MEXT, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
References
- Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
- Pardee, K., et al.
- Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
- Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard". ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
- Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
- Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
